Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2003. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 141-164).

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2002. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 104-125).

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2002. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 130-150).

No description available.

Innerhalb der Retroviren unterscheiden sich die Foamyviren (FV) bezüglich ihrer Proteinexpression, der Partikelmorphogenese und ihres Reproduktionszyklus deutlich von den Orthoretroviren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei exklusive Merkmale der Foamyviren, die ungewöhnliche Struktur des Gag-Proteins und die Gag unabhängige Pol-Expression, in ihrer Auswirkung auf Morphogenese und Zusammensetzung foamyviraler Partikel untersucht. Für die Morphogenese infektiöser Partikel sind sehr unterschiedliche Mengen der Genprodukte eines Retrovirus nötig. Im Gegensatz zu den Orthoretroviren wird bei Foamyviren das Produkt des pro/pol-ORFs von einer eigenen, gespleißten mRNA translatiert. Der Gag/Pro/Pol-Gehalt in den Viruspartikeln kann folglich nicht wie bei Orthoretroviren über eine gekoppelte Translation und Inkorporation von Gag- und Gag/Pro/Pol-Fusionsproteinen reguliert werden. In dieser Arbeit wurde der Frage nach dem molekularem Verhältnis von Gag- und Pro/Pol-Proteinen in foamyviralen Partikeln nachgegangen. In den isolierten PFV Partikeln war der relative Gehalt an dem Gag-Prozessierungsprodukt p68 viermal höher als der Gehalt an dem Gag-Vorläuferprotein p71. Das Gag-Prozessierungsprodukt p68 bildet somit das Hauptstrukturelement der PFV Kapside. Weiterhin ergab sich ein Verhältnis von 16 Gag-Molekülen zu einem p85PR/RT-Molekül sowie 10 Gag-Molekülen pro p40IN-Molekül. Damit entsprach die Gag/Pol-Zusammensetzung von PFV Partikeln den stöchiometrischen Verhältnissen in orthoretroviralen Partikeln von 10 - 20 Gag-Molekülen pro Pol-Molekül. Dieses Ergebnis ist in Hinsicht auf die unterschiedlichen Synthesestrategien von Gag und Pol bei Orthoretro- und Foamyviren bemerkenswert. Basierend auf diesen Ergebnissen stellt sich für weiterführende Untersuchungen nun die Frage nach der Regulation der Gag- und Pol-Synthese bei Foamyviren. Bei Orthoretroviren setzt sich in einem Prozess der Selbstorganisation das Strukturprotein Gag autonom zu virusähnlichen Partikeln zusammen, die auch in Abwesenheit weiterer viraler Komponenten aus der Wirtszelle freigesetzt werden. Foamyviren dagegen benötigen für die Freisetzung ihrer Viruspartikel neben dem Strukturprotein obligat die Koexpression ihres Glykoproteins. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden funktionelle Abschnitte im PFV Gag-Protein eingegrenzt und charakterisiert, die eine Rolle bei der Bildung und Freisetzung der viralen Partikel spielen. Eine schrittweise Deletion des PFV Gag-Proteins vom C-Terminus her zeigte, dass die N-terminalen 300 As von PFV Gag ausreichend für die Freisetzung von partikulärem viralem Proteinmaterial sind. Die Analyse weiterer Deletionsmutanten innerhalb des N-Terminus des PFV Gag-Proteins belegte, dass die As 6 - 200 für die Bildung viraler Kapside entbehrlich sind, aber für die Interaktion mit dem viralen Glykoprotein und für eine Freisetzung der viralen Partikel aus der Wirtszelle essentiell sind. Die Substitution einzelner konservierter Aminosäuren durch Alanin zwischen As 40 - 60 blockierte die Partikelmorphogenese. Die Aminosäureabfolge dieses Proteinabschnittes zeigte eine große Ähnlichkeit mit einem zellulären Transportsignal, dass in den Gag-Proteinen von Retroviren des Typ-D-Morphogeneseweges entdeckt worden ist. Eine parallele Mutationsanalyse des FFV Gag-Proteins ließ vermuten, dass dieses Motiv wohl universell in allen FV Gag-Proteinen vorhanden ist. Weiterhin konnten Aminosäureabschnitte am unmittelbaren N-Terminus des PFV Gag-Proteins sowie zwischen As 130 - 200 eingegrenzt werden, die essentiell für die Struktur des Proteins sind und eventuell eine wichtige Funktion bei der Partikelmorphogenese erfüllen. Weitere Untersuchungen und insbesondere eine Strukturaufklärung des PFV Gag-Proteins sind nötig, um die genaue Funktion der einzelnen Proteinabschnitte zu charakterisieren.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2007. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 136-153).

Innerhalb der Retroviren unterscheiden sich die Foamyviren (FV) bezüglich ihrer Proteinexpression, der Partikelmorphogenese und ihres Reproduktionszyklus deutlich von den Orthoretroviren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei exklusive Merkmale der Foamyviren, die ungewöhnliche Struktur des Gag-Proteins und die Gag unabhängige Pol-Expression, in ihrer Auswirkung auf Morphogenese und Zusammensetzung foamyviraler Partikel untersucht. Für die Morphogenese infektiöser Partikel sind sehr unterschiedliche Mengen der Genprodukte eines Retrovirus nötig. Im Gegensatz zu den Orthoretroviren wird bei Foamyviren das Produkt des pro/pol-ORFs von einer eigenen, gespleißten mRNA translatiert. Der Gag/Pro/Pol-Gehalt in den Viruspartikeln kann folglich nicht wie bei Orthoretroviren über eine gekoppelte Translation und Inkorporation von Gag- und Gag/Pro/Pol-Fusionsproteinen reguliert werden. In dieser Arbeit wurde der Frage nach dem molekularem Verhältnis von Gag- und Pro/Pol-Proteinen in foamyviralen Partikeln nachgegangen. In den isolierten PFV Partikeln war der relative Gehalt an dem Gag-Prozessierungsprodukt p68 viermal höher als der Gehalt an dem Gag-Vorläuferprotein p71. Das Gag-Prozessierungsprodukt p68 bildet somit das Hauptstrukturelement der PFV Kapside. Weiterhin ergab sich ein Verhältnis von 16 Gag-Molekülen zu einem p85PR/RT-Molekül sowie 10 Gag-Molekülen pro p40IN-Molekül. Damit entsprach die Gag/Pol-Zusammensetzung von PFV Partikeln den stöchiometrischen Verhältnissen in orthoretroviralen Partikeln von 10 - 20 Gag-Molekülen pro Pol-Molekül. Dieses Ergebnis ist in Hinsicht auf die unterschiedlichen Synthesestrategien von Gag und Pol bei Orthoretro- und Foamyviren bemerkenswert. Basierend auf diesen Ergebnissen stellt sich für weiterführende Untersuchungen nun die Frage nach der Regulation der Gag- und Pol-Synthese bei Foamyviren. Bei Orthoretroviren setzt sich in einem Prozess der Selbstorganisation das Strukturprotein Gag autonom zu virusähnlichen Partikeln zusammen, die auch in Abwesenheit weiterer viraler Komponenten aus der Wirtszelle freigesetzt werden. Foamyviren dagegen benötigen für die Freisetzung ihrer Viruspartikel neben dem Strukturprotein obligat die Koexpression ihres Glykoproteins. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden funktionelle Abschnitte im PFV Gag-Protein eingegrenzt und charakterisiert, die eine Rolle bei der Bildung und Freisetzung der viralen Partikel spielen. Eine schrittweise Deletion des PFV Gag-Proteins vom C-Terminus her zeigte, dass die N-terminalen 300 As von PFV Gag ausreichend für die Freisetzung von partikulärem viralem Proteinmaterial sind. Die Analyse weiterer Deletionsmutanten innerhalb des N-Terminus des PFV Gag-Proteins belegte, dass die As 6 - 200 für die Bildung viraler Kapside entbehrlich sind, aber für die Interaktion mit dem viralen Glykoprotein und für eine Freisetzung der viralen Partikel aus der Wirtszelle essentiell sind. Die Substitution einzelner konservierter Aminosäuren durch Alanin zwischen As 40 - 60 blockierte die Partikelmorphogenese. Die Aminosäureabfolge dieses Proteinabschnittes zeigte eine große Ähnlichkeit mit einem zellulären Transportsignal, dass in den Gag-Proteinen von Retroviren des Typ-D-Morphogeneseweges entdeckt worden ist. Eine parallele Mutationsanalyse des FFV Gag-Proteins ließ vermuten, dass dieses Motiv wohl universell in allen FV Gag-Proteinen vorhanden ist. Weiterhin konnten Aminosäureabschnitte am unmittelbaren N-Terminus des PFV Gag-Proteins sowie zwischen As 130 - 200 eingegrenzt werden, die essentiell für die Struktur des Proteins sind und eventuell eine wichtige Funktion bei der Partikelmorphogenese erfüllen. Weitere Untersuchungen und insbesondere eine Strukturaufklärung des PFV Gag-Proteins sind nötig, um die genaue Funktion der einzelnen Proteinabschnitte zu charakterisieren.

Foamy viruses (FVs) or heterologous retroviruses pseudotyped with FV glycoprotein enable transduction of a great variety of target tissues of disparate species. Specific cellular entry receptors responsible for this exceptionally broad tropism await their identification. Though, ubiquitously expressed heparan sulfate proteoglycan (HS-PG) is known to serve as an attachment factor of FV envelope (Env)-containing virus particles, greatly enhancing target cell permissiveness. Production of high-titer, FV Env-containing retroviral vectors is strongly dependent on the use of cationic polymer-based transfection reagents like polyethyleneimine (PEI). We identified packaging cell-surface HS-PG expression to be responsible for this requirement. Efficient release of FV Env-containing virus particles necessitates neutralization of HS-PG binding sites by PEI. Remarkably, remnants of PEI in FV Env-containing vector supernatants, which are not easily removable, negatively impact target cell transduction, in particular those of myeloid and lymphoid origin. To overcome this limitation for production of FV Env-containing retrovirus supernatants, we generated 293T-based packaging cell lines devoid of HS-PG by genome engineering. This enabled, for the first, time production of inhibitor-free, high-titer FV Env-containing virus supernatants by non-cationic polymer-mediated transfection. Depending on the type of virus, produced titers were 2- to 10-fold higher compared with those obtained by PEI transfection.

Les spumavirus (SV) sont des rétrovirus exogènes de la sous-famille des Spumavirinae appartenant à la famille des Retroviridae. L’infection naturelle chez les primates non humains (PNH) est décrite dans la nature et en captivité, avec 75 à 100% de singes adultes infectés. Chez les PNH, la transmission des SV se fait à travers des morsures très graves. Par ailleurs, ces virus ont été isolés chez des travailleurs de zoo, exposés aux animaux infectés dans le cadre de leur travail. Récemment, des études ont aussi montré l’infection dans le milieu naturel chez des chasseurs au Cameroun. Cependant, aucune pathologie n’a jamais pu être associée à l’infection par ces virus. Au Gabon, les infections par des SV n’ont été que très peu étudiées. Les objectifs de cette thèse sont donc :1) D’évaluer au Gabon, la prévalence des SV dans la colonie de Mandrills en captivité au centre de primatologie (CDP) du CIRMF, ainsi que dans la nature chez un grand nombre d’espèces de primates non humains ;2) De caractériser sur le plan moléculaire les souches SV circulant au Gabon ;3) D’identifier chez des personnes mordues par un PNH des cas de transmission interespèces.Dans la première partie de ce travail, nous avons montré que 83% (70/84) des mandrills du CDP (38 males et 46 femelles) et 60% (9/15) des mandrills sauvages étaient infectés par le SV. L’infection augmentait avec l’âge et la différence entre les males et les femelles n’était pas significative (84% et 82%, respectivement). Un fragment de 425pb de l’integrase a été amplifié dans 60/69 et 53 nouvelles séquences ont été isolées. L’analyse phylogénétique a mis en évidence la circulation de 11 souches différentes dans la colonie, toutes étroitement liées sauf une. La confirmation de ces résultats à l’aide de séquences de virus chez des mandrills sauvages démontre l’existence de deux groupes de mandrills (nord et sud) localisés de part et d’autre du fleuve Ogooué. En plus, nous avons étudié 497 échantillons de plasma et tissus prélevés chez 13 espèces simiennes dans la nature. L’analyse sérologique a montré l’infection par SV chez 10.8% (31/286). Le fragment de l’integrase a été caractérisé dans 38/497 échantillons, avec la description de nouvelles infections naturelles chez les C. solatus, C. nictitans et C. cephus. Dans la deuxième partie, nous avons décrit l’infection chez 20% (4/20) des travailleurs du CDP. La caractérisation moléculaire a été faite chez deux d’entre eux: l’un a été mordu il y a 10 ans par un mandrill clairement identifié, et l’autre par un macaque 25 ans auparavant. En milieu naturel, nous avons testé 78 personnes mordues par un PNH. Au total, 19 personnes mordues (24%) étaient séropositives pour le SV. Sur ces 19 individus, 15 séquences virales ont été obtenues dont 12 de gorilles, 2 de chimpanzés et une de cercopithèque. Ces résultats montrent que les PNH du Gabon sont infectés par les SV et que la transmission inter espèces des SV intervient chez des personnes mordues par ces animaux. / Foamy viruses are members of the Spumavirus genus of the Retroviridae family. These complex exogenous retroviruses are highly prevalent in several animal species, including nonhuman primates (NHP). The seroprevalence of antibodies to Simian foamy virus (SFVs) in captive adult NHP populations can reach 75-100%. SFV infection has been reported in people occupationally exposed to nonhuman primates in zoos. Recently, naturally acquired SFV infections were described in a group of hunters living in Cameroon, central Africa.In Gabon, foamy viruses are less studied. In our study, we evaluated the natural history of SFV in a free-ranging colony of mandrills (CIRMF primate center) and in mandrills living in natura in Gabon (central Africa). We also determined the SFV prevalence in a series of 497 NHP living in different parts of Gabon. Lastly, we investigated the possible transmission of SFVs to humans.First, SFV infection was determined by specific serological (Western blot) and molecular (nested PCR of the integrase region in the polymerase gene) assays. Seropositivity for SFV was found in 70/84 (83%) captive and 9/15 (60%) wild-caught mandrills. The 425-bp SFV integrase fragment was detected in peripheral blood DNA from 53 captive and 8 wild-caught mandrills.Sequence and phylogenetic studies demonstrated the presence of two distinct strains of mandrill SFV, one clade including SFVs from mandrills living in the northern part of Gabon and the second consisting of SFV from animals living in the south. Among the NHP, 10.8% (31/286) of the plasma/sera were SFV seropositive. Integrase gene was characterized in 38 samples with novel SFVs in several species of Cercopithecus.Second, the presence of SFV was also evaluated in 20 people who worked closely with mandrills and other NHP. Integrase region of 425 bp was found in 2/20 (10%) humans. One man who had been bitten 10 years earlier by a mandrill and another bitten 22 years earlier by a macaque were found to be SFV-infected, both at the Primate Centre. Comparative sequence analysis of the virus from the first man and from the mandrill showed nearly identical sequences, indicating genetic stability of SFV over time. The second man had a sequence close to SFVmac sequences. Of the 78 people, mostly hunters, who had been bitten or scratched by NHPs, 19 were SFV seropositive, with 15 cases confirmed by PCR. All but one were infected with ape SFV. We thus found novel SFV strains in NHPs in Gabon and high interspecies transmission of SFVs from gorilla bites.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1999. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 98-107).