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Molekulare Untersuchungen zum Gag-Protein der Foamyviren / Molecular analysis of the foamyviral Gag proteinMatthes, Daniel January 2010 (has links) (PDF)
Foamyviren (FV) weisen eine Reihe von Merkmalen auf, welche sie von Orthoretroviren unterscheidet, die sie jedoch gleichzeitig mit den Hepadnaviren teilen. Dies betrifft neben der Genomorganisation, der Proteinexpression sowie dem Replikationsverhalten auch die Partikelmorphogenese. Die zentrale Komponente in diesem Prozeß stellt das Gag-Protein dar. FV benötigen im Gegensatz zu Orthoretroviren und vergleichbar den Hepadnaviren die Koexpression des homologen Glykoproteins für den zellulären Partikelexport. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde mittels eines chimären Konstruktes aus den Gag-Proteinen von MPMV und PFV versucht, ein Env-interagierendes Motiv sowie die für die Interaktion mit dem Glykoprotein essentiellen As in PFV Gag zu identifizieren. Dabei wiesen die chimären Gag-Proteine Gemeinsamkeiten mit PFV Gag auf, wie eine perinukleäre Akkumulation, eine Vorraussetzung für das Assembly sowohl von PFV als auch MPMV. Desweiteren waren die Gag-Chimären für einen zellulären Export auf die Koexpression des homologen Glykoproteins angewiesen. Dies deutete auf die Integrität und Funktionalität des dafür notwendigen PFV Gag N-Terminus hin. Die chimären Gag-Moleküle multimerisierten jedoch nicht zu Kapsiden oder vergleichbaren partikulären Strukturen, vermutlich aufgrund massiver sterischer Zwänge infolge der Beteiligung heterologer Proteindomänen, weswegen sie kein geeignetes System zur funktionellen Analyse der PFV Gag-Env-Interaktion darstellten. Eine weitere Besonderheit foamyviraler Gag-Proteine ist ihr äußerst geringer Lysinanteil. Im Gegensatz zu den Gag-Proteinen der Orthoretroviren wird der überwiegende Anteil basischer Aminosäuren (As) durch Arginin vertreten. Da über 60 % der Arginin-spezifizierenden Kodons über eine Einzelmutation aus Lysin-Kodons hervorgegangen sein könnten, ist es wahrscheinlich, daß im Verlauf der foamyviralen Evolution eine positive Selektionierung von Gag-Mutanten mit einer Lysin-zu-Arginin-Substitution stattfand. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde anhand der Beispiele von PFV sowie FFV der Frage nachgegangen, welche Funktionen Arginine in foamyviralen Gag-Proteinen während der Replikation übernehmen. Dazu wurde in infektiösen PFV- sowie FFV-Klonen eine Reihe von Argininen gegen Lysine substituiert. Zusätzlich wurde das singuläre Lysin in PFV Gag gegen Arginin substituiert. Dabei konnte gezeigt werden, daß sämtliche PFV- sowie FFV-Mutanten replikationskompetent waren. Das singuläre Lysin in PFV Gag war für dessen Replikation in immortalisierten Zellen entbehrlich, in einer primären Zellinie wies die entsprechende Mutante jedoch eine stark eingeschränkte Replikationsfähigkeit auf. Eine PFV-Substitutionsmutante (M141) induzierte in transfizierten 293T-Zellkulturen einen CPE, ein Hinweis auf eine Beteiligung dieses Gag-Abschnittes an der Interaktion mit dem PFV Glykoprotein. Nach zehnmaliger Zellkultur-Passagierung der PFV Gag-Mutanten traten weder Revertanten noch Pseudorevertanten auf, was jedoch aufgrund der kurzen Zeitspanne des Experimentes nur eine begrenzte Aussagekraft bezüglich der genetischen Stabilität der Mutanten zuließ. Mittels der Applikation von AZT, eines Inhibitors der foamyviralen reversen Transkription, entweder auf die virusproduzierenden Zellen oder die zur Infektion verwendeten Zielzellen konnte gezeigt werden, daß sich die PFV Gag-Lysinmutanten hinsichtlich ihrer Replikationsstrategie nicht von WT-Viren unterscheiden und ihre genomische RNA größtenteils noch in der Produktionszelle revers transkribieren. Desweiteren konnte mittels quantitativer real-time PCR nachgewiesen werden, daß die PFV- und FFV-Mutanten wie für FV üblich sowohl DNA als auch RNA in ihre Partikel verpacken. Die infektiöse Natur foamyviraler genomischer DNA konnte bereits in früheren Veröffentlichungen gezeigt werden. Auch in dieser Arbeit konnte nach Transfektion von Zellen mit aufgereinigter Virionen-DNA und anschließendem Überstandtransfer ein CPE in den infizierten Indikatorzellen induziert werden, was die Produktion infektiöser Viruspartikel bewies. Die -Aminogruppe von Lysin fungiert als potentieller Ubiquitinakzeptor. Für das singuläre Lysin im WT Gag-Protein von PFV konnte wie in früheren Veröffentlichungen keine Ubiquitinierung festgestellt werden, im Gegensatz dazu wurde bei vier der fünf PFV Substitutionsmutanten eine Ubiquitinierung der neu eingeführten Lysine detektiert. Diese kovalente Modifikation hatte jedoch keinen Einfluß auf die Env-Restriktion des PFV-Kapsidexportes aus der Zelle. Für FFV konnte sowohl für den WT als auch die Substitutionsmutanten weder eine LP- noch eine Gag-Ubiquitinierung festgestellt werden. Als wahrscheinliche Ursache dafür kommen Unterschiede in den Komponenten der Ubiquitinierungsmaschinerie zwischen humanen Zellen und Katzenzellen in Frage, weshalb die Analyse einer möglichen Ubiquitinierung der neu in FFV Gag eingeführten Lysine in Katzenzellen als Produktionszellen durchgeführt werden sollte. Die Replikationsfähigkeit mehrerer Substitutionsmutanten der Gegenwart von IFN- und - war im Vergleich zum WT stark eingeschränkt. Dies deutete darauf hin, daß IFN-vermittelte Abwehrmechanismen eine Rolle während der positiven Selektion der Lysin-zu-Arginin-Substitutionsmutanten gespielt haben könnten. Die in dieser Arbeit erzielten Resultate zeigten, daß sich die PFV- sowie FFV-Lysinmutanten in ihrem Replikationsverhalten nicht von WT-Viren unterscheiden. Im Kontext einer über Millionen von Jahren andauernden Wirts-Erreger-Koevolution stellt jedoch der durch zelluläre Restriktionsfaktoren vermittelte Selektionsdruck auf das Virus einen wichtigen Aspekt dar. Demnach könnte die Substitution von Lysin gegen Arginin beispielsweise über eine veränderte kovalente Modifikation eine Interaktion mit antiretroviralen Restriktionsfaktoren der Wirtszelle modifiziert oder inhibiert haben, wodurch diese Mutanten im Verlauf der foamyviralen Evolution positiv selektioniert wurden. / Foamyviruses (FV) harbour several features which distinguishes them from orthoretroviruses and which they share with the hepadnaviruses. Beside differences in the genomic organization, the protein expression and the replication strategy this referrs to the morphogenesis of viral particles, in which the Gag protein plays the key role. In contrast to orthoretroviruses and like hepadnaviruses, cellular egress of FV capsids depends on the presence of cognate Env protein. In the first part of this work it was tried to identify an Env-interacting motif as well as essential amino acids (aa) involved in the recognition of the glycoprotein in PFV Gag. Therefore a chimeric construct containing parts of the Gag proteins of Mason-Pfizer monkey virus (MPMV) and PFV was constructed. Like PFV Gag, the chimeric Gag proteins showed a perinuclear accumulation, a feature of PFV and MPMV assembly. Additionally, cellular export of the Gag chimerics was PFV Env restricted. This pointed to the integrity and functionality of the PFV Gag N-terminus in the chimeric construct. Nevertheless, chimeric Gag molekules didn´t multimerize to capsids or comparable particle structures. This was probably caused by massive sterical disorders, due to the involvement of heterologous protein domains. Therefore, the Gag chimerics didn´t represent an appropriate system for the functional analysis of the PFV Gag-Env interaction. Another peculiarity of foamyviral Gag proteins is their extremely low lysine content. In contrast to orthoretroviral Gag proteins, the main part of basic aa is represented by arginines. Due to the fact that more than 60 % of the arginine-specifying codons could have evolved out of lysine-specifying codons over a single point mutation, a positive selection of Gag mutants with a lysine-to-arginine substitution in the course of foamyviral evolution is likely. In the second part of this work, functions of arginines in foamyviral Gag proteins during replication were studied by using infectious molecular clones of PFV and FFV. Therefore several arginines were substituted for lysines. Additionally the single lysine in PFV Gag (K396) was mutated to arginine. All PFV as well as FFV mutants were replication-competent. Additionally, the single lysine in PFV Gag was non-essential for replication in immortalized cell culture, whereas replication was strongly inhibited in a primary cell line. One PFV substitution mutant (M141) induced an CPE in transfected 293T-cell culture, an indication of an involvement of this part of Gag in the interaction with the PFV glycoprotein. Upon ten cell-free passages of PFV Gag mutants in cell culture, neither revertants nor pseudorevertants appeared, indicating genetic stability during a short-term cell culture experiment. By application of AZT, an inhibitor of the foamyviral reverse transcription, on producer cells or target cells it was shown that the reverse transcription of the genomic RNA of the PFV Gag lysine mutants occured mainly in the producer cell and that they therefore didnt differ from wild-type (wt) virus with respect to replication strategy. By quantitative real-time PCR it was shown that PFV and FFV mutants incorporate DNA as well as RNA in particles. Like in recent publications, the infectiousness of foamyviral genomic DNA could be demonstrated in this work. By transfecting cells with extracted virion DNA and following supernatant transfer a CPE could be induced in the infected target cells, showing the production of infectious virus. The -aminogroup of lysine functions as a potential ubiquitin acceptor. Like in recent publications, no ubiquitination of the single lysine in PFV wt Gag could be detected. In contrast, four out of five PFV substitution mutants showed ubiquitination of the introduced lysines. Nevertheless, Gag mutants with this covalent modification didn´t have the ability to generate virus like particles (VLPs) or to be pseudotyped by heterologous Env. For FFV wt and mutants, neither Env leader peptide nor Gag ubiquitination could be detected. Differences in components of the ubiquitinination machinery between human cells and feline cells are a probable reason for this. Therefore the analysis of ubiquitiniation of the newly introduced lysines in FFV Gag should be carried out in feline cells as producer cells. Replication of several substitution mutants was strongly inhibited compared to wt virus in the presence of IFN- and -. These results indicated that IFN mediated defense mechanisms could have played a role in the positive selection of the lysine-to-arginine substitution mutants. These results show that the PFV and FFV mutants didn´t differ from wt viruses with respect to their replication strategy. In the context of the long-term host-pathogen coevolution the selection pressure on the virus mediated by cellular restriction factors represents an important aspect dar. The mutation from lysines to arginines implying an altered covalent modification of Gag could have lead to an modification or inhibition of the interaction with antiretroviral restriction factors of the host cell, leading to a positive selection of these mutants during foamyviral evolution.
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Untersuchungen zum Gag- und Pol-Protein des Prototypischen Foamyvirus (PFV)Cartellieri, Marc 16 May 2006 (has links) (PDF)
Innerhalb der Retroviren unterscheiden sich die Foamyviren (FV) bezüglich ihrer Proteinexpression, der Partikelmorphogenese und ihres Reproduktionszyklus deutlich von den Orthoretroviren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei exklusive Merkmale der Foamyviren, die ungewöhnliche Struktur des Gag-Proteins und die Gag unabhängige Pol-Expression, in ihrer Auswirkung auf Morphogenese und Zusammensetzung foamyviraler Partikel untersucht. Für die Morphogenese infektiöser Partikel sind sehr unterschiedliche Mengen der Genprodukte eines Retrovirus nötig. Im Gegensatz zu den Orthoretroviren wird bei Foamyviren das Produkt des pro/pol-ORFs von einer eigenen, gespleißten mRNA translatiert. Der Gag/Pro/Pol-Gehalt in den Viruspartikeln kann folglich nicht wie bei Orthoretroviren über eine gekoppelte Translation und Inkorporation von Gag- und Gag/Pro/Pol-Fusionsproteinen reguliert werden. In dieser Arbeit wurde der Frage nach dem molekularem Verhältnis von Gag- und Pro/Pol-Proteinen in foamyviralen Partikeln nachgegangen. In den isolierten PFV Partikeln war der relative Gehalt an dem Gag-Prozessierungsprodukt p68 viermal höher als der Gehalt an dem Gag-Vorläuferprotein p71. Das Gag-Prozessierungsprodukt p68 bildet somit das Hauptstrukturelement der PFV Kapside. Weiterhin ergab sich ein Verhältnis von 16 Gag-Molekülen zu einem p85PR/RT-Molekül sowie 10 Gag-Molekülen pro p40IN-Molekül. Damit entsprach die Gag/Pol-Zusammensetzung von PFV Partikeln den stöchiometrischen Verhältnissen in orthoretroviralen Partikeln von 10 - 20 Gag-Molekülen pro Pol-Molekül. Dieses Ergebnis ist in Hinsicht auf die unterschiedlichen Synthesestrategien von Gag und Pol bei Orthoretro- und Foamyviren bemerkenswert. Basierend auf diesen Ergebnissen stellt sich für weiterführende Untersuchungen nun die Frage nach der Regulation der Gag- und Pol-Synthese bei Foamyviren. Bei Orthoretroviren setzt sich in einem Prozess der Selbstorganisation das Strukturprotein Gag autonom zu virusähnlichen Partikeln zusammen, die auch in Abwesenheit weiterer viraler Komponenten aus der Wirtszelle freigesetzt werden. Foamyviren dagegen benötigen für die Freisetzung ihrer Viruspartikel neben dem Strukturprotein obligat die Koexpression ihres Glykoproteins. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden funktionelle Abschnitte im PFV Gag-Protein eingegrenzt und charakterisiert, die eine Rolle bei der Bildung und Freisetzung der viralen Partikel spielen. Eine schrittweise Deletion des PFV Gag-Proteins vom C-Terminus her zeigte, dass die N-terminalen 300 As von PFV Gag ausreichend für die Freisetzung von partikulärem viralem Proteinmaterial sind. Die Analyse weiterer Deletionsmutanten innerhalb des N-Terminus des PFV Gag-Proteins belegte, dass die As 6 - 200 für die Bildung viraler Kapside entbehrlich sind, aber für die Interaktion mit dem viralen Glykoprotein und für eine Freisetzung der viralen Partikel aus der Wirtszelle essentiell sind. Die Substitution einzelner konservierter Aminosäuren durch Alanin zwischen As 40 - 60 blockierte die Partikelmorphogenese. Die Aminosäureabfolge dieses Proteinabschnittes zeigte eine große Ähnlichkeit mit einem zellulären Transportsignal, dass in den Gag-Proteinen von Retroviren des Typ-D-Morphogeneseweges entdeckt worden ist. Eine parallele Mutationsanalyse des FFV Gag-Proteins ließ vermuten, dass dieses Motiv wohl universell in allen FV Gag-Proteinen vorhanden ist. Weiterhin konnten Aminosäureabschnitte am unmittelbaren N-Terminus des PFV Gag-Proteins sowie zwischen As 130 - 200 eingegrenzt werden, die essentiell für die Struktur des Proteins sind und eventuell eine wichtige Funktion bei der Partikelmorphogenese erfüllen. Weitere Untersuchungen und insbesondere eine Strukturaufklärung des PFV Gag-Proteins sind nötig, um die genaue Funktion der einzelnen Proteinabschnitte zu charakterisieren.
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Untersuchungen zum Gag- und Pol-Protein des Prototypischen Foamyvirus (PFV)Cartellieri, Marc 24 March 2006 (has links)
Innerhalb der Retroviren unterscheiden sich die Foamyviren (FV) bezüglich ihrer Proteinexpression, der Partikelmorphogenese und ihres Reproduktionszyklus deutlich von den Orthoretroviren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei exklusive Merkmale der Foamyviren, die ungewöhnliche Struktur des Gag-Proteins und die Gag unabhängige Pol-Expression, in ihrer Auswirkung auf Morphogenese und Zusammensetzung foamyviraler Partikel untersucht. Für die Morphogenese infektiöser Partikel sind sehr unterschiedliche Mengen der Genprodukte eines Retrovirus nötig. Im Gegensatz zu den Orthoretroviren wird bei Foamyviren das Produkt des pro/pol-ORFs von einer eigenen, gespleißten mRNA translatiert. Der Gag/Pro/Pol-Gehalt in den Viruspartikeln kann folglich nicht wie bei Orthoretroviren über eine gekoppelte Translation und Inkorporation von Gag- und Gag/Pro/Pol-Fusionsproteinen reguliert werden. In dieser Arbeit wurde der Frage nach dem molekularem Verhältnis von Gag- und Pro/Pol-Proteinen in foamyviralen Partikeln nachgegangen. In den isolierten PFV Partikeln war der relative Gehalt an dem Gag-Prozessierungsprodukt p68 viermal höher als der Gehalt an dem Gag-Vorläuferprotein p71. Das Gag-Prozessierungsprodukt p68 bildet somit das Hauptstrukturelement der PFV Kapside. Weiterhin ergab sich ein Verhältnis von 16 Gag-Molekülen zu einem p85PR/RT-Molekül sowie 10 Gag-Molekülen pro p40IN-Molekül. Damit entsprach die Gag/Pol-Zusammensetzung von PFV Partikeln den stöchiometrischen Verhältnissen in orthoretroviralen Partikeln von 10 - 20 Gag-Molekülen pro Pol-Molekül. Dieses Ergebnis ist in Hinsicht auf die unterschiedlichen Synthesestrategien von Gag und Pol bei Orthoretro- und Foamyviren bemerkenswert. Basierend auf diesen Ergebnissen stellt sich für weiterführende Untersuchungen nun die Frage nach der Regulation der Gag- und Pol-Synthese bei Foamyviren. Bei Orthoretroviren setzt sich in einem Prozess der Selbstorganisation das Strukturprotein Gag autonom zu virusähnlichen Partikeln zusammen, die auch in Abwesenheit weiterer viraler Komponenten aus der Wirtszelle freigesetzt werden. Foamyviren dagegen benötigen für die Freisetzung ihrer Viruspartikel neben dem Strukturprotein obligat die Koexpression ihres Glykoproteins. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden funktionelle Abschnitte im PFV Gag-Protein eingegrenzt und charakterisiert, die eine Rolle bei der Bildung und Freisetzung der viralen Partikel spielen. Eine schrittweise Deletion des PFV Gag-Proteins vom C-Terminus her zeigte, dass die N-terminalen 300 As von PFV Gag ausreichend für die Freisetzung von partikulärem viralem Proteinmaterial sind. Die Analyse weiterer Deletionsmutanten innerhalb des N-Terminus des PFV Gag-Proteins belegte, dass die As 6 - 200 für die Bildung viraler Kapside entbehrlich sind, aber für die Interaktion mit dem viralen Glykoprotein und für eine Freisetzung der viralen Partikel aus der Wirtszelle essentiell sind. Die Substitution einzelner konservierter Aminosäuren durch Alanin zwischen As 40 - 60 blockierte die Partikelmorphogenese. Die Aminosäureabfolge dieses Proteinabschnittes zeigte eine große Ähnlichkeit mit einem zellulären Transportsignal, dass in den Gag-Proteinen von Retroviren des Typ-D-Morphogeneseweges entdeckt worden ist. Eine parallele Mutationsanalyse des FFV Gag-Proteins ließ vermuten, dass dieses Motiv wohl universell in allen FV Gag-Proteinen vorhanden ist. Weiterhin konnten Aminosäureabschnitte am unmittelbaren N-Terminus des PFV Gag-Proteins sowie zwischen As 130 - 200 eingegrenzt werden, die essentiell für die Struktur des Proteins sind und eventuell eine wichtige Funktion bei der Partikelmorphogenese erfüllen. Weitere Untersuchungen und insbesondere eine Strukturaufklärung des PFV Gag-Proteins sind nötig, um die genaue Funktion der einzelnen Proteinabschnitte zu charakterisieren.
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