The prevalence and molecular characterization of Cryptosporidium spp. in slaughtered cattle 6 months and older was performed. Three species of Cryptosporidium were identified. A subtype of C. parvum was obtained.

Die Kryptosporidiose der Kälber wird zumeist durch die Spezies C. parvum verursacht, einem ubiquitär verbreiteten Parasiten mit zoonotischem Potential. Die Infektion geht insbesondere in den ersten Lebenswochen mit wässrigem Durchfall einher, was in der Nutztierhaltung durch eine erhöhte Sterblichkeit enorme wirtschaftliche Verluste bedeuten kann. Neben einer Vielzahl anderer Einflussfaktoren trägt der Erreger mit unterschiedlicher Virulenz zur Ausprägung der Klinik bei. Aufgrund limitierter kausaler Therapeutika ist das Desinfektionsmanagement auf einem Kälber haltenden Betrieb bei der Bekämpfung entscheidend. Epidemiologische Studien sind essentiell, um die eher unterschätze Parasitose im Sinne eines One-Health-Ansatzes mehr in den Fokus der Aufmerksamkeit zu rücken. Mit der Testung verschiedener chemischer Substanzen und UV-Bestrahlung auf die Wirksamkeit gegen C. parvum-Oozysten sollten mögliche Alternativen zu den antiprotozoären Desinfektionsmitteln für das Labor aufgezeigt werden. Anhand von Sequenzanalysen des Gp60-Genlokus wurden C. parvum-Feldisolate von Kälbern aus sächsischen Milchviehbetrieben molekulargenetisch charakterisiert, um einen Überblick über die im Untersuchungsgebiet verbreiteten Subtypen generieren zu können. Diese Feldisolate wurden außerdem in vitro unter standardisierten Laborbedingungen in humanen Adenokarzinomzellen (HCT-8) auf Zytopathogenität getestet, um möglicherweise auf die Erregervirulenz in vivo rückschließen zu können. C. parvum-Oozysten eines Laborstammes wurden in denaturiertem Ethanol, Ethanol (70 %, 100 %), Wasserstoffperoxid (H2O2, 3 %, 10 %) oder Natriumhypochlorit (NaOCl, 1,5 %, 3 %, 6 %) über 30 min, 2 h, 4 h, 12 h oder 24 h in Suspension inkubiert oder auf einem Keimträger über 10 min, 20 min und 30 min einer UV-C-Strahlung ausgesetzt. Anschließend wurden mit diesen Oozysten HCT-8-Zellen infiziert und die Infektiosität mittels Real-Time-PCR quantifiziert. In einer epidemiologischen Studie wurden bis zu 13 Kälber aus 61 Milchviehbetreiben klinisch untersucht. Entnommene Kotproben wurden nach ihrer Konsistenz gescort und semiquantitativ mittels Heine-Färbung auf Cryptosporidium spp. untersucht. Gewonnene Feldisolate wurden in vitro zur Infektion von HCT-8-Zellmonolayern verwendet, um deren Zytopathogenität mit Hilfe eines Zellviabilitätsassay (MTT-Assay) zu ermitteln. Nicht infizierte Zellmonolayer dienten als Negativkontrolle. Zur genetischen Subtypisierung der Feldisolate erfolgten Sequenzanalysen des Gp60-Genlokus mittels Amplifizierung in zwei unterschiedlichen PCR-Verfahren. Alle Zellkulturexperimente wurden in Triplikaten durchgeführt und der Mittelwert (Inaktivierungsstudien) bzw. der Median (Zellviabilität) errechnet. Die ermittelten Daten wurden auf Normalverteilung getestet (Shapiro-Wilk-Test). Gruppenvergleiche erfolgten mit dem Mann-Whitney-U-Test (keine Normalverteilung) bzw. dem t-Test (Normalverteilung). Korrelationsanalysen wurden mit dem Pearson-Korrelationskoeffizienten durchgeführt. Die Anwendung von 10 %igem H2O2 mit einer Einwirkzeit von mindestens 12 h sowie die Inkubation in NaOCl (3 % und 6 %) über 12 h führte zu einer fast vollständigen Inaktivierung (> 99 %) der C. parvum-Oozysten. Diese Effektivität wurde auch mit der UV-Bestrahlung über 30 min (100 mJ/cm2) erreicht. 89 % (455/512) der beprobten Kälber wurden positiv auf Cryptosporidium spp. getestet und in jedem Betrieb wurde mindestens ein Ausscheider detektiert. Infizierte Tiere zeigten signifikant häufiger Durchfall als negativ Getestete. Die Subtypisierung war für 47 Feldisolate erfolgreich. IIaA15G2R1 wurde in 66 % der Betriebe gefunden, IIaA16G3R1 in 13 %. Acht weitere Gp60-Subtypen der Gruppe IIa wurden weniger häufig (< 8,5 %) nachgewiesen, der Subtyp IIaA17G4R1 dabei erstmals in Deutschland. 26 Feldisolate konnten in vitro auf ihre Zytopathogenität getestet werden. Es wurden Werte zwischen 17,7 % (± 5,1 %) und 99,5 % (± 7,1 %) lebender Zellen nach Infektion ermittelt. Die Feldisolate wurden in drei Zytopathogenitätskategorien gruppiert. Es wurde eine signifikante Korrelation zwischen In vitro- und In-vivo-Daten ermittelt. Außerdem hatte die Lagerungsdauer der Oozysten signifikanten Einfluss auf die Zytopathogenität. UV-C-Strahlen (100 mJ/cm2) und 10 %iger H2O2 sind bei Einhaltung entsprechender Einwirkzeiten geeignet C. parvum-Oozysten effizient zu inaktivieren. Die Studienergebnisse bestätigen in einem regional eingeschränkten Rahmen, dass C. parvum als Primärpathogen entscheidend am Durchfallgeschehen junger Kälber beteiligt ist. Alle in Sachsen detektierten Subtypen weisen ein zoonotisches Potential auf. Durch die Anwendung des MTT-Assay ist eine Aussage über die Qualität von C. parvum-Oozysten nach Lagerung bei 4 °C möglich. Zur Eignung als diagnostisches Tool bedarf es weiterer Untersuchungen.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2. 1 Taxonomie des Erregers 2. 2 Morphologie und Entwicklungszyklus intestinaler Kryptosporidien 2. 3 In-vitro-Kultivierung des Erregers 2. 4 Invasionsmechanismen und Modulation der Apoptose 2. 5 Klinik, Pathogenese und Bekämpfung von C. parvum beim Kalb 2. 6 Humane Kryptosporidiose 2. 7 Diagnostik und molekulargenetische Charakterisierung von Feldisolaten 2. 8 Viabilitäts- und Infektiositätsnachweis von C. parvum-Oozysten 2. 8. 1 Bewertung der Viabilität 2. 8. 2 Bewertung der Infektiosität 2. 9 Inaktivierung des Parasiten 2. 9. 1 Physikalische Inaktivierung 2. 9. 1. 1 Temperatur 2. 9. 1. 2 UV-Bestrahlung 2. 9. 1. 3 Gammastrahlung 2. 9. 1. 4 Ultraschall 2. 9. 1. 5 Sonstige Methoden der physikalischen Inaktivierung 2. 9. 2 Chemische Inaktivierung 2. 9. 2. 1 Chlorverbindungen 2. 9. 2. 2 Ozon 2. 9. 2. 3 Alkohole und Aldehyde 2. 9. 2. 4 Ammoniumverbindungen 2. 9. 2. 5 Wasserstoffperoxid 2. 9. 3 Kommerziell erhältliche Desinfektionsmittel 3 Publikation 1: Inactivation of Cryptosporidium parvum under laboratory conditions 4 Publikation 2: Distribution of Cryptosporidium parvum gp60 subtypes in calf herds of Saxony, Germany 5 Publikation 3: Bovine Cryptosporidium parvum field isolates differ in cytopathogenicity in HCT-8 monolayers 6 Diskussion 6. 1 Chemische Desinfektion von C. parvum unter Laborbedingungen 6. 2 Physikalische Inaktivierung von C. parvum mittels UV-Bestrahlung 6. 3 Nachweisraten von Cryptosporidium spp. in Sachsen 6. 4 Zytopathogenität der C. parvum-Feldisolate 6. 5 Verbreitung von Gp60-Subtypen in Sachsen 7 Zusammenfassung 8 Summary 9 Literaturverzeichnis

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Cryptosporidium is a parasite that causes gastrointestinal issues such as diarrhoea and stomach pain. The main transmission routes are through contaminated water or food, between humans and from animal to humans. Cryptosporidium infects through oocysts which contain four sporozoites that releases when entering a host and can continue to breed inside the body. Cryptosporidium can cause massive outbreaks if established in a water source used for drinking water. To prevent and detect an outbreak it´s important to trace the transmission back to the source. The GP60-gene is used to identify and subtype Cryptosporidium and is a very useful tool during contact tracing. The purpose of this study was to identify species and subtype of Cryptosporidium using nanopore sequencing. In this study the GP60-gene was amplified using a Nested PCR protocol and then sequenced using nanopore sequencing. The sequences acquired where then used to make a search in BLAST to identify the species. The GP60 subtyping method uses the hypervariable region on the GP60-gene. A series of tandem repeats are used to identify the subtype. In this study seven positive Cryptosporidium faeces samples were amplified and sequenced. Nanopore sequencing was possible for five of the seven samples with C. parvum identified in four of these samples. Targeting the GP60-gene to determine species and subtype works well for the most common human pathogen species of Cryptosporidium. Further optimization is required before the method can be implemented för diagnostic use.

Das Vorkommen von Kryptosporidien bei Kälbern in Deutschland während der ersten drei Lebenswochen, sowie der Einfluss von C. parvum, auch im Kontext von Koinfektionen auf das Erkrankungsgeschehen wurde bewertet. Um einen Überblick über die hierzulande verbreiteten Subgenotypen zu erhalten, wurden die aus Milchviehbetrieben in Deutschland gewonnenen C. parvum-Feldisolate mittels Sequenzanalysen am GP60-Lokus molekulargenetisch untersucht.