L’adhésion, la migration cellulaire et l’environnement stromal sont intimement liés pour garantir l’homéostasie du système immuno-hématopoïétique. Néanmoins, nos connaissances des mécanismes responsables du maintien de ce processus fonctionnel restent fragmentaires. Notre étude a permis de mieux caractériser le stroma ganglionnaire et médullaire dans lesquels nous avons démontré de nouveaux rôles immuno-régulateurs des molécules d’adhésion jonctionnelle JAM-B et JAM-C. Dans la zone T des ganglions lymphatiques, les cellules réticulaires fibroblastiques (FRC) sécrètent des composés de la matrice extracellulaire et des chimiokines homéostatiques, nécessaires à la migration intranodale des lymphocytes T naïfs. La génération de nouveaux anticorps monoclonaux a permis d’identifier une diversité phénotypique et fonctionnelle au sein de la population FRC. L’un d’entre eux reconnaît la Thrombomoduline permettant d’identifier une population de FRC exprimant les protéines JAM-C et PDGFRα. Cette population cellulaire, dénommée FRCDP (Double Positive) sécrète des chimiokines homéostatiques, ce qui la distingue de la population FRCDN (Double Negative). Les souris sauvages traitées avec l’anticorps anti-JAM-C présentent une diminution significative du taux intranodal des chimiokines CXCL12, CCL19, CCL21 affectant la recirculation des cellules T naïves. De façon similaire, les cellules stromales des niches hématopoïétiques fournissent un environnement fonctionnel, nécessaire à l’homéostasie du système hématopoïétique. Les molécules d’adhésion sont connues pour contrôler ces mécanismes. JAM-C est exprimée à la surface des cellules souches hématopoïétiques (CSH) mais son rôle dans l’hématopoïèse reste inconnu. Notre étude montre que la molécule JAM-B est exprimée par l’environnement médullaire et interagit spécifiquement avec JAM-C sur les CSH. Les souris déficientes pour le gène jam-b présentent une diminution du nombre de CSH quiescentes et une réponse accrue aux agents mobilisants, démontrant ainsi que le couple JAM-B/JAM-C est nécessaire au maintien et à la rétention des CSH dans la moelle osseuse. / Homeostasis of the immune and hematopoietic system is dependent of cell adhesion, cell migration and stromal environment. Nevertheless, the molecular mechanisms involved in the crosstalk between hematopoietic and stromal cells have remained elusive. Our studies allowed to better characterize lymph node (LN) and bone marrow (BM) stromal compartments through the demonstration that expression of junctional adhesion molecules (JAM) in these compartments is necessary for the maintenance of immune and hematopoietic homeostasis. In the T cell zone (LN), extracellular matrix and homeostatic chemokines are secreted by fibroblastic reticular cells (FRC) which control naive T cell migration. We have identified new FRC subsets using a monoclonal antibody based approach to identify new cell surface markers of stromal cells. We have found that the FRC population expressing JAM-C, Thrombomodulin and PDGFRα (FRCDP, for Double Positive) secretes homeostatic chemokines such as CCL21, CCL19 and CXCL12. In contrast, FRCDN (Double Negative) that lack JAM-C and Thrombomodulin expression do not. Functionally, we have shown that JAM-C controls the secretion of CCL21, CCL19 and CXCL12 by FRCDP and that anti-JAM-C treated mice exhibit a decrease of intranodal chemokine contents. These results suggest that JAM-C may regulate homeostasis through the control of homeostatic chemokine secretion. We therefore asked the question whether similar function for JAM-C or its ligand JAM-B may be identified in the bone marrow. In the BM, Hematopoietic Stem Cells (HSC) are maintained quiescent and undifferentiated in specific stromal structures called HSC niches. HSC/niche interactions via adhesion molecules and chemokines are known to be active player of HSC homeostasis. Recently, JAM-C expression by HSC has been reported, but its role in hematopoiesis has remained elusive. We have demonstrated that HSC interact with JAM-B expressed by BM stromal cells in a JAM-C dependent manner. Moreover, we have observed a decreased pool of quiescent HSC in jam-b deficient mice. Finally, we have found that jam-b deficient mice exhibit an increase in intramedullary CXCL12 content and an exacerbated response to mobilizing agents. Collectively, these data demonstrate that JAM-B and JAM-C play a dual function in lymph node and bone marrow microenvironments through the regulation of leuko-stromal adhesion and chemokine secretion.

Le récepteur activateur de NF-κB (RANK), membre de la famille des récepteurs au TNF, est connu pour son rôle dans l’homéostasie de l’os, mais joue aussi un rôle important dans le système immunitaire. J’ai tout d’abord étudié des outils permettant de cibler RANK/RANKL. J’ai caractérisé et comparé l’activité biologique de deux anticorps anti-RANK. J’ai également criblé une librairie de petites molécules pour identifier des inhibiteurs de l’interaction RANK/RANKL. Dans une deuxième partie, je me suis intéressée au rôle du ligand de RANK (RANKL) dans l’homéostasie du ganglion lymphatique. RANKL joue un rôle dans la différenciation des ostéoclastes mais son rôle dans la différenciation d’autres macrophages n’a pas été étudié. Nous avons étudié des souris déficientes pour RANKL dans les cellules marginales réticulaires (MRC) qui expriment RANKL de manière constitutive dans le ganglion adulte. Nous avons observé une diminution de la population de macrophages sous-capsulaires (SSM). Nous avons également montré que les cellules endothéliales lymphatiques (LEC) expriment l’intégrine alpha 2b (ITGA2b) et que cette expression est sensible à la présence de RANKL. / The TNF-family member Receptor Activator of NF-κB (RANK) is known for its role in bone homeostasis and is increasingly recognized as a central player in immune regulation. Firstly I looked for new molecular tools to target RANK/RANKL axis. I characterized and compared the biological activity of two anti-RANK antibodies. Moreover, I screened the Prestwick Chemical Library® of small molecules in order to identify inhibitors of RANK/RANKL interaction. Secondly, I studied the effect of the RANK/RANKL axis in lymph node homeostasis. RANKL is known to promote osteoclast differentiation but whether it also plays a role in the differentiation of other macrophage subsets is not known. We addressed this question by conditionally deleting RANKL from marginal reticular stromal cells (MRCs) that constitutively express RANKL in the lymph node. We observed impaired differentiation of the subcapsular sinus macrophages (SSMs). We also studied lymph node lymphatic endothelial cells (LECs) and showed that integrin alpha 2b (ITGA2b) is expressed by a lymph node subset of LECs and its expression is sensitive to RANKL.

RANKL (ligand du récepteur activateur de NF-KB) est un membre de la famille des TNF dont la signalisation passe par RANK et qui joue un rôle important dans la régulation immunitaire. Chez l'adulte, RANKL est exprimé constitutivement par des cellules réticulaires marginales (MRC) des ganglions lymphatiques. Comme les MRCs sont physiquement proches des lymphocytes B (LB) et ont été proposé d’être des précurseurs de cellules dendritiques folliculaires (FDC), RANKL pourrait jouer un rôle dans la différenciation du stroma associé aux LB et dans la réponse humorale. Afin de mieux comprendre la fonction de RANKL exprimé par les MRC, nous avons généré des souris déficitaires pour RANKL dans les cellules stromales. Nous avons constaté que la formation du follicule B était perturbée ainsi que le réseau FDC. Bien que RANKL ne soit pas requis pour la formation des MRC, il est nécessaire pour l'expression de la chimiokine CXCL13 par ces mêmes cellules. Parmi les TNFRSF dont la signalisation est requise pour l’expression de CXCL13 et la différenciation des FDC, le TNFR1 était significativement réduit dans les cellules stromales des souris dépourvues de RANKL stromal. Ainsi, RANKL pourrait constituer une nouvelle cible thérapeutique contre les immunopathologies des LB en agissant sur son stroma. / RANKL (receptor activator of NF-κB ligand), a member of the TNF family that signals via RANK, plays an important role for immune regulation. In the adult, RANKL is constitutively expressed by marginal reticular cells (MRCs) of the lymph nodes. Because MRCs are positioned in close vicinity to B cells and may be precursors of follicular dendritic cells (FDCs), RANKL could play a role in the differentiation of B cell-associated stroma and the humoral immune response. In order to better understand the role of RANKL expressed by the MRCs, we generated mice with conditional RANKL deficiency in the stromal compartment. We found that the B cell follicle structure was disrupted and FDC network formation was reduced. Although RANKL was not required for MRC formation, it was necessary for the expression of B cell attracting chemokine CXCL13. Among the TNFRSF members known to control CXCL13 expression and FDC formation, we found that TNFR1 was significantly reduced in the RANKL cKO mice. Thus, RANKL may present a novel therapeutic strategy against B cell-mediated immunopathologies by acting on its stroma.

Afin d'accélérer et automatiser l'analyse par ultrasons quantitatifs de ganglions lymphatiques de patients atteints d'un cancer, plusieurs segmentations automatiques des trois milieux rencontrés (le parenchyme du ganglion, la graisse périnodale et le sérum physiologique) sont étudiées. Une analyse statistique du signal d'enveloppe a permis d'identifier la distribution gamma comme le meilleur compromis en termes de qualité de la modélisation, simplicité du modèle et rapidité de l'estimation des paramètres. Deux nouvelles méthodes de segmentation basées sur l'approche par ensemble de niveaux et la distribution gamma sont décrites. Des statistiques locales du signal d'enveloppe permettent de tenir compte des inhomogénéités du signal dues à l'atténuation et la focalisation des ultrasons. La méthode appelée LRGDF modélise les statistiques du speckle dans des régions dont la taille est contrôlable par une fonction lisse à support compact. La seconde, appelée STS-LS, considère des coupes transverses, perpendiculaires au faisceau, pour gagner en efficacité. Une troisième méthode basée sur la classification par forêt aléatoire a été conçue pour initialiser et accélérer les deux précédentes. Ces méthodes automatiques sont comparées à une segmentation manuelle effectuée par un expert. Elles fournissent des résultats satisfaisants aussi bien sur des données simulées que sur des données acquises sur des ganglions lymphatiques de patients atteints d'un cancer colorectal ou du sein. Les paramètres ultrasonores quantitatifs estimés après segmentation automatique ou après segmentation manuelle par un expert sont comparables. / This work investigates approaches to obtain automatic segmentation of three media (i.e., lymph node parenchyma, perinodal fat and normal saline) in lymph node (LN) envelope data to expedite quantitative ultrasound (QUS) in dissected LNs from cancer patients. A statistical modeling study identified a two-parameter gamma distribution as the best model for data from the three media based on its high fitting accuracy, its analytically less-complex probability density function (PDF), and closed-form expressions for its parameter estimation. Two novel level-set segmentation methods that made use of localized statistics of envelope data to handle data inhomogeneities caused by attenuation and focusing effects were developed. The first, local region-based gamma distribution fitting (LRGDF), employed the gamma PDFs to model speckle statistics of envelope data in local regions at a controllable scale using a smooth function with a compact support. The second, statistical transverse-slice-based level-set (STS-LS), used gamma PDFs to locally model speckle statistics in consecutive transverse slices. A novel method was then designed and evaluated to automatically initialize the LRGDF and STS-LS methods using random forest classification with new proposed features. Methods developed in this research provided accurate, automatic and efficient segmentation results on simulated envelope data and data acquired for LNs from colorectal- and breast-cancer patients as compared with manual expert segmentation. Results also demonstrated that accurate QUS estimates are maintained when automatic segmentation is applied to evaluate excised LN data.