Derzeit wird die Anwendung von Erythropoietin (Epo) zur Neuroprotektion in präklinischen und klinischen Studien intensiv untersucht. Für die Neuroprotektion ist die Regulation des Erythropoietin-Rezeptors (EpoR) in neuronalen Zellen von hoher Relevanz. In dieser Arbeit wurden die transkriptionellen Mechanismen der EpoR-Regulation in humanen Neuroblastom-Zellen SH-SY5Y mit neuronalem Phänotyp untersucht. Da der hämatopoietische Transkriptionsfaktor GATA-1 die EpoR-Transkription in erythroiden Vorläuferzellen in Kooperation mit Sp1 stimuliert, wurde die Rolle der in neuronalen Vorläuferzellen exprimierten GATA-Transkriptionsfaktoren bei der EpoR-Expression untersucht. Es wurde eine in vitro Bindung von GATA-2, -3 und -4 an zwei Motive in der EpoR 5’-flankierenden Region (-274/-271; -47/-44) nachgewiesen. In Reportergen-Assays zeigten diese Genabschnitte eine bis zu 4,8-fache Aktivitätssteigerung bei Überexpression von GATA-2, -3 oder -4. Die endogene EpoR mRNA-Expression wurde dadurch aber nicht erhöht. Hypoxie (2% O2, 3 d) erhöhte die EpoR-Expression signifikant (1,8-fach, p < 0,01), wobei überexprimierte GATA-Transkriptionsfaktoren diesen Effekt nicht weiter steigerten. Die Gabe von Epo (5 U/ml, 3 d) hatte weder unter Normoxie noch unter Hypoxie einen Einfluss auf die EpoR-Expression. Die Promotoraktivität der Reporterkonstrukte wurde durch Mutation der GATA-Bindungsstellen nicht verändert, jedoch bei mutierter Sp1-Bindungsstelle inhibiert. Ein Fragment der 5’-flankierenden Region (-449/-285), das ein Cluster von Bindungsstellen für unterschiedliche Transkriptionsfaktoren enthält, zeigte die stärkste Promotoraktivität und rekrutierte offenbar die RNA-Polymerase II. In unserem Modell spielen die GATA-Faktoren keine direkte Rolle für die EpoR-Genregulation in neuronalen Vorläuferzellen. Die EpoR mRNA-Expression wird eher durch einen Komplex aus verschiedenen Transkriptionsfaktoren reguliert, der an eine 5’ des minimalen Promotors liegende DNA-Region zu binden scheint. / Since the use of erythropoietin (Epo) as neuroprotective agent is currently intensively studied in preclinical and clinical trials, regulatory mechanisms of the erythropoietin receptor (EpoR) in neuronal cells are of particular interest. In this study, the transcriptional mechanisms of EpoR regulation were analyzed in human neuroblastoma-derived SH-SY5Y cells, which exhibit a neuronal phenotype. Considering that the hematopoietic transcription factor GATA-1 stimulates EpoR transcription in cooperation with Sp1 in erythroid progenitors, the role of other GATA family members expressed in neuronal precursor cells were studied. In vitro, GATA-2, -3 and -4 were found to bind to two consensus motifs within the EpoR 5’-flanking region (-274/-271 and -47/-44). In reporter gene assays, these regions showed an up to 4.8-fold induction if GATA-2, -3 or -4 were overexpressed. However, forced expression of GATA-2, -3 and -4 did not enhance endogenous EpoR mRNA expression. Under hypoxia (2% O2, 3 d), EpoR expression was significantly upregulated in SH-SY5Y cells (1.8-fold, p < 0.01), but not further increased by the additional overexpression of the GATA factors. Incubation of the SH-SY5Y cells with recombinant Epo (5 U/ml, 3 d) had no effect on the EpoR expression under normoxia or hypoxia. The promoter activities of the reporter constructs were not changed by mutations in the GATA sites, but abolished by mutations of Sp1 binding sites. A fragment (-449/-285) of the 5’-flanking region that contains a cluster of binding sites for various transcription factors showed strongest promoter activity and was obviously directing the recruitment of RNA polymerase II. We conclude that GATA factors do not play a major role in regulating EpoR expression in our model for neuronal precursor cells. EpoR mRNA expression is rather regulated by a complex of various transcription factors, which may bind to a region upstream of the minimal promoter.

Das Neuroblastom, ein embryonaler Tumor des sympathischen Nervensystems, stellt durch seine außerordentliche Heterogenität klinisch eine große Herausforderung dar. Ziel dieser Arbeit war es, die Expression der GATA-Transkriptionsfaktoren GATA-2, -3, -4 und des Kofaktors friend-of-GATA (FOG)-2 im Neuroblastom und im sich entwickelnden sympathischen Nervensystem zu vergleichen. Davon ausgehend wurde die Rolle der Proteine im Neuroblastom näher untersucht. Es wurde gezeigt, dass alle vier Proteine in humanem Neuroblastom-Gewebe sowie in einer humanen Neuroblastom-Zelllinie (SH-SY5Y) exprimiert werden und nukleär lokalisiert sind. Lediglich Gata-4 wurde jedoch im sich entwickelnden sympathischen Nervensystem der Maus nicht exprimiert. Die Einzigartigkeit von GATA-4 bestätigte sich auch durch Microarray-Analysen von 251 Neuroblastom-Proben. Während GATA-2, -3 und FOG-2 signifikant mit Markern für eine günstige Prognose assoziiert wurden, korrelierte die GATA-4 Expression mit MYCN-Amplifikation. Interessanterweise führte die lentivirale Überexpression von GATA-4 zu einer Proliferationsinhibition humaner Neuroblastomzellen (SH-SY5Y und SH-EP) sowie zu der verstärkten Expression von DPYSL3 und Bcl-2. Zudem konnte durch das Differenzierungsagens Retinsäure die GATA-4 Expression induziert werden. So wurde in dieser Arbeit bestätigt, dass normale Entwicklungsprozesse in prognostisch günstigen Neuroblastomen intakt sind. Umgekehrt sind in Tumoren mit schlechterer Prognose diese Prozesse gestört. Die in vitro verlangsamte Proliferation sowie die Induktion von Bcl-2 nach Überexpression von GATA-4 könnten in vivo bei der schlechteren Therapierbarkeit der prognostisch ungünstigen Neuroblastome eine Rolle spielen. Es ist bekannt, dass die Behandlung mit Retinsäure u. a. durch Bcl-2 zu einer Chemoresistenz führen kann. Da die Expression von GATA-4 durch Retinsäure induziert werden und GATA-4 die Expression von Bcl-2 verstärken kann, könnte GATA-4 an der Chemoresistenz beteiligt sein. / Neuroblastoma, an embryonal tumor of the sympathetic nervous system, remains clinically challenging due to its extreme heterogeneity. The aim of this study was to compare the expression of GATA transcription factors GATA-2, -3, -4 and the cofactor friend-of-GATA (FOG)-2 in neuroblastoma and in the developing sympathetic nervous system. The functional role of these proteins in neuroblastoma was subsequently investigated based on the results of the GATA expression studies. The analysis showed that all four proteins are expressed in human neuroblastoma tissue as well as in a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) and are localized in the cell nuclei. Only Gata-4, however, was not expressed in the developing murine sympathetic nervous system. Its uniqueness was also confirmed by microarray analyses of 251 neuroblastoma specimens. While GATA-2, -3 and FOG-2 were significantly associated with favorable prognostic markers, GATA-4 expression correlated with MYCN-amplification. Interestingly, lentiviral GATA-4 overexpression led to inhibited proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y and SH-EP) as well as to increased expression of DPYSL3 and Bcl-2. In addition, GATA-4 expression could be induced by the differentiation agent retinoic acid. In conclusion, it was confirmed that normal developmental molecular pathways are intact in prognostically favorable neuroblastoma. In contrast, these developmental processes seem to be defective in tumors with unfavorable prognosis. The slowed proliferation, as observed in vitro, as well as the induction of Bcl-2 brought about by GATA-4 overexpression may contribute in vivo to the difficult treatability of prognostically unfavorable neuroblastoma. It is known that treatment of neuroblastoma with retinoic acid can lead to chemoresistance, mediated by Bcl-2 amongst others. Since retinoic acid can induce the expression of GATA-4 and GATA-4 itself can enhance the expression of Bcl-2, GATA-4 could be involved in chemoresistance.