Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2015-07-27T14:45:59Z No. of bitstreams: 1 Fernando Oliveira Costa.pdf: 1199928 bytes, checksum: f721f323b7b101614061ea44e7dd6cb3 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-27T14:45:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernando Oliveira Costa.pdf: 1199928 bytes, checksum: f721f323b7b101614061ea44e7dd6cb3 (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 / The metabolic syndrome (MetS) consists of a combination of conditions that tend to cluster together, and increase the risk of type 2 diabetes and cardiovascular disease. The components of the metabolic syndrome include central (abdominal) obesity, elevated fasting glucose, dyslipidemia (abnormally high triglycerides and low high-density lipoprotein cholesterol), and elevated blood pressure. MetS is also associated with proinflammatory and prothrombotic states, non-alcoholic liver steatosis, obstructive sleep apnea and reproduction disorders. Although a common unifying physiopathological mechanism is not known, central obesity and inflammation play a major role in MetS and upon each of its components. The MetS has reached epidemic proportions and to date there are no proven pharmacological interventions that simultaneously target all of the components of this syndrome. Inflammation plays an important role in the pathogenesis of the MetS. Recently, it was discovered that inflammation can be regulated by neural, cholinergic mechanisms and a cholinergic drug, the acetylcholinesterase inhibitor galantamine suppresses abnormal inflammation and alleviates MetS pathologies in rodents. The fact that galantamine is an approved drug, used to treat patients with Alzheimer´s disease with a known safety profile, will facilitate its clinical application in another situations. We hypothesize that treatment of subjects with the MetS with galantamine will result in alleviation in the MetS clinical conditions and inflammation. The objective of our study was to initiate an investigation on the safety profile of galantamine in MetS patients, with special attention on autonomic, hemodynamic and cognitive parameters. A randomized, double-blind, prospective study evaluated clinical, autonomic, hemodynamic and cognitive variables of patients with MetS in two moments: before treatment (basal state) and after 28 days of treatment with galantamine 8 mg daily. There was a statistical tendency in reducing systolic blood pressure in the HRV with Finometer® in patients under galantamine (124.4 ± 4 vs 119.7 ± 3.7 mmHg, basal and 28 days values, respectively) and also a reduction in diastolic blood pressure (72.5 ± 1.3 vs 67.2 ± 1.7 mmHg, basal and 28 days values, respectively). Paradoxically, an increase in the sympathetic modulation of the heart was observed with the HRV study measuring the LF (nu) value (46.2 ± 3.8 vs 57.1 ± 3.4 basal and 28 days, respectively) and a decrease in the parasympathetic modulation HF (nu) value (53.8 ± 3.8 vs 43.0 ± 3.4, basal and 28 days, respectively). We did not observe any significant change in cognitive domains. Our conclusion is that treatment with galantamine 8 mg exhibits a safe clinical profile and can be used in MetS patients. / A síndrome metabólica consiste na combinação de condições agrupadas e aumentam o risco para diabetes tipo 2 e doença cardiovascular. Seus componentes incluem obesidade central, níveis aumentados de glicose, dislipidemia caracterizada por aumento de triglicérides e baixos níveis de HDL e aumento da pressão arterial. Também está associada a um estado proinflamatório, a um estado protrombótico, a esteatose hepática não-alcoólica, apnéia obstrutiva do sono e a desordens reprodutivas. Apesar da não determinação de um mecanismo fisiopatológico unificador, obesidade central e inflamação parecem ser centrais na síndrome metabólica e nos seus componentes individuais. A síndrome metabólica tem alcançado proporções epidêmicas universais e até o presente não há intervenção farmacológica comprovada que atue simultaneamente em todos os seus componentes. Sabe-se hoje que o processo inflamatório tem um papel importante na patogenia da síndrome. Recentemente foi evidenciado que a inflamação pode ser regulada por mecanismos neurais colinérgicos, e que a galantamina, um inibidor da acetilcolinesterase, suprime a inflamação e atua nos componentes da síndrome diminuindo a patogenia em roedores. O fato de a galantamina ser uma droga já aprovada e de perfil seguro em portadores de demência facilita seu uso em outras situações clínicas. Considerando a hipótese de que a galantamina causará melhora da inflamação e dos outros distúrbios relacionados, o objetivo deste estudo foi iniciar a investigação sobre o perfil de segurança da galantamina em pacientes com síndrome metabólica, em especial, em parâmetros hemodinâmicos, autonômicos e de cognição. Realizamos um estudo prospectivo, duplo-cego e randomizado, que avaliou os dados clínicos e os parâmetros descritos, no momento basal e após 28 dias de uso de galantanima (8mg por dia), em portadores de síndrome metabólica. Houve uma tendência à redução da PAS, avaliada batimento-a-batimento com o Finometer no grupo que usou galantamina (124,4 ± 4 vs 119,7 ± 3,7 mmHg, respectivamente basal e após 28 dias de uso, p=0,04), o mesmo ocorrendo com a PAD (72,5 ± 1,3 vs 67,2 ± 1,7, p=0,005), respectivamente basal e após 28 dias de uso). De forma paradoxal, ocorreu um aumento da atividade simpática na modulação autonômica para o coração, avaliada por meio do estudo da variabilidade da freqüência cardíaca como atestado por um valor LF (nu) (46,2 ± 3,8 vs 57,1 ± 3,4 , p=0,0005)), e redução da modulação parassimpática, representada pelo valor do HF (nu) (53,8 ± 3,8 vs 43,0 ± 3,4, p=0,0005) respectivamente basal e após 28 dias de uso. Não observamos alterações significativas nos testes que avaliam o domínio cognitivo dos indivíduos. Concluímos que a dose utilizada de galantamina tem um perfil de segurança clínica que permite expandir seu uso em pacientes portadores de síndrome metabólica.

[pt] O destino e os efeitos de produtos farmacêuticos recentemente se tornou uma questão de interesse ambiental embora pouco seja conhecido sobre sua entrada no ambiente. As drogas colinérgicas e colinesterásicas apresentam-se como um alvo importante da pesquisa ambiental relacionado a sua entrada no ambiente e suas interações físico-químicas e biológicas. Os ensaios com uso de à sondas protéicas são empregados para identificar a formação de complexos na presença de grupos específicos ou indicam a concentração de ligantes presente no ambiente onde se encontra a proteína. O emprego da enzima acetilcolinesterase (AChE) em biosensores para deterninação de inibidores é frequente porém poucos trabalhos exploram a fluorescência intrínseca das enzimas no desenvolvimento de metodologias para detectar espécies químicas ligantes. O objetivo deste trabalho foi propor novas sondas fluorescentes e formas de bioreconhecimento para a determinação de neurotoxinas em diferentes amostras. A proposta foi a de identificar sondas eficientes, de fácil obtenção e baixo custo para o desenvolvimento de métodos simples, sensíveis e seletivos. Para isso a detecção foi baseada na variação da fluorescência intrínseca das proteínas(por sua interação específica com os analitos) e na conjugação de fluoróforos extrínsecos específicos. Pode-se comprovar experimentalmente que a fração protéica obtida pode ser utilizada como sonda fluorescente na determinação dos analitos apresentados neste estudo. Nas determinações dos cinco analitos, os valores de LD e de LQ foram satisfatórios para a aplicação do método em amostras ambientais (solo) e clínicas (urina).As determinações de Gal apresentou desempenho satisfatório para atender diferentes tipos de amostras (LD = 1,3 x 10-9 mol L-1e LQ = 2,1 x 10-8 mol L-1).Os valores de LD e LQ para atropina (9,7 x 10-10 mol L-1 e 2,4 x 10-8 mol L-1, respectivamente) mostram-se adequados visto que outros sensores, como os eletroquimioluminescentes, apresentaram um valor de LQ de 1 × 10–7 mol L-1em amostras de urina. O método para os agrotóxicos metomil (LD = 9,5 x 10-10 mol L-1 e LQ = 2,2 x 10-8mol L-1); metamidofós (LD=1,5 x 10-9 mol L-1 e LQ=3,8 x 10-8 mol L-1) e metil paration (LD= 9,7 x 10-10 mol L-1 e LQ= 1,8 x 10-7 mol L-1) apresentarambom desempenho comparando-se à outros métodos descritos na literatura. A aplicação do método proposto em amostras de solo e urina (sem pré-tratamento) obtiveram recuperações a partir de 88 porcento (agrotóxicos em solo) e dos cinco analitos em urina. O método por fluorescência da sonda protéica não obteve diferença significativa do método analítico dos analitos por HPLC. A adaptação do método proposto à um sistema de biosensor com uso de uma sonda extrínseca (Tioflavina T) foi avaliado positivamente permitindo a imobilização da fração protéica em microplaca e o uso da Tioflavina T como sonda fluorescente da ligação AChE-inibidores. / [en] The fate and effects of pharmaceutical products has recently become a matter of environmental concern although little is known about its entry into the environment. Therefore, the cholinergic and cholinesterasicpresent a major target of environmental research related to his entry into the environment and their physico-chemical and biological interactions. Tests using the protein compounds as probes are employed where the optical properties of the complex protein-signal in the presence of analyte or specific groups indicating the concentration of ligand present in the environment. The use of acetylcholinesterase (AChE) activity in biosensors for inhibitors determination is common but few studies explore the intrinsic fluorescence of enzymes in the development of methods to detect chemical species ligands. The objective of this study was to propose new forms of fluorescent probes and bioaffinity for the determination of neurotoxins in different samples. The proposal was to identify probes efficient, easily accessible and low cost for the development of simple, sensitive and selective. For this the detection was based on the variation of the intrinsic fluorescence of proteins (by its specific interaction with the analytes) and the specific combination of extrinsic fluorophores. For the results presented in this plan can be affirmed that the protein fraction obtained can be used as a fluorescent probe in the determination of analytes of this study.Based on the five determinations of analyte, the values of LD and LQ are satisfactory for applying the method in environmental samples (ground) and clinical (urine). Measurements of Gal showed satisfactory performance to suit different types of samples (LD = 1.3 x 10-9mol L-1eLQ = 2.1 x 10-8mol L-1) values and LD LQ to atropine (9.7 x 10-10 mol L -1 and 2.4 x 10-8 mol L-1, respectively) appear to be suitable as other sensors, such as eletroquimioluminescentes showed a value of 1 LQ × 10-7 mol L-1 in urine samples. The method for pesticide methomyl (LD = 9.5 x 10-10 mol L-1 and LQ = 2.2 x 10-8mol L-1), methamidophos (LD = 1.5 x 10-9 mol L-1 and LQ = 3.8 x 10-8 mol L-1) and methyl parathion (LD = 9.7 x 10-10 mol L-1 and LQ = 1.8 x 10-7 mol L-1) comparing presents betterperformance to the other methods described in literature. The method proposed in soil samples and urine (no pretreatment) had recovered from 88% (ground pesticides) and five of analytes in urine. The t test comparison of means, applied to sets of determinations by fluorescence probe method and HPLC indicated the statistical equality in both recoveries. The adaptation of the proposed method a system of the biosensor with the use of an extrinsic probe (thioflavin T) has positively evaluated allowing immobilization of the protein in microplates and the use of thioflavin T as a fluorescent probe-connecting AChE inhibitors.

[pt] Métodos baseados na cromatografia líquida micelar (MLC) com detecção fluorimétrica foram desenvolvidos para dois estudos de caso. No primeiro deles, seis B-carbolinas (harmol, harmalol, harmane, norharmane, harmine e harmaline) foram plenamente separadas de modo a se aplicar o método para a determinação dos alcaloides em formulações de Passiflora incarnata L., extrato seco de Passiflora alata Dryander e em urina. A separação foi realizada em coluna cromatográfica C18, utilizando fase móvel tamponada (pH 8,0) contendo 220 mmol L-1 de dodecilsulfato de sódio (SDS)/acetonitrila (97/3 por cento v/v). A detecção fluorimétrica permitiu que se atingissem limites de detecção (LOD) abaixo de 3,6 ng g-1 com repetibilidade e precisão intermediária entre 0,1 e 5 por cento. As incertezas combinadas associadas à concentração das B-carbolinas ficaram entre 1 e 9 por cento. O método proposto foi comparado ao método baseado na cromatografia eletrocinética micelar (MEKC) com detecção absorciométrica e os resultados com MLC se mostraram superiores do ponto de vista da capacidade de detecção (por serem os alcaloides naturalmente muito fluorescentes) e de recuperação. Para as amostras de fitoterápicos, o harmol foi quantificado tanto nas amostras de medicamento de Passiflora incarnata quanto em urina de voluntário após a administração de fitoterápico. O harmine foi detectado apenas na amostra de medicamento. Os alcaloides norharmane, harmine e harmaline foram identificados no chá misto de Maracujá, no qual continha em sua composição extrato seco de Passiflora alata Dryander. Na segunda abordagem, um método por MLC foi desenvolvido para a determinação de galantamina e de seus principais metabólitos (N-desmetil galantamina, O-desmetil galantamina, epigalantamina e N-óxido galantamina). A separação da galantamina e dos metabólitos foi feita utilizando coluna cromatográfica C18 com porosidade de 300 angstroms e fase móvel constituída de tampão (pH 5,0) contendo 25 mmol L-1 de SDS/acetonitrila (97/3 por cento v/v). A detecção fluorimétrica permitiu limites de detecção abaixo de 343 ng g-1, repetibilidade e precisão intermediária entre 2,2 e 4 por cento. As incertezas combinadas associadas à concentração de galantamina e dos metabólitos ficaram entre 0,3 e 11 por cento. Ensaios de recuperação foram realizados em amostra de urina fortificada com padrões da galantamina e metabólitos e os resultados obtidos ficaram entre de 91,4 e 114,8 por cento. A comparação entre o método por MLC e o método por cromatografia líquida de alta eficiência com fase reversa foram feitas com amostras de medicamento cujo princípio ativo era o hidrobrometo de galantamina. Os resultados dos teores de galantamina e as variâncias das medidas obtidas por ambos os métodos foram estatisticamente iguais. A sensibilidade da curva analítica obtida por MLC foi duas vezes maior do que a encontrada por cromatografia por fase reversa. Análises de urina de ratos coletadas após a administração do medicamento foram realizadas com o método proposto, sendo que a galantamina mais os metabólitos N-óxido galantamina e N-desmetil galantamina foram identificados nas amostras. Para melhor avaliar o efeito de amplificação de fluorescência da galantamina pelo ambiente organizado, experimentos foram feitos com a separação cromatográfica de fase reversa e com a adição de solução rica em micelas de SDS após a passagem do analito pela coluna cromatográfica. As condições de separação incluíram o uso de coluna cromatográfica C18, fase móvel constituída por tampão (pH 5,0) contendo 2 por cento de propano-2-ol (v/v)/ acetonitrila (80/20 por cento v/v). A solução micelar de SDS (100 mmol L-1), misturada à fase móvel após a coluna cromatográfica, foi preparada com a mesma composição da fase móvel. A sensibilidade da curva analítica de galantamina foi três vezes maior quando o meio micelar foi usado. O resultado prova que o ambiente micelar favorece a medição fluorimétrica de galantam / [en] Methods based on micellar liquid chromatography (MLC) with fluorimetric detection have been developed for two case studies. In the first, six B-carbolines (harmol, harmalol, harmane, norharmane, harmine and harmaline) were fully separated allowing the application of the method for the determination of these alkaloids in Passiflora incarnata L. formulations, in Passiflora alata Dryander dry extract and in urine. The chromatographic separation was performed on a C18 column using a buffered mobile phase consisting of disodium hydrogen phosphate (pH 8.0) containing 220 mmol L-1 of sodium dodecyl sulfate (SDS)/acetonitrile (97/3 percent v/v). The fluorimetric detection allowed limits of detection (LOD) below than 3.6 ng g-1 to be achieved with intermediary precision and repeatability between 0.1 and 5 percent. The calculated combined uncertainties of the concentration of B-carbolines were between 1 and 9 percent. The proposed method was compared with the method based on micellar electrokinetic chromatography (MEKC) with absortionmetric detection. The MLC results were superior from the viewpoint of the detection power (since they are very fluorescent alkaloids) and also in terms of recovery. The harmol was quantified in Passiflora incarnata phitotherapic samples and in urine collected from a voluntary after of the administration of herbal medicine. The harmine was detected only in the phitotherapic sample. The norharmane, harmine and harmaline alkaloids were identified in Passion Fruit tea, which contained dry extract of Passiflora alata Dryander. In the second approach, a method for MLC was developed for the determination of galantamine and its main metabolites (N-demethyl galantamine, O-demethyl galantamine, epigalantamine and N-oxide galantamine). The separation was performed using a C18 chromatography column with porosity of 300 angstroms and with mobile phase consisting of buffer (pH 5.0) containing SDS (25 mmol L-1)/acetonitrile (97/3 percent v/v). The fluorimetric detection enabled LOD below 343 ng g-1 with intermediate precision and repeatability between 2.2 and 4 percent. Combined uncertainties for concentration of galantamine and metabolites were between 0.3 and 11 percent. Recovery experiments were performed on urine samples fortified with galantamine standards and metabolites with results between 91.4 and 114.8 percent. A comparison between the proposed MLC method and reverse phase high performance liquid chromatography was made using medicine samples containing galantamine hydrobromide as the active principle. Galantamine levels and variances achieved with these methods were statistically equal. The analytical curve sensitivity by MLC was two times higher than that found with reverse phase high performance liquid chromatography. Analysis of rat urine, collected after the administration of the medicine, were performed with the proposed method enabling the identification of galantamine, N-oxide galantamine and N-demethyl galantamine. To better evaluate the fluorescence amplification effect of galantamine in the organized environment, experiments were made with conventional chromatographic separation and post-column addition of the aqueous solution rich in micelles. The separation conditions included the use of C18 chromatographic column, mobile phase consisting of buffer (pH 5.0) containing 2 percent of propan-2-ol (v/v)/acetonitrile (80/20 percent v/v). The micellar solution of SDS (100 mmol L-1), added after the chromatographic column, was prepared with the same composition of the mobile phase. The column temperature was 25 degrees C and the sample volume was 20 uL. The sensitivity of the analytical curve of galantamine was three times higher when the micellar solution was mixed, proving that the organized environment favors the galantamine fluorescence even at flow regime. Recoveries with or without post-column mixing with the micelle rich solution were between 97.5 and 102.2 percent.