The Best M.Phil Thesis in the Faculties of Dentistry, Engineering, Medicine and Science (University of Hong Kong), Li Ka Shing Prize,1997-1999 / published_or_final_version / Pathology / Master / Master of Philosophy

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The overall survival for patients with glioblastoma multiforme (GBM) has not improved in two decades. A better understanding of the molecular basis for gliomagenesis would aid therapeutic advances. Recombinational based alternative lengthening of telomeres (ALT) is a telomere maintenance mechanism (TMM) distinct from telomerase, which serves as a prognostic factor in GBM. In this thesis, I have compared components of the p53 axis, namely p53, p21[WAF-1] and the paired box-containing transcription factors (PAX) PAX2, 5, and 8, with TMM in gliomas. Analysis of TP53 status in relation to TMM in 110 gliomas revealed that activation of ALT during tumorigenesis possibly requires loss of normal TP53 function (P < 0.0001). Overexpression of p21[WAF-1] was also found to correlate with telomerase-positive gliomas (P = 0.0002). Moreover, high p21[WAF-1] expression is a poor prognostic factor in patients under 56 years (P = 0.015). Telomere length (TL) was also found as a prognostic factor, such that short TL (< 5 kb) is a poor prognostic factor in the group without defined TMM ("None")(P = 0.0160). Pax2,5 and 8 belong to Group II of the PAX family. They are expressed at the midbrain-hindbrain boundary (MHB) and in the neural tube of the vertebrate embryo, whereas their expression levels are low in the adult brain. To explore their roles in glioma pathology, I analyzed mRNA levels in 54 gliomas and 16 established glioma cell lines. Increased levels of PAX8 mRNA were detected in 74.1% of gliomas and 62.5% of established glioma cell lines by real time PCR. Sixty-six percent of glioma specimens expressed high levels of active PAX2, 5, and 8 by immunohistochemistry. There were more males than females having high PAX2 expression (P = 0.0408). Suppression of PAX8 by small interfering RNA induced glioma cell death, independent of TP53 status. These findings identify PAX8 as a survival factor for GBM, and PAX2, 5, and 8 expression as contributing to the aggressive behavior of gliomas. The mRNA level of PAX8 showed a positive correlation with telomerase activity in glioma biopsies (r� = 0.75, P < 0.001). The relationship was explored and I found that PAX2 and PAX8 are able to activate the reporter constructs of both the catalytic subunit (hTERT) and the RNA component (hTR) of telomerase. PAX8 had a stronger effect than PAX2 on the activation of the hTERT and hTR promoters. By electrophoretic mobility shift assay, Western blotting and telomerase activity assay, I showed that PAX8 bound directly to hTERT and hTR promoters, and upregulated hTERT protein and telomerase activity. Moreover, gliomas carrying wild type TP53 had higher levels of PAX8 expression compared to those with mutant TP53 (P = 0.0075) suggesting that PAX8 is significant only in some GBMs during gliomagenesis. These results show that the oncofetal proteins, PAX2 and PAX8, may have roles in telomerase regulation. Taken together, molecular markers examined in this thesis suggest gliomas with different TMMs are derived from different pathways.

Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2004. / Title from first page of PDF file. Document formatted into pages; contains xvi, 134 p. : ill. (some col.). Advisor: Allan J. Yates, Dept. of Pathology. Includes bibliographical references (p. 118-134).

Thesis (Ph.D.)--University of California, San Francisco, 2004. / Bibliography: leaves 119-129. Also available online.

Thesis (Ph.D.) -- Virginia Commonwealth University, 2006. / Thesis lacks signature page. Title from title-page of electronic thesis. Prepared for: Dept. of Chemical Engineering. Bibliography: p. 99-113.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-10-17T03:23:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 347984.pdf: 3966286 bytes, checksum: 30aaf340e5697c76bcb8a374b5c5ce0d (MD5) Previous issue date: 2017 / Os gliomas representam 50-80 % dos tumores cerebrais primários classificados como um dos tipos de neoplasia com maiores desafios na sua terapia. Dentre eles o glioblastoma multiforme (GBM) é o tipo mais agressivo, com um prognóstico pouco favorável, sendo a sobrevida média dos pacientes de aproximadamente 12 meses. Considerando a limitada eficiência das terapias disponíveis, têm sido investigadas novas moléculas bioativas. Lectinas são proteínas que ligam glicanos, apresentando diversas atividades biológicas. Estudos recentes têm indicado a capacidade de algumas lectinas isoladas de plantas, especialmente ConA, poderem induzir morte de células tumorais com certa seletividade, considerando que essas células podem apresentar alterações no padrão de glicosilação. Dentro desses paradigmas, o presente trabalho teve como objetivo central investigar o efeito citotóxico das lectinas purificadas das sementes de Dioclea reflexa (DrfL I) e de Canavalia brasiliensis (ConBr) sobre culturas celulares de glioma das linhagens C6 (rato) e U87 (humana), caracterizando o possível mecanismo dessa ação. Os resultados demonstraram que as lectinas DrfL I e ConBr (30 e 50 ?g/mL) diminuem a viabilidade (avaliada pelo ensaio de MTT) e induzem alterações morfológicas (avaliada por microscopia de luz e de fluorescência) sobre células da linhagem C6. As lectinas também demonstraram a capacidade de inibir a migração celular e sobrevivência clonogênica, especialmente na concentração mais elevada (50 ?g/mL). Além disso, ConBr e DrfL I causaram indução significativa do processo de autofagia na linhagem C6, avaliado através da coloração com laranja de acridina (LA). Notavelmente, a ação das lectinas foi dependente da integridade de sua estrutura terciária/quaternária, bem como do domínio de interação com carboidratos (CRD), considerando que a desnaturação térmica e o bloqueio do CRD (com ?-metil-manosídeo), respectivamente, levaram a perda da atividade das lectinas. Quando avaliada a ação de DrfL I e ConBr sobre a linhagem U87 (humana) foi observado que apenas DrfL I apresentou atividade citotóxica sobre esta linhagem, sendo sua ação similar ao observado sobre as células da linhagem C6. Dessa forma, nosso estudo sugere um potencial antitumoral para a lectina DrfL I, considerando sua ação sobre a linhagem de glioma U87, que deverá ser avaliada com mais profundidade em futuros estudos.<br> / Abstract : Gliomas represent 50-80 % of the primary brain tumors and it is one of the most challenging types of neoplasia for therapy. Glioblastoma multiform (GBM) is the most aggressive type of glioma, with unfavorable prognosis and average survival of patients approximately 12 months. Taken in account a limited therapy available, new bioactive molecules have been investigated. Lectins are proteins that bind glycans on cell surface displaying a diversity of biological activities. The capability of plant lectins to induce selective tumoral cell death has been reported, since the tumoral cells may express modifications in the glycosilation pattern. Taken these paradigms, the present work aimed to investigate the citotoxicity of the lectins purified from Dioclea reflexa (DrfL I) and Canavalia brasiliensis (ConBr) seeds against gliomas lineages C6 (rat) and U87 (human), characterizing a possible mechanism for this action. The results showed that DrfL I and ConBr lectins (30 and 50 ?g/mL) decreased cell viability (measured by MTT assay) and induced morphological changes (assessed by optic and fluorescence microscopy) on C6 cells. The lectins also induced inhibition of cell migration and clonogenic survival, especially at highest concentration of 50 ?g/mL. Moreover, both ConBr and DrfL I were able to induce autophagy of C6 cells, as evaluated by acridin orange stain. Noteworthy, the lectin actions were dependent of terceary/quaternary structure and carbohydrate recognition domain (CRD) since both, thermal denaturation as well as CRD blockage (by ?-methyl-manoside), respectively, impaired the lectin activity. The action of DrfL I and ConBr on the U87 lineage (human) was also evaluated. However, only DrfL I demonstrated activity against this lineage, which was very similar that observed against C6 cells lineage. In conclusion, our study suggests an antitumor potential for DrfL I lectin, considering its activity against U87 gliomas lineage. Moreover, future studies will be necessary in order to ascertain the DrfL I mechanisms using in vitro and in vivo models of gliomas.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Neurociências, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-05T23:24:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 318594.pdf: 909603 bytes, checksum: 713a5419f8bb7c88d829bffcdedc6318 (MD5) Previous issue date: 2013 / Gliomas malignos constituem um grupo heterogêneo de tumores, com origem em precursores astrocíticos, abrangendo cerca de 70% de todos os tumores do Sistema Nervoso Central (SNC). Mesmos havendo diversos estudos relacionados e tratamentos, os prognósticos dos pacientes acometidos por esses tumores permanecem ruins. Dentre os tratamentos utilizados o quimioterápico cisplatina (CDDP) é um agente alquilante com atividade antineoplásica. Apesar do amplo espectro de atividade no tratamento de câncer, muitos mecanismos de resistência a essa droga já foram relatados. Gliomas exibem diversos mecanismos de resistência à quimioterapia, além disso, apresentam uma importante alteração no sistema glutamatérgico própria de seu desenvolvimento, que confere resistência, auxiliando na invasibilidade e agressividade tumoral. Assim, objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da CDDP sobre o sistema glutamatérgico e mecanismos de resistência em células de glioma humano A172, bem como em culturas primárias de astrócitos corticais de ratos neonatos. CDDP nas concentrações entre 500 e 1000 µM apresenta efeito citotóxico em células de glioma humano. No entanto, astrócitos corticais primários foram mais sensíveis à exposição a CDDP, aprensentando diminuição da viabilidade em menores concentrações (50 e 100 µM). CDDP 100 µM diminuiu a captação de glutamato tanto em células de glioma A172 quanto em astrócitos corticais, entretanto a CDDP 50 µM apresentou esse efeito apenas nas células de glioma A172. CDDP (50 e 100 µM) aumentou a liberação de glutamato tanto na linhagem de glioma humano quanto nos astrócitos corticais. Em se tratando de transportadores de glutamato, foram observados os níveis de expressão do EAAT-2 em células A172 tratadas com CDDP, sendo que as concentrações que alteraram o transporte não modificaram os níveis de expressão desse transportador. A implicação do trocador cistina-glutamato (sistema Xc-) no aumento da liberação de glutamato em gliomas já é bem descrita, entretanto CDDP (50 e 100 µM) não alterou seus níveis de expressão em células de glioma. CDDP não foi modificou os níveis totais de glutationa, entretanto o inibidor do sistema Xc- (sulfassalazina) causou evidente diminuição desses níveis, demonstrando a implicação da atividade do sistema Xc- nas defesas antioxidantes de células de glioma. A inibição do sistema Xc- preveniu o aumento da liberação de glutamato causado pela CDDP. E o tratamento concomitante com CDDP e sulfassalazina não alterou a viabilidade em células de glioma, sugerindo que a resistência à CDDP apresentada por estas células nas concentrações testadas, ocorre por um mecanismo diferente que a produção de glutationa. Esses resultados apontam que a CDDP pode aumentar o potencial invasivo e agressivo de células de glioma humano A172, elevando níveis extracelulares de glutamato através da modulação da atividade de transportadores glutamatérgicos.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-27T04:02:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 339613.pdf: 3611153 bytes, checksum: 3f8c794d29b943c788477e63cfdb3f2e (MD5) Previous issue date: 2016 / Gliomas, tumores originados de células gliais (astrócitos, oligodendrócito ou epêndima), são os tumores cerebrais primários mais comuns. Lectinas são proteínas de reconhecimento e ligação específicos a carboidratos. O objetivo do presente trabalho foi analisar o possível efeito citotóxico das lectinas ConA, ConBr, ConM, CoxyL, ConGF, DSL (nativa e recombinante), DwL, DvioL, DmrL, DLL, DrfL e CTL, que são extraidas de plantas leguminosas, sobre células C6 de glioma de rato, um glioma com características astrocitárias. Após 24h de incubação com as respectivas lectinas e nas concentrações de 10, 30, 50 e 100µg/mL, foi observado que apenas a lectina CTL não provocou redução da viabilidade, avaliada através do teste de redução do MTT. Baseado na potência de ação citotóxica observada nesse screening as lectinas ConA, ConBr, DvioL e DSL recombinante foram escolhidas para realizar o mesmo teste do MTT, porém também nos tempos 1, 3, 6 e 12 horas, sendo então selecionadas as lectinas ConA e Dviol para investigação das possíveis vias de morte celular envolvidas. Dessa forma, através de ensaios de microscopia de fluorescência, citometria de fluxo e microscopia eletrônica conclui-se que o principal mecanismo responsável pelo efeito citotóxico de ConA e DvioL é a indução de morte celular autofágica, efeito obtido a partir das concentrações de 30µg/mL. Ao realizar ensaios com as lectinas desnaturadas, concluiu-se que o efeito biológico depende da estrutura terciária da lectina, porém, mais estudos sobre a importância do sítio de reconhecimento a carboidratos devem ser realizados, uma vez que os ensaios de bloqueio do sítio de ligação ao açúcar não mostraram claramente uma ação bloqueadora do efeito citotóxico de ConA e DvioL. Os resultados também mostraram que DvioL possui maior potência em relação a ConA na indução de morte autofágica. Este trabalho sugere DvioL com uma molécula com potencial para fututros estudos de terapia anti-tumoral.<br> / Abstract : Gliomas, tumors originating from glial cells (astrocytes, oligodendrocytes or ependymal) are the most common primary brain tumors. Lectins are proteins of specific recognition and binding to carbohydrates. The aim of this study was to analyze the possible cytotoxic effect of the lectins ConA, ConBr, ConM, CoxyL, ConGF, DSL (native and recombinant), DWL, DvioL, DmrL, DLL, DrfL and CTL, which are extracted from leguminous plants, on C6 rat glioma cells, which have astrocytes features. After 24 hours of incubation with the respective lectins and at concentrations of 10, 30, 50 and 100µg/mL, it was observed that only the CTL lectin did not cause reduction in viability as measured by MTT test. Based on the potency of cytotoxic activity observed in this screening, ConA, ConBr, DvioL and DSL recombinant lectins were chosen for the same MTT test after 1, 3, 6 and 12 hours incubation, and then ConA and Dviol lectins were selected for further investigation concerning the possible cell death pathways involved. Thus, by fluorescence microscopy, flow cytometry and electron microscopy assays, it was concluded that the main mechanism responsible for the cytotoxic effect of ConA and DvioL is the induction of autophagic cell death, the effect obtained from the concentration of 30µg/mL. When performing tests with denatured lectins, it was concluded that the biological effect depends on the tertiary structure of the lectin. However, further studies regarding the role of the carbohydrate recognition domain (CRD) deserve to be conducted, since the CRD blocking protocol did not completely abrogated the cytotoxic action of ConA and DvioL. The results also showed that DvioL have greater potency compared to the ConA to induce autophagic death. This study suggests DvioL as a potential molecule to undertake future studies for anti-tumor therapy.