京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(人間・環境学) / 甲第18379号 / 人博第692号 / 新制||人||165(附属図書館) / 25||人博||692(吉田南総合図書館) / 31237 / 京都大学大学院人間・環境学研究科相関環境学専攻 / (主査)准教授 土屋 徹, 教授 小松 賢志, 教授 宮下 英明 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Human and Environmental Studies / Kyoto University / DFAM

Orientador: Prof. Dr. Luciano Puzer / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, São Bernardo do Campo, 2017. / Serpina é o nome dado à superfamília de proteínas com uma vasta diversidade de funções biológicas, que tem como principal característica a inibição irreversível de serino proteases. A característica estrutural mais marcante das serpinas é a presença de uma alça na sua porção C-terminal, composta por 20 aminoácidos denominados alça do centro reativo (RCL). A RCL é a região da serpina que se liga covalentemente ao sítio ativo da serino protease, promovendo a inibição irreversível da enzima pela desarticulação de estruturas funcionais essenciais para a catálise enzimática. As calicreínas teciduais humanas (KLKs) são um grupo de 15 serino proteases (KLK1-KLK15) expressas em uma gama de tecidos. A rKLK5, estudada neste trabalho, é expressa abundantemente na pele humana, e parece que exerce importante papel no processo de descamação epidermal, podendo estar relacionada à patologias, como a psoríase e dermatite atópica. Assim, nesse trabalho foi realizada subclonagem, expressão e caracterização bioquímica da atividade inibitória dos mutantes (VSR344G e VSA345G) da serpina oriunda da cianobactéria Gloeobacter violaceus, identificada pelo nosso grupo e nomeada vioserpina. Os genes codificadores da vioserpina foram previamente clonados no vetor de expressão pET-28a e por meio da técnica de mutação sítio-dirigida foram produzidos dois mutantes substituindo os resíduos de aminoácidos arginina e alanina nas posições P1 e P2 da alça do centro reativo (RCL) da vioserpina, respectivamente, por um resíduo de aminoácido glicina (VSR344G e VSA345G). O sucesso das mutações foi avaliado através de sequenciamento de DNA. As vioserpinas mutantes foram expressas na cepa bacteriana E. coli BL21(D3), purificadas pela técnica de cromatografia de afinidade em resina de níquel (Ni-NTA) e obtidas na forma solúvel. Foi possível visualizar a formação do complexo covalente entre a vioserpina e a KLK5 por análise em SDS-PAGE 10% confirmados pela espectrometria de massas. Também foi analisada a ação inibitória dos mutantes (VSR344G e VSA345G) frente a KLK5. Os valores de SI (estequiometria de inibição) apresentaram valores altos o que indica que é preciso uma concentração grande de inibidor, no caso os mutantes da vioserpina, para que a enzima tenha sua atividade inibida, apresentando-se desta forma uma inibição ineficiente frente a rKLK5. Nesse estudo foi possível obter um inibidor específico (vioserpina) para a rKLK5, podendo assim contribuir para o desenvolvimento de novos procedimentos terapêuticos para patologias envolvidas com o processo de descamação epidermal. / Serpin is the name given to the superfamily of proteins with wide range of biological functions, and that has as main feature the irreversible inhibition of serine proteases. The most striking structural feature of serpins is the presence of a loop in the C-terminal portion of the protein, composed by 20 aminoacids called Reative Center Loop (RCL). The RCL is the region of the serpin that binds covalently to the serine protease active site, which causes the irreversible inhibition of the enzyme by the disarticulation of functional structures essencial for the enzymatic catalysis. Human tissue kalikreins (KLKs) are a group of 15 serine proteases (KLK1-KLK15) expressed in a plethora of tissues. The rKLK5, studied in this work, is abundantly expressed in human skin, and seems to play an important role in the epidermal desquamation process, and may be related to pathologies such as psoriasis and atopic dermatitis. Therefore, in this work the subcloning, expression and biochemical characterization of the inhibitory activity of serpin mutants (VSR344G e VSA345G) of the cyanobacteria Gloeobacter violaceus, recently described by our group and named vioserpin, was proposed. The genes coding for vioserpin were previously cloned into the pET-28a expression vector and through the site-directed mutation technique two mutants were produced by substituting the arginine and alanine amino acid residues at the P1 and P2 positions of the serine reactive center loop (RCL), respectively, by a glycine amino acid residue (VSR344G e VSA345G). The success of the mutations was assessed by DNA sequencing. The mutant vioserpin was expressed in the bacterial strain E. coli BL21 (D3), purified by the nickel resin affinity chromatography technique (Ni-NTA) and obtained in the soluble form. Covalent complex formation between vioserpin and rKLK5 could be visualized by 10% SDS-PAGE analysis confirmed by mass spectrometry. We also analyzed the inhibitory action of mutants (VSR344G and VSA345G) against rKLK5. The SI values (inhibition stoichiometry) presented high values indicating that a large inhibitor concentration is required in the case of the vioserpin mutants, so that the enzyme has its inhibited activity, thus presenting an inefficient inhibition in front To rKLK5. In this study it was possible to obtain a specific inhibitor (vioserpin) for rKLK5, thus contributing to the development of new therapeutic procedures for pathologies involved with the epidermal desquamation process.