Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-08-14T19:25:40Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Nayara de Sá Oliveira.pdf: 5733900 bytes, checksum: f0c0c981923cca5d8657a1b86859e181 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-14T19:25:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Nayara de Sá Oliveira.pdf: 5733900 bytes, checksum: f0c0c981923cca5d8657a1b86859e181 (MD5) / FAPESB;CAPES / O Norovírus (NoV), considerado uma das maiores causas de gastrenterite aguda não-bacteriana, é um vírus eliminado em pouca quantidade nas fezes e não cultivável em células, o que dificulta a obtenção de antígeno para produção de anticorpos monoclonais (AcM). Este trabalho propõe a obtenção desse antígeno diretamente de fezes, com uma metodologia de semi-purificação viral, através de filtrações esterilizantes e precipitação com polietileno glicol (PEG). O NoV precipitado com PEG manteve a sua antigenicidade, oferecendo excelentes condições para a produção e obtenção de seis AcM. Os AcM foram caracterizados pela técnica de Western Blot, onde foi demonstrada uma forte reatividade com uma banda de 60KDa, compatível com a proteína viral VP1, principal proteína que forma o capsídeo. Os AcM também foram capazes de detectar o vírus em amostras fecais coletadas de pacientes com gastrenterite aguda, utilizando-se a técnica de Dot-blot. O Dot-blot, quando comparado ao RT-PCR, padrão ouro para o diagnóstico do NoV, apresentou uma sensibilidade de 74% e especificidade de 47%. Este trabalho demonstra que os AcM reagiram fortemente com a proteína viral VP1 e que podem ser úteis na detecção do NoV nas fezes através da técnica de Dot-blot. Novos estudos devem ser realizados para verificar o potencial uso desses AcM para o diagnóstico do NoV. / Salvador

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-11-24T12:30:07Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_CaracterizacaoInfeccoesNorovirus.pdf: 2416800 bytes, checksum: 3797621a13f8e90a9a632432df5f4151 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-12-01T15:38:36Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_CaracterizacaoInfeccoesNorovirus.pdf: 2416800 bytes, checksum: 3797621a13f8e90a9a632432df5f4151 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-01T15:38:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_CaracterizacaoInfeccoesNorovirus.pdf: 2416800 bytes, checksum: 3797621a13f8e90a9a632432df5f4151 (MD5) Previous issue date: 2012-04-20 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O Norovirus (NoVs), pertencente a família Caliciviridae, ocasiona quadro de gastrenterite aguda (GEA) em pessoas de todas as faixas etárias. Sua relevância como causa de surtos já está confirmada, os quais ocorrem principalmente em locais fechados. Sua transmissão é, sobretudo, pela via fecal-oral, por meio da ingestão de água/alimentos contaminados e contato pessoa-a-pessoa. A doença em geral se manifesta de forma súbita, caracterizada por diarreia, vômito, náusea e cólica abdominal. O objetivo deste estudo foi demonstrar a importância dos NoVs como patógenos associados às internações de crianças com quadro de GEA em Belém, Pará. A coleta dos espécimes fecais ocorreu de maio/2008 a abril/2011, sendo examinados somente aqueles com resultados negativos para rotavírus. Para a detecção dos NoVs foi utilizado o ensaio imunoenzimático (EIA) e a reação em cadeia mediada pela enzima polimerase e precedida de transcrição reversa (RT-PCR). As amostras com resultado positivo no EIA e negativo na RT-PCR foram submetidas a semi-nested RT-PCR, e aquelas que permaneceram negativas foram testadas pela PCR em tempo real. Foram analisadas 483 amostras, sendo observada uma positividade de 35,4% (171/483). Adotando-se a RT-PCR como o método de referência, o EIA apresentou sensibilidade de 85,9% e especificidade de 93,4%, com excelente reprodutibilidade entre ambas (Kappa= 0.8, p<0.0001). As 22 amostras positivas apenas por EIA foram testadas pela semi-nested RT-PCR e PCR em tempo real, sendo observada positividade de 63,6% (14/22) e 75% (6/8), respectivamente. O sequenciamento nucleotídico parcial da região da ORF1 demonstrou a circulação dos genótipos GII.4d (80,8%-42/52), GII.7 (7,7%-4/52) e GII.b (11,5%-6/52). Foi realizado o sequenciamento de 64,3% (9/14) das amostras positivas somente pela semi-nested RT-PCR, também correspondente a ORF1, sendo 55,6% (5/9) classificadas como GII.4d e 44,4% (4/9) como GII.b. Das 6 amostras classificadas como GII.b, cinco foram caracterizadas como GII.3 quando sequenciadas com iniciadores específicos da região do capsídeo viral, sugerindo a possibilidade de se tratarem de amostras recombinantes. Foi observada maior taxa de infecção nas crianças menores de 2 anos de idade (90,1%-154/171) e os principais sintomas observados foram vômito (95,8%-137/143) e desidratação (94,4%-118/125), considerando que a diarreia foi critério de inclusão. A maioria das crianças infectadas apresentou mais de 9 dias de diarreia (41,2%), 4 evacuações diárias (43,9%) e mais de 5 episódios de vômito (90%) no período de internação. Com relação à sazonalidade, foram observados três picos de positividade, em setembro e outubro de 2008 (63,6%); e em fevereiro de 2010 (62,1%), não sendo notada nenhuma correlação com os parâmetros climáticos de pluviosidade, umidade e temperatura. Com este estudo, demonstrou-se a importância dos NoVs como enteropatógenos virais associados à GEA em crianças hospitalizadas em Belém, indicando a necessidade de uma vigilância ativa, a fim de evitar maior morbidade e possível mortalidade ocasionada por esse vírus na população infantil. / The Norovirus (NoVs), Caliciviridae family, is related with acute gastroenteritis (AGE) in people of all ages groups. Its importance as cause of outbreaks have been confirmed, which occur mainly indoors. Its transmission is mainly by the fecal-oral route through contaminated water and food, and person to person contact. The disease usually is characterized by diarrhea, vomiting, nausea and abdominal cramps. The aim of this study was to demonstrate the importance of NoVs as pathogen associated with hospital admissions of children with AGE in Belém, Pará. The collection of fecal specimens occurred from May 2008 to April 2011, being only tested the samples with negative results for rotavirus. The enzyme immunoassay (EIA) and the reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) were used for NoVs detection. The samples with positive results by EIA and negative by RT-PCR, were submitted to the semi-nested RT-PCR, and the ones with remain negative, were tested by the real-time PCR. A total of 483 samples were analyzed with a positivity of 35.4% (171/483). Adopting the RT-PCR as the reference method, the EIA had a sensitivity of 85.9% and a specificity of 93.4% with excellent reproducibility between them (kappa = 0.8, p <0.0001). The 22 samples positive only by EIA were tested first by semi-nested RT-PCR and after by real-time PCR, with a positivity of 63.6% (14/22) and 75% (6/8), respectively. The partial nucleotide sequencing of ORF1 region demonstrated the presence of GII.4d (80.8%-42/52), GII.7 (7.7%-4/52) and GII.b (11.5%-6/52) genotypes. Sequencing was performed in 64.3% (9/14) of the samples positive only by semi-nested RT-PCR, also corresponding to ORF1, which 55.6% (5/9) were classified as GII.4d and 44.4% (4/9) as GII.b. Of the six samples classified as GII.b, five were characterized as GII.3 when sequenced with primers specifics for the capsid region, suggesting the possibility of recombinants samples. A higher infection rate was observed in children under 2 years of age (90.1%-154/171) and the main symptoms were vomiting (95.8%-137/143) and dehydration (94.4%-118/25), considering the diarrhea was an inclusion criterion. Most infected children had more than 9 days of diarrhea (41.2%), 4 evacuations per day (43.9%) and more than 5 episodes of vomiting (90%) during hospitalization. Regarding seasonality, three peaks of positivity were observed in September and October 2008 (63.6%), and in February 2010 (62.1%). Any correlation with the climatic parameters of rainfall, humidity and temperature was demonstrated. This study confirmed the importance of NoVs as viral enteropathogen associated with AGE among hospitalized children in Belém, imposing the necessity of an active surveillance, in order to avoid possible morbidity caused by this virus in childhood.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-11-24T12:08:10Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_RotavirusGrupoAssociado.pdf: 2321435 bytes, checksum: 5d7f4e71d83f157a0d44069765101d96 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-12-01T14:57:13Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_RotavirusGrupoAssociado.pdf: 2321435 bytes, checksum: 5d7f4e71d83f157a0d44069765101d96 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-01T14:57:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_RotavirusGrupoAssociado.pdf: 2321435 bytes, checksum: 5d7f4e71d83f157a0d44069765101d96 (MD5) Previous issue date: 2014-07-30 / A gastrenterite aguda (GA) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade, sendo o rotavírus um dos agentes causadores de GA, o qual é responsáveis por cerca de 38,3% dos casos de hospitalizações, resultando em 197.000 óbitos de crianças menores de cinco anos anualmente, principalmente nos países em desenvolvimento. O rotavírus pertence à família Reoviridae, gênero Rotavirus, possuem genoma dividido em 11 segmentos de RNA de fita dupla (dsRNA) e é classificado em oito grupos/espécies sorológicos distintos (A ao H). O mais comumente encontrado pertence ao grupo/espécie A (RVA), contudo o rotavírus do grupo/espécie C (RVC) vem assumindo importância nas gastrenterites e, geralmente, se relaciona a quadros de diarreia infantil de curso autolimitado, com possível transmissão de suínos. Este estudo visou detectar o RVC em crianças menores de três anos de idade hospitalizadas com gastrenterite aguda em Belém, Pará. Para tanto, de maio de 2008 a abril de 2011, uma vigilância intensiva para gastrenterite aguda (GA) foi realizada em um hospital pediátrico de Belém. Foram coletadas amostras de fezes de crianças com GA, das quais 279 amostras apresentavam resultados negativos para RVA e/ou norovírus (NoV). Nestas, o ácido nucléico foi extraído a partir da suspensão fecal pelo método de sílica sendo reversamente transcrito e amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR), utilizando os pares de iniciadores G8S/G8A para VP7; C1/C4 para VP6; T434/T435 para VP4; e NSP4(+)/(-) para NSP4. O Controle positivo (protótipo Cowden) e o negativo (água) foram utilizados em todos os testes. Foi realizado o sequenciamento automático e a análise filogenética subsequente. Os dados foram analisados através de testes estatísticos de qui-quadrado partição, exato de Fisher e regressão logística simples com valores de p ≤ 0,05. A positividade para o RVC foi de 2,1% (6/279) pelo EGPAe RT-PCR. Posteriormente, foram submetidas ao sequenciamento automático e classificadas nos genótipos I2, G4, P[2] e E2 para os genes VP6, VP7, VP4 e NSP4, respectivamente. A frequência de RVC foi maior na faixa etária de 24 a 36 meses (5,7%) com p estatisticamente significativo (p = 0,0493). O gênero mais acometido pelo RVC foi o masculino com frequência de 83,3%. Os sinais e/ou sintomas clínicos mais frequentes em crianças com RVC foi febre (80%), vômito (83,3%) e desidratação (100%). Portanto, neste estudo foi possível a caracterização e análise filogenética de VP6, VP7, VP4 e NSP4 desse vírus em crianças hospitalizadas com gastrenterite, fornecendo dados importantes quanto à circulação desses agentes em crianças hospitalizadas com gastrenterite na região metropolitana de Belém, Pará. / Acute gastroenteritis (AG) is a major cause of morbidity and mortality of children worldwide, being rotavirus one of the causative agents of AG, responsible for about 38.3% of the cases of hospitalization, resulting in 197,000 deaths of children under five years annually, mostly in developing countries. Rotavirus belongs to the family Reoviridae, genera Rotavirus, have genome composed by 11 segments of double-stranded RNA (dsRNA) and are classified into eight groups/different species (A to H).The most commonly found belongs to the group/species A (RVA), however rotavirus group/species C (RVC) has assumed importance in gastroenteritis and usually relate to self-limiting course of childhood diarrhea, with possible transmission from pigs. This study aims to detect the RVC in children less than three years of age hospitalized with acute gastroenteritis in Belém city, Pará state, Amazon region, Brazil. From May 2008 to April 2011, an intensive surveillance for AG was performed in a pediatric hospital of Belém in children with AG, of which 279 samples had negative results for RVA and norovirus. Accordingly, the nucleic acid was extracted from the fecal suspension with silica by the method of reverse transcribed and amplified by polymerase chain reaction (PCR) using primer pairs specific for the VP7 gene G8S/G8A; C1/C4 for VP6; T434/T435 for VP4; and NSP4 (+)/(-) specific for NSP4 gene. The positive control (prototype Cowden) and negative control (water RNAse free) were used in all tests. Automatic sequencing and subsequent phylogenetic analysis were performed. Data were analyzed using statistical chi-square partition, Fisher's exact test and simple logistic regression with p values ≤ 0.05. The positive rate for RVC was 2.1% (6/279) by PAGE and RT-PCR and posteriorly, submitted to automated sequencing and classified in genotypes I2, G4, P[2] and E2 for VP6, VP7, VP4 and NSP4 genes, respectively. The frequency of RVC was higher in the age group between 24 to 36 months (5.7%) (p= 0.0493). Gender more affected by RVC was the male with a frequency of 83.3%. Signs and/or symptoms most frequent in children with RVC were fever (80%), vomiting (83.3%) and dehydration (100%). In summary, in this study it was possible the characterization and phylogenetic analysis of VP6, VP7, VP4 and NSP4 genes, providing important data regarding the presence of these agents in hospitalized children with gastroenteritis in the metropolitan region of Belém, Pará.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-09-11T18:22:38Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_EpidemiologiaMolecularInfeccoes.pdf: 1611630 bytes, checksum: d3d55c86e67ed9a4c1f3deecffe60f53 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-09-26T14:15:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_EpidemiologiaMolecularInfeccoes.pdf: 1611630 bytes, checksum: d3d55c86e67ed9a4c1f3deecffe60f53 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-26T14:15:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_EpidemiologiaMolecularInfeccoes.pdf: 1611630 bytes, checksum: d3d55c86e67ed9a4c1f3deecffe60f53 (MD5) Previous issue date: 2017-02-10 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / As gastrenterites são a terceira causa de morbi-mortalidade infantil no mundo, sobretudo entre os menores de 5 anos de idade. Os adenovírus (HAdV) são vírus icosaédricos não envelopados, têm 240 proteínas “hexon” específicas e DNA de fita dupla. Pertencem à família Adenovidae, gênero Mastadenovirus e estão distribuídos em 7 espécies (A a G) e 57 sorotipos. Estudos epidemiológicos detectaram HAdV em 2 a 14% dos casos de diarreia aguda infantil em hospitais e ambulatórios clínicos. O objetivo deste estudo foi detectar a prevalência, definir o perfil epidemiológico e os tipos de HAdV em crianças hospitalizadas com quadro de gastrenterite e vacinadas contra rotavírus. Foram analisadas 842 amostras fecais, coletadas no período de maio de 2009 a abril de 2011 em Belém, PA, utilizando-se as técnicas de ensaio imunoenzimático e imunocromatografia para triagem e PCR e sequenciamento de nucleotídeos para tipagem e identificação molecular. Os HAdVs foram encontrados em 7,2% (61/842) das amostras testadas, com os adenovírus entéricos (AdE) equivalendo a 50,8% (31/61) dos casos positivos. A análise quanto ao gênero das crianças infectadas demonstrou 7,7% (28/362) de casos do sexo feminino e 6,8% (33/480) do sexo masculino. A positividade para HAdV por faixa etária dos pacientes analisados detectou maior prevalência entre os maiores de 24 meses de idade, correspondendo a 8,9% (16/178). Quanto à distribuição temporal dos HAdV, o mês de junho foi o de maior prevalência, com 11,4% (8/70) do total de casos. A reação de sequenciamento de oligonucleotídeos caracterizou a espécie F como mais prevalente em nossa região, equivalendo a 64,5% (29/45) das amostras sequenciadas, com o tipo 41 detectado em 69% (20/29) dos casos positivos para a espécie F e 31% (9/29) caracterizados como tipo 40. Os resultados obtidos neste estudo confirmam os HAdV infectando uma proporção significativa de menores de 3 anos hospitalizados na cidade de Belém, Pará, demonstrando a importância do estabelecimento de uma vigilância, sobretudo após a implantação da vacina contra rotavírus no Brasil. / Gastroenteritis are the third cause of infant morbidity and mortality worldwide, especially among children under 5 years old. Adenoviruses (HAdV) are icosahedral non-enveloped viruses, possess 240 proteins "hexon" specific and a double-stranded DNA. They belong to the Adenoviridae family, Mastadenovirus genus, and are assigned to 7 species (A to G) and 57 serotypes. Epidemiological studies found that HAdVs account for 2-14% of cases of acute childhood diarrhea in hospitals and outpatient units. The aim of this study was to determine the prevalence and to assess the epidemiological features of of HAdV infection, as well as the occurrence of types in 842 children under three years of age, hospitalized for acute gastroenteritis in Belém, Brazil. All of these children had been vaccinated against rotavirus.These children were selected from a previous rotavirus vaccine case-control study conducted at Instituto Evandro Chagas, Belém, Pará, from May 2009 to April 2011. ELISA and immunochromatography were used for HAdV screening in stool samples and PCR and oligonucleotide sequencing for typing and molecular characterisation. HAdVs were found in 7.2% (61/842) of the tested samples, with the enteric adenoviruses (EAD) accounting for 50.8% (31/61) of the HAdV positive cases. The distribution of HAdV according to the gender showed that 7.7% (28/362) of whom were female and 6.8% (33/480) were male. The highest prevalence rates of HAdV infection were seen among patients older than 24 months of age, corresponding to 8.9% (16/178) of all positive cases. In regards to the temporal distribution, the highest prevalence rate was observed in June, representing 11.4% (8/70) of cases overall. The oligonucleotide sequencing showed that HAdV species F was predominant in our region, accounting for 64.5% (29/45) of the sequenced samples. These samples included HAdV types 41 and 40, detected at rates of 69% (20/29) cases and 31% (9/29), respectively. The results of this study indicate that HAdV accounts for a significant proportion of gastroenteritis among hospitalized children aged less than 3 years, during a post-rotavirus vaccine introduction period in Belém, Pará state, Brazil.