Die Arbeit stellt mögliche Einflüsse durch 1,25- Dihydroxy-Vitamin D3 (1,25-VitD3) und Retinsäure (RA) in humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) sowohl während der adipogenen und osteogenen Differenzierung als auch während der Kurzzeit- und Langzeitstimulation auf das Mikromilieu dar. Die Stimulation mit 1,25-VitD3 und RA verlangsamt das Wachstumsverhalten und verändert die Zellmorphologie von hMSC. Effekte auf die Genexpression werden auf mRNA-Ebene mittels RT-PCR dargestellt. Der Phänotyp als auch teilweise die Genexpression der osteogenen und adipogenen Differenzierung wird durch 1,25-VitD3 induziert und durch RA inhibiert. Zudem wird sowohl die „Mikromilieu-Zusammensetzung“ als auch das „Transkriptionssignal“ von 1,25-VitD3 und RA gegenseitig beeinflusst. / The paper reports about possible effects of 1,25-dihydroxy-vitamin D3 (1,25-VitD3) und retinoic acid (RA) in human mesenchymal stem cells (hMSC) during adipogenic and osteogenic differentiation as well as effects on the microenvironment during a short and long time stimulation. Stimulation with 1,25-VitD3 and RA slows down the growth rate and alters cell morphology of hMSC. Effects on gene expression are shown at the mRNA level by means of RT-PCR. The phenotype and partly the gene expression of adipogenic and osteogenic differentiation are stimulated by 1,25-VitD3 and are inhibited by RA. In addition, both the “microenvironment composition” and the “transcription signal” of 1,25-VitD3 and RA are mutually influenced.

Der humane Stammzellfaktor (SCF) ist ein zentraler Wachstumsfaktor für Mastzellen in der Dermis und für Melanozyten in den Basalzellschichten der Epidermis. Er wird u. a. von Keratinozyten produziert. In dieser Arbeit wurde die mögliche Regulation der Expression von SCF aus Keratinozyten durch All-Trans-Retinsäure (RA) und Dexamethason in vitro an Hand der HaCaT-Zelllinie untersucht. Die HaCaT-Zellen wurden mit den beiden o. g. Substanzen (10 hoch -5 M bis 10 hoch -9 M) über 24 Stunden und 11 Tage inkubiert. Die Auswertung der HaCaT-Zellzahl, des Gesamt-Proteins SCF, dessen Splicevarianten (mSCF, sSCF) und der Rezeptoren von RA (RAR-alpha, -beta, -gamma) und von Dexamethason (GR-alpha, -beta) erfolgte mittels ELISA und RT-PCR. Dabei ergaben sich folgende Resultate: RA bewirkt einen Anstieg von SCF, Dexamethason bewirkt bei Kurzinkubation eine deutliche Zunahme von SCF, bei Dauerinkubation einen starken Abfall. Die RA-Rezeptoren RA-alpha und -gamma waren nach Inkubation mit RA verstärkt nachzuweisen; die Glukokortikoid-Rezeptoren GR-alpha und -beta zeigten nach Inkubation mit Dexamethason ebenfalls eine vermehrte Expression. Die Expression des Mastzellwachstumsfaktors SCF könnte deshalb unter physiologischen, pathologischen und therapeutischen Bedingungen durch Retinoide und Glukokortikoide reguliert sein. / The human stem cell factor (SCF) is a crucial growth factor for mast cells in the dermis and for the melanocytes in the basal layers of the epidermis. SCF is produced, among others, by keratinocytes. This study examines the possible regulation of the expression of SCF from keratinocytes by all-trans retinoic acid (RA) and dexamethasone in vitro by the keratinocyte cell line HaCaT. The HaCaT-cells were incubated for 24 hours or 11 days, respectively, with one of the above mentioned substances (10 to the power of -5 M to 10 to the power of -9 M). The analysis of the number of HaCaT-cells, of the total SCF protein, its splice variants (mSCF, sSCF), the receptors of RA (RAR-alpha, -beta, -gamma), and of the dexamethasone (GR-alpha, -beta) was done by ELISA and RT-PCR. The following results were found: RA induces an increase of SCF, dexamethasone at a short incubation period a considerable increase of SCF, and at long-term incubation a strong decrease. The RA-receptors RA-alpha und -gamma expression is increased after incubation with RA, and the glucocorticoid-receptors GR-alpha and -beta after the incubation with dexamethasone. Therefore, it is probable that the increase of the mast cell growth factor SCF under physiological, pathological and therapeutic conditions could be regulated by retinoic acid and glucocorticoids.

Das Neuroblastom, ein embryonaler Tumor des sympathischen Nervensystems, stellt durch seine außerordentliche Heterogenität klinisch eine große Herausforderung dar. Ziel dieser Arbeit war es, die Expression der GATA-Transkriptionsfaktoren GATA-2, -3, -4 und des Kofaktors friend-of-GATA (FOG)-2 im Neuroblastom und im sich entwickelnden sympathischen Nervensystem zu vergleichen. Davon ausgehend wurde die Rolle der Proteine im Neuroblastom näher untersucht. Es wurde gezeigt, dass alle vier Proteine in humanem Neuroblastom-Gewebe sowie in einer humanen Neuroblastom-Zelllinie (SH-SY5Y) exprimiert werden und nukleär lokalisiert sind. Lediglich Gata-4 wurde jedoch im sich entwickelnden sympathischen Nervensystem der Maus nicht exprimiert. Die Einzigartigkeit von GATA-4 bestätigte sich auch durch Microarray-Analysen von 251 Neuroblastom-Proben. Während GATA-2, -3 und FOG-2 signifikant mit Markern für eine günstige Prognose assoziiert wurden, korrelierte die GATA-4 Expression mit MYCN-Amplifikation. Interessanterweise führte die lentivirale Überexpression von GATA-4 zu einer Proliferationsinhibition humaner Neuroblastomzellen (SH-SY5Y und SH-EP) sowie zu der verstärkten Expression von DPYSL3 und Bcl-2. Zudem konnte durch das Differenzierungsagens Retinsäure die GATA-4 Expression induziert werden. So wurde in dieser Arbeit bestätigt, dass normale Entwicklungsprozesse in prognostisch günstigen Neuroblastomen intakt sind. Umgekehrt sind in Tumoren mit schlechterer Prognose diese Prozesse gestört. Die in vitro verlangsamte Proliferation sowie die Induktion von Bcl-2 nach Überexpression von GATA-4 könnten in vivo bei der schlechteren Therapierbarkeit der prognostisch ungünstigen Neuroblastome eine Rolle spielen. Es ist bekannt, dass die Behandlung mit Retinsäure u. a. durch Bcl-2 zu einer Chemoresistenz führen kann. Da die Expression von GATA-4 durch Retinsäure induziert werden und GATA-4 die Expression von Bcl-2 verstärken kann, könnte GATA-4 an der Chemoresistenz beteiligt sein. / Neuroblastoma, an embryonal tumor of the sympathetic nervous system, remains clinically challenging due to its extreme heterogeneity. The aim of this study was to compare the expression of GATA transcription factors GATA-2, -3, -4 and the cofactor friend-of-GATA (FOG)-2 in neuroblastoma and in the developing sympathetic nervous system. The functional role of these proteins in neuroblastoma was subsequently investigated based on the results of the GATA expression studies. The analysis showed that all four proteins are expressed in human neuroblastoma tissue as well as in a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) and are localized in the cell nuclei. Only Gata-4, however, was not expressed in the developing murine sympathetic nervous system. Its uniqueness was also confirmed by microarray analyses of 251 neuroblastoma specimens. While GATA-2, -3 and FOG-2 were significantly associated with favorable prognostic markers, GATA-4 expression correlated with MYCN-amplification. Interestingly, lentiviral GATA-4 overexpression led to inhibited proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y and SH-EP) as well as to increased expression of DPYSL3 and Bcl-2. In addition, GATA-4 expression could be induced by the differentiation agent retinoic acid. In conclusion, it was confirmed that normal developmental molecular pathways are intact in prognostically favorable neuroblastoma. In contrast, these developmental processes seem to be defective in tumors with unfavorable prognosis. The slowed proliferation, as observed in vitro, as well as the induction of Bcl-2 brought about by GATA-4 overexpression may contribute in vivo to the difficult treatability of prognostically unfavorable neuroblastoma. It is known that treatment of neuroblastoma with retinoic acid can lead to chemoresistance, mediated by Bcl-2 amongst others. Since retinoic acid can induce the expression of GATA-4 and GATA-4 itself can enhance the expression of Bcl-2, GATA-4 could be involved in chemoresistance.

Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

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Das Gen H-rev107 wurde mit einer subtraktiven cDNS-Bibliothek zwischen H-ras-transformierten und H-ras-resistenten Fibroblasten isoliert. Es wurde als ein Klasse II Tumorsuppressorgen bezeichnet, dessen Expression die H-ras-induzierte maligne Transformation unterdrückt. Weitere Untersuchungen zeigten die Existenz einer Genfamilie mit dem Gen H-rev107-1 auf Chromosom 11q11-12 und H-rev107-2/TIG3/RARRES3 auf 11q23. Die Induzierbarkeit in epithelialen Zellen durch Interferon-gamma (H-rev107-1) und Retinoide (H-rev107-2) legten eine Beteiligung der Expression beider Gene bei der Regulation der Hämatopoese nahe. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels RT-PCR in 8/15 Patientenproben (10 AML, 5 ALL) eine Expression von H-rev107-2 gefunden. H-rev107-2 wurde durch IFN-gamma in 14/14 Proben und durch all-trans Retinsäure (ATRA) in 5/15 Proben induziert. In Zelllinien maligner hämatopoetischer Erkrankungen konnte mit RT-PCR und Northern-Blot-Analysen bei CEM eine deutliche, bei Raji und HL-60 eine schwache Expression und bei NB-4, U937, K562 und Jurkat keine Expression von H-rev107-2 nachgewiesen werden. In allen 7 Zelllinien konnte H-rev107-2 durch IFN-gamma induziert werden. Die Induzierbarkeit durch ATRA und IFN-alpha war Zelllinien abhängig. Die stärkste Induktion durch ATRA erfolgte bei der akuten Promyelozytenleukämie-Zelllinie NB-4. Eine Induktionskinetik erbrachte eine H-rev107-2-Expression frühestens nach 4 h Inkubation mit IFN-gamma oder ATRA. Die Inhibition des MAPK-Signalwegs durch den MEK-Inhibitor PD098059 und des Signaltransduktors JAK2 durch AG490 hatte bei den myeloischen Zelllinien weder Einfluss auf die H-rev107-2-Expression noch auf die H-rev107-2-Induktion durch IFN-gamma oder ATRA. Die Expression von H-rev107-1 konnte bei U937, CEM und K562 gezeigt werden, wogegen die RT-PCR-Analysen bei NB-4, HL-60, Raji und Jurkat sowie bei 8 Patientenproben (6 AML, 2 ALL) keine H-rev107-2-Transkripte nachwiesen. Eine schwache Induktion von H-rev107-1 konnte nur bei den Zelllinien NB-4 durch ATRA und IFN-gamma und bei K562 durch IFN-gamma und IFN-alpha erzielt werden. Zusammenfassend legen die Ergebnisse dieser Arbeit eine Beteiligung von H-rev107-2/TIG3/RARRES3 bei der Regulation der Hämatopoese als ein mögliches Interferon- und ATRA-Target nahe. / The H-rev107 gene has been isolated by cDNA subtraction from a cell culture model of H-ras transformed fibroblasts. It was characterized as a class II tumor suppressor gene confering resistance to H-ras induced transformation. Further investigation has demonstrated the presence of a human gene family with H-rev107-1 localized on chromosome 11q11-12 and H-rev107-2/TIG3/RARRES3 on 11q23. Inducibility of the genes in epithelial cells by interferon-gamma (H-rev107-1) and retinoids (H-rev107-2) has suggested that expression of the H-rev107 genes might be relevant in hematopoesis. In the present study RT-PCR analysis revealed an expression of H-rev107-2 in 8/15 samples of leukaemic blasts derived from patients suffering from acute leukaemias (10 AML, 5 ALL). H-rev107-2 was induced upon incubation with IFN-gamma ?in 14/14 samples and with ATRA in 5/15 samples. In cell lines derived from myeloid and lymphoid tumors an expression of H-rev107-2 was found in CEM (strong), Raji and HL-60 (both weak), whereas in NB-4, U937, K562 and Jurkat no H-rev107-2 transcripts were detected by RT-PCR and Northern Blot analysis. In all cell lines H-rev107-2 could be strongly induced by IFN-gamma. Inducibility of H-rev107-2 upon treatment with IFN-alpha or ATRA was dependent on the type of cell line. In contrast to the weak effect seen in the myeloblastic cell line HL-60 a strong induction of H-rev107-2 by ATRA occurred in the acute promyelocytic leukaemia cell line NB-4. Transcripts of H-rev107-2 in NB-4 were detected at the earliest after 4 h incubation with ATRA or IFN-gamma. Inhibition of the MAPK-pathway by the MEK-inhibitor PD089059 or the signal transducer JAK2 by AG490 had neither influence on the H-rev107-2 expression nor on the IFN-gamma- and ATRA-dependent H-rev107-2 induction. H-rev107-1 expression was detectable in U937, CEM and K562, whereas RT-PCR analysis of the other cell lines and of 8 samples of primary leukaemic blasts (6 AML, 2 ALL) revealed no H-rev107-1 expression. An induction of H-rev107-1 occurred exclusively in NB-4 by ATRA and IFN-gamma and in K562 by IFN-gamma and IFN-alpha? to a weak extend. In conclusion, this work revealed a likely involvement of the class II tumor suppressor gene H-rev107-2/TIG3/RARRES3 in the regulation of hematopoesis being a potential IFN and ATRA target.

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