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Abordagem Bayesiana na análise genética de populações utilizando dados de marcadores moleculares. / Bayesian approach to the genetic analysis of populations using molecular markers data.Alexandre Siqueira Guedes Coelho 27 August 2002 (has links)
Dentre os diversos aspectos geralmente observados na caracterização genética de populações naturais, a avaliação do grau de estruturação da variabilidade genética entre e dentro dos indivíduos e a obtenção de estimativas de parâmetros genéticos indicadores do sistema reprodutivo da espécie assumem grande importância. Os parâmetros de maior interesse neste caso são o índice de fixação intrapopulacional (f) e a taxa de fecundação cruzada (t). Pelo uso de simulações computacionais, este trabalho demonstra o caráter dinâmico do índice de fixação intrapopulacional em diferentes locos ao longo das gerações em decorrência do caráter finito da população e de variação nas taxas médias de fecundação cruzada entre gerações. Sugere-se que este caráter dinâmico representa uma explicação para a elevada variação, comumente reportada na literatura, das estimativas de f obtidas com locos diferentes avaliados em uma mesma população. Utilizando a abordagem Bayesiana, um modelo hierárquico de análise é proposto para a estimação de f, incorporando as informações obtidas de múltiplos locos não ligados, levando-se em conta a condicionalidade do processo de estimação ao polimorfismo dos locos utilizados. O modelo proposto incorpora o caráter dinâmico de f para diferentes locos e permite a estimação do número efetivo de indivíduos reprodutivamente ativos em uma população. Propõe-se ainda um modelo Bayesiano para a estimação da taxa de fecundação cruzada com base na informação de múltiplos locos, admitindo-se a possibilidade de ocorrência de apomixia. Os modelos propostos são avaliados por simulação e exemplos de aplicação a dados reais de marcadores moleculares codominantes são discutidos. Os resultados obtidos demonstram a aplicabilidade das metodologias propostas e o elevado potencial de aplicação da estatística Bayesiana em estudos de genética de populações. / Among the various aspects generally considered in the genetic characterization of natural populations of plant species, the evaluation of the degree of genetic structure within and among individuals and the estimation of parameters related to the species mating system are of great importance. In general, considerable effort is focused on the estimation of the intrapopulation fixation index (f) and the outcrossing rate (t). Using computer simulated data, the dynamic nature of f for different loci along generations is illustrated. The dynamic nature of f is shown to result from the finite condition of populations and from the variation in the mean values of the outcrossing rates among generations. It is suggested that this dynamic behavior explains the inconsistency, commonly reported in the literature, of f estimates obtained for different loci in a given population. Using a Bayesian approach, we propose a hierarchical model for the estimation of f, incorporating information obtained from different unlinked loci and considering the conditionality of the estimation process to genetic polymorphism. The proposed model incorporates the dynamic nature of f values for different loci and allows the estimation of the effective number of reproductively active individuals in a given population. Using a similar approach, a Bayesian model is also proposed for estimating the outcrossing rate using multiple loci information and incorporating the possibility of apomixis. The models proposed are evaluated by computer simulations and examples using real data from codominant molecular markers are presented. Results obtained illustrate the applicability of the proposed methods and reveal the great potential of use of Bayesian statistics in population genetic studies.
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Desenvolvimento e uso de marcadores microssatélites para construção e integração de mapas genéticos de maracujá-amarelo (Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Deg.) / Development of microsatellite markers and their use for the generation and integration of genetic maps of yellow passion fruit (Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Deg.)Eder Jorge de Oliveira 20 April 2006 (has links)
O maracujá-amarelo é uma espécie alógama, auto-incompatível, o que prejudica a geração de linhagens endogâmicas e, por conseqüência, a construção e integração de mapas de ligação pelas metodologias convencionais. A exemplo do que tem sido feito em outras espécies vegetais, populações F1 (com diferentes tipos de segregação) foram utilizadas para a construção dos mapas genéticos de maracujá. Mapas individuais para cada genitor do cruzamento foram gerados fazendo uso apenas de marcas com segregação 1:1. A integração desses mapas é possível com base em marcadores bi-parentais, quando ambos os genitores são heterozigóticos para os mesmos alelos que segregam na proporção 3:1 em F1. Apesar disso, o uso de marcadores codominantes e multialélicos, como os microssatélites, possuem maior valor, uma vez que permite a obtenção de estimativas de freqüência de recombinação e da fase de ligação com um menor viés. O objetivo deste estudo foi o desenvolvimento de marcadores microssatélites utilizando bibliotecas genômicas enriquecidas, visando à construção e a integração de mapas genéticos de maracujáamarelo. Foram usadas 160 plantas oriundas do cruzamento entre os acessos IAPAR-123 x IAPAR-06, marcadores AFLP com segregação 1:1 e 3:1 e marcadores microssatélites desenvolvidos no presente estudo. Para a construção dos mapas utilizou-se um algoritmo que estima, simultaneamente, a fase de ligação e a freqüência de recombinação. A biblioteca genômica enriquecida forneceu 107 clones contendo microssatélites, com uma eficiência de enriquecimento da ordem de 11%. Todas as seqüências contendo microssatélites foram analisadas e 26 locos mostraram-se polimórficos: 16 deles segregaram na proporção de 1:1; 1 na proporção de 3:1; 2 na proporção de 1:2:1 e 7 na proporção de 1:1:1:1. Com relação aos dados de AFLP, 253 locos mono-parentais (em 114 deles, o alelo dominante estava presente no genitor 06 e 139, no genitor 123) mostraram-se polimórficos com segregação 1:1. Outros 116 locos mostraram-se bi-parentais, segregando na proporção de 3:1. Foram obtidos 11 grupos de ligação (GL) sendo 8 grupos integrados e um GL com apenas dois marcadores. Também, um GL para cada genitor foi obtido, cuja integração não foi possível por falta de marcadores bi-parentais. Foi possível alocar no framework dos mapas genéticos, além dos microssatélites, as marcas de AFLP com segregação do tipo 3:1, que contribuíram para uma maior saturação e integração de oito dos nove grupos de ligação de maracujá-amarelo (2n = 18). Foram obtidos, em média, 25 marcadores por GL, que forneceram um comprimento de mapa de 1.765,6 cM. Este é o primeiro relato em Passiflora sobre o uso de marcadores microssatélites e do algoritmo proposto por Wu et al. (2002) visando à integração dos mapas anteriormente construídos com base na estratégia duplo pseudocruzamento teste. Este mapa integrado será útil na alocação de QTL (Quantitative Trai Loci) relacionados à resistência a doenças e a características de interesse agronômico, assim como para estudos genéticos e evolutivos. / The yellow passion fruit is an out-breeding, self-incompatible species, but those features impose severe constraints on the generation of inbred lines, consequently impairing the building and integration of linkage maps using conventional methodologies. Similar to the reports from other plant species, F1 populations (with distinct segregation modes) were used to build passion fruit genetic maps. Individual maps, one for each parent involved in the cross were generated solely employing genetic markers with 1:1 segregation. However, the integration of those maps is feasible using bi-parental markers, i.e. when both parents are heterozygous for the same alleles that show 3:1 segregation in F1. However, the use of co-dominant multi-allele markers, such as the microsatellites is even more important, since it allows recombination frequency and linkage phase estimates to be obtained less effected by bias. The goal of this research was the development of microsatellite markers using enriched genomic libraries for constructing and integrating genetic maps of yellow passion fruit. We have used 160 plants from a cross between the accessions IAPAR-123 x IAPAR-06, AFLP markers showing 1:1 and 3:1 segregations and microsatellite markers developed in the present work. The maps were built employing an algorithm that simultaneously estimates the linkage phase and the recombination frequency. The enriched library allowed us to obtain 107 microsatellite-containing clones, at an enrichment efficiency of 11%. All microsatellite-containing sequences were analyzed and 26 loci were shown to be polymorphic: 16 of them with a 1:1 segregation; 1 with a 3:1 segregation, 2 showing a 1:2:1 proportion and 7 with a 1:1:1:1 segregation pattern. In relation to the AFLP data, 253 mono-parental loci were shown to be polymorphic with a 1:1 segregation proportion (in 114 loci the dominant allele was present in the parent 06, and in 139 loci, the dominant allele was found in the parent 123). The remaining 116 loci were shown to be bi-parental, segregating in a 3:1 proportion. Eleven linkage groups (LG) were obtained, 8 of them being integrated and one LG with only two markers. Moreover, one LG for each parent was obtained, but due to the absence of bi-parental markers they were not integrated. It was possible to locate on the framework of the genetic maps, along with the microsatellites those AFLP markers showing a 3:1-segregation type, which contributed to a greater level of map saturation and to the integration of eight of the nine linkage groups of yellow passion fruit (2n=18). On average, we have obtained 25 markers per LG, providing a map distance of 1,765.6 cM. This is the first report in Passiflora on the use of microsatellite markers and the algorithm proposed by Wu et al. (2002) to integrate maps previously constructed using the double pseudo-testcross strategy. The integrated map will be useful for locating QTL (Quantitative Trai Loci) related to disease resistance and agriculturally interesting traits, as well as to provide tools for genetic and evolutionary studies.
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Genética da reação da soja a Fusarium solani f.sp. glycines. / Genetics of soybean reaction to Fusarium solani f.sp. glycines.Fronza, Vanoli 04 April 2003 (has links)
Na última década, a podridão vermelha das raízes da soja (PVR), ou síndrome da morte súbita, causada pelo fungo Fusarium solani f.sp. glycines, tornou-se uma doença que é motivo de preocupação para os sojicultores, técnicos e pesquisadores nas regiões onde esta doença já foi constatada, sendo a única estratégia de controle viável a utilização de cultivares resistentes. Diante disto, o principal objetivo do presente trabalho foi o estudo do controle genético da reação da soja a PVR por meio de técnicas de genética clássica e molecular. Foi utilizada a geração F2 de um dialelo 5x5, sem os recíprocos, envolvendo cinco cultivares: Forrest, MG/BR-46 (Conquista), IAC-4, FT-Cristalina e FT-Estrela, sendo as duas primeiras mais resistentes a PVR que IAC-4, considerada moderadamente resistente e, as duas últimas, altamente suscetíveis. Além de testes de inoculação com as cultivares, foram conduzidos três experimentos com a geração F2: um em telado (semeadura em julho de 2001) e dois em casa de vegetação (semeadura em setembro de 2001 e julho de 2002), sendo os dois primeiros em blocos ao acaso e o terceiro no delineamento inteiramente casualizado. O patógeno foi inoculado com grãos de sorgo colonizados, colocando-se três grãos no fundo de cada cova, no momento da semeadura, fazendo-se cinco covas por vaso, cada qual constituindo uma parcela com cinco plantas. Em cada experimento, foram avaliadas individualmente 50 plantas de cada genitor e 150 plantas de cada cruzamento F2, entre os 30 e 40 dias após a emergência, utilizando-se uma escala de notas de 1 a 5 para a severidade dos sintomas foliares da PVR. A porcentagem de incidência da doença em cada parcela e um índice de doença também foram calculados. Nas análises de variância com os dados de médias de parcelas, observaram-se diferenças altamente significativas entre os genitores e entre populações F2 para a severidade e índice de doença dos sintomas foliares, na maioria dos casos, embora os genitores resistentes e suscetíveis não foram muito contrastantes. As cultivares Forrest e Conquista comportaram-se sempre como resistentes, e Cristalina e Estrela como suscetíveis, enquanto que IAC-4 apresentou comportamento instável. Pela análise dialélica de Jinks-Hayman reafirmou-se a influência do ambiente sobre o controle da resistência à manifestação dos sintomas foliares da PVR, a qual foi controlada quantitativamente. Nos experimentos de 2001, constatou-se apenas a ação de efeitos gênicos aditivos. Porém, no experimento conduzido em telado, a resistência demonstrou controle por genes recessivos, enquanto que na casa de vegetação, na maior parte, por genes dominantes. No experimento de 2002 constatou-se a presença de efeitos gênicos aditivos e de dominância, predominando o efeito destes últimos. Assim, com base no experimento de 2002, para o grupo de cultivares estudado, os parâmetros genéticos calculados permitiram verificar que: o grau médio de dominância indicou a presença de sobredominância; predominaram genes recessivos no grupo dos genitores; pelo menos três locos ou blocos gênicos que exibiram dominância foram responsáveis pelo controle da resistência a PVR; as herdabilidades estimadas no sentido restrito foram médias (0,33 a 0,62) e, no sentido amplo, altas (0,90 a 0,96), confirmando a presença de dominância; a resistência foi controlada, na maior parte, por genes dominantes e a ordem decrescente de dominância das cultivares foi a seguinte: 'Conquista', 'Cristalina', 'Forrest', 'Estrela' e 'IAC-4'; a exclusão de 'Cristalina', por suspeita de apresentar distribuição de genes correlacionada com 'Conquista' e 'Estrela', melhorou a adequação dos dados de índice de doença ao modelo genético aditivo-dominante de Jinks-Hayman. A utilização de cinco marcadores moleculares microssatélites (Satt163, Satt309, Satt354, Satt371 e Satt570), relatados como ligados a cinco QRLs da PVR, indicou a provável presença de multialelismo nestes locos, o que não invalidou a adequação dos dados ao modelo de Jinks-Hayman. Pela análise de ligação entre 126 indivíduos F2 do cruzamento 'Conquista' x 'Estrela' com os marcadores Satt163 e Satt354, no experimento conduzido em telado, houve ligação fraca (P<0,10) entre estes locos e os respectivos QRLs, havendo tendência dos alelos recessivos serem os responsáveis pelo controle da resistência nestes dois locos, concordando com os resultados da análise dialélica para este experimento. / In order to study the genetic control of soybean resistance to sudden death syndrome (SDS) by classical and molecular genetic techniques a 5x5 diallel with the F2 generation, without the reciprocals, was carried out. The following parents were used: 'Forrest', 'MG/BR-46 (Conquista)', 'IAC-4', 'FT-Cristalina' and 'FT-Estrela'. The first two cultivars are more resistant to SDS than 'IAC-4', that is considered to be moderately resistant to SDS, and the last two cultivars are highly susceptible. Tests of inoculation were done with the cultivars and three experiments with the F2 generation (two in 2001 and one in 2002) were carried out, all of them in greenhouses. The fungus was inoculated by three colonized sorghum grains placed at the bottom of the holes at the planting. It was used five-holes/clay pot, which one was considered a plot with five plants. In each experiment with the F2 generation 50 single plants of each parent and 150 single plants of each F2 population were evaluated between 30 and 40 days after emergency by using a scale (1 to 5) based on foliar severity symptoms. The disease incidence and a disease index also were calculated for each plot. In the ANOVAs with data plot average for severity and disease index highly significant differences were detected among the treatments in almost all cases, although the resistant and the susceptible parents did not differ too much. The parents 'Forrest' and 'Conquista' were always more resistant than the others. 'Cristalina' and 'Estrela' were the most susceptible parents, while 'IAC-4' was unstable. Jinks-Hayman's analysis reaffirmed the environment effect on the genetic control of the resistance to SDS foliar symptoms, which was quantitatively controlled. In the 2001 experiments there was observed only additive genic effects, but in one experiment recessive genes had controlled the resistance, while in the other, in major part, dominant genes had controlled the resistance to SDS. In the 2002 experiment it was showed mainly dominance effects and also some additive genic effects. In the last experiment, for the group of parents used, the genetic parameters indicated that: the average degree of dominance showed the presence of overdominance; there were more recessive than dominants genes in the group of the parents; at least three loci or genic blocks that exhibited dominance were responsible for the genetic control of the resistance to SDS; the heritability in the narrow-sense had middle values (0.33 to 0.62), and in the broad-sense had high values (0.90 to 0.96), reinforcing the presence of dominance effects; the resistance to SDS was controlled, mostly, by dominant genes; the decreasing order of dominance of the parents were: 'Conquista', 'Cristalina', 'Forrest', 'Estrela' and 'IAC-4'; and the exclusion of 'Cristalina' of the diallel for disease index by suspect of gene correlated distribution with 'Conquista' and 'Estrela' improved the fitting of the data to Jinks-Hayman's additive-dominant model. Five microsatellite markers (Satt163, Satt309, Satt354, Satt371 and Satt570), reported as linked to five SDS QRLs, were used and showed the possibility of occurrence of multiallelism in those loci, but this evidence did not invalidate the fitting of the data to Jinks-Hayman's model. The molecular analysis in 126 plants of 'Conquista' x 'Estrela' cross with the markers Satt163 and Satt354, in the first experiment of 2001, showed the tendency of weakly association (P<0,10), between those loci and the QRLs. This analysis showed also tendency that the recessive genes controlled the resistance to SDS in both loci, in according to the results obtained in the diallel analysis for this experiment.
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Organogênese in vitro e transformação genética de variedades de tangerina (Citrus reticulata Blanco e Citrus clementina hort. ex Tan.) / In vitro organogenesis and genetic transformation of mandarin varieties (Citrus reticulata Blanco e Citrus clementina hort. ex Tan.).Soriano, Leonardo 10 March 2015 (has links)
Atualmente, o Huanglongbing (HLB), doença associada à bactéria Candidatus Liberibacter spp., é a principal ameaça dos Citrus, não tendo sido encontrado ainda espécies resistentes e tolerantes. O melhoramento genético tradicional apresenta limitações para a obtenção de novas variedades porta-enxerto e copa de citros em decorrência a fatores ligados à biologia do gênero. Na tentativa de sobrepor essas dificuldades, a transformação genética destaca-se por permitir a introdução de genes exógenos, os quais, além de reduzir o período de obtenção de material melhorado geneticamente, poderão conferir resistência a doenças em variedades de interesse agronômico. Desse modo, o objetivo desta pesquisa consistiu no estudo da organogênese in vitro, e na obtenção de plantas transgênicas via Agrobacterium tumefaciens das tangerinas \'Fremont\', \'Thomas\' e \'Nules\', com o gene que codifica o peptídeo antibacteriano atacina A (attA), controlado pelos promotores AtSUC2 e AtPP2, visando a expressão gênica preferencial nos vasos do floema. Adicionalmente, foi avaliada a transformação genética via A. tumefaciens de suspensões celulares de tangerina \'W-Murcott\', de laranja doce \'Hamlin\' e de tangelo \'Page\', e a transformação genética direta via PEG de protoplastos da tangerina \'W-Murcott\', com os fatores de transcrição VvmybA1 e Ruby, dirigidos pelos promotores com expressão preferencial nos tecidos embrionários 6105 e DC3. A eficiência da organogênese in vitro foi influenciada pelo tipo de explante e concentração de BAP. Após os experimentos de transformação genética de segmentos de epicótilo e internodal das tangerinas \'Fremont\', \'Thomas\' e \'Nules\', as plantas regeneradas foram analisadas por PCR, Southern blot e RT-qPCR e confirmadas como transgênicas pela presença e transcrição do gene attA no tecido vascular. A transformação genética de suspensões celulares mostrou-se eficiente com alta produção de antocianina nos embriões somáticos regenerados de tangerina \'W-Murcott\', de laranja doce \'Hamlin\' e de tangelo \'Page\'. A transformação genética direta de protoplastos de tangerina \'W-Murcott\' mostrou-se viável e também foi possível a obtenção de embriões somáticos transgênicos. Os fatores de transcrição VvmybA1 e Ruby se mostraram úteis para detecção visual do material transgênico / Currently, Huanglongbing (HLB), associated to Candidatus Liberibacter spp., is the main threat to the citrus culture. The conventional plant breeding shows limitations to the obtain new varieties of rootstock and scion, due to factors related to the biology of the genus. In attempt to overcome these barriers, genetic engineering is notable for allowing the introduction of foreign genes, which, besides reducing the time to obtain genetically improved material may confer disease resistance in varieties of agronomic interest. Thus, the objective of the research was the study of in vitro organogenesis, and obtain transgenic plants of \'Fremont\', \'Thomas\' and \'Nules\' mandarins via Agrobacterium tumefaciens with the gene encoding the antibacterial peptide attacin A (attA), controlled by the promoters AtSUC2 and AtPP2, aiming to preferential gene expression in phloem. In addition, the genetic transformation of cell suspensions, via A. tumefaciens, of \'W-Murcott\' mandarin, \'Hamlin\' sweet orange and \'Page\' tangelo and the direct genetic transformation, via PEG, of \'W-Murcott\' mandarin protoplasts were evaluated with VvmybA1 and Ruby transcription factors driven by 6105 and DC3 promoters, with preferential expression in embryonic tissues. The in vitro organogenesis of the varieties studied was influenced by the type of explant and BAP concentration. After genetic transformation experiments of epicotyl and internodal segments of \'Fremont\', \'Thomas\' and \'Nules mandarins, regenerated plants were analyzed by PCR, Southern blot and RT-qPCR and confirmed as transgenic by presence and transcription of attA gene. The genetic transformation of cell suspensions was efficient with high anthocyanin production in the somatic embryos regenerated of \'W-Murcott\' mandarin, \'Hamlin\' sweet orange and \'Page\' tangelo. The direct genetic transformation of \'W-Murcott\' mandarin protoplasts revealed to be viable and it was also possible to obtain transgenic somatic embryos. The VvmybA1 and Ruby transcription factors were useful tools for visual detection of transgenic material
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Organogênese in vitro e transformação genética de variedades de tangerina (Citrus reticulata Blanco e Citrus clementina hort. ex Tan.) / In vitro organogenesis and genetic transformation of mandarin varieties (Citrus reticulata Blanco e Citrus clementina hort. ex Tan.).Leonardo Soriano 10 March 2015 (has links)
Atualmente, o Huanglongbing (HLB), doença associada à bactéria Candidatus Liberibacter spp., é a principal ameaça dos Citrus, não tendo sido encontrado ainda espécies resistentes e tolerantes. O melhoramento genético tradicional apresenta limitações para a obtenção de novas variedades porta-enxerto e copa de citros em decorrência a fatores ligados à biologia do gênero. Na tentativa de sobrepor essas dificuldades, a transformação genética destaca-se por permitir a introdução de genes exógenos, os quais, além de reduzir o período de obtenção de material melhorado geneticamente, poderão conferir resistência a doenças em variedades de interesse agronômico. Desse modo, o objetivo desta pesquisa consistiu no estudo da organogênese in vitro, e na obtenção de plantas transgênicas via Agrobacterium tumefaciens das tangerinas \'Fremont\', \'Thomas\' e \'Nules\', com o gene que codifica o peptídeo antibacteriano atacina A (attA), controlado pelos promotores AtSUC2 e AtPP2, visando a expressão gênica preferencial nos vasos do floema. Adicionalmente, foi avaliada a transformação genética via A. tumefaciens de suspensões celulares de tangerina \'W-Murcott\', de laranja doce \'Hamlin\' e de tangelo \'Page\', e a transformação genética direta via PEG de protoplastos da tangerina \'W-Murcott\', com os fatores de transcrição VvmybA1 e Ruby, dirigidos pelos promotores com expressão preferencial nos tecidos embrionários 6105 e DC3. A eficiência da organogênese in vitro foi influenciada pelo tipo de explante e concentração de BAP. Após os experimentos de transformação genética de segmentos de epicótilo e internodal das tangerinas \'Fremont\', \'Thomas\' e \'Nules\', as plantas regeneradas foram analisadas por PCR, Southern blot e RT-qPCR e confirmadas como transgênicas pela presença e transcrição do gene attA no tecido vascular. A transformação genética de suspensões celulares mostrou-se eficiente com alta produção de antocianina nos embriões somáticos regenerados de tangerina \'W-Murcott\', de laranja doce \'Hamlin\' e de tangelo \'Page\'. A transformação genética direta de protoplastos de tangerina \'W-Murcott\' mostrou-se viável e também foi possível a obtenção de embriões somáticos transgênicos. Os fatores de transcrição VvmybA1 e Ruby se mostraram úteis para detecção visual do material transgênico / Currently, Huanglongbing (HLB), associated to Candidatus Liberibacter spp., is the main threat to the citrus culture. The conventional plant breeding shows limitations to the obtain new varieties of rootstock and scion, due to factors related to the biology of the genus. In attempt to overcome these barriers, genetic engineering is notable for allowing the introduction of foreign genes, which, besides reducing the time to obtain genetically improved material may confer disease resistance in varieties of agronomic interest. Thus, the objective of the research was the study of in vitro organogenesis, and obtain transgenic plants of \'Fremont\', \'Thomas\' and \'Nules\' mandarins via Agrobacterium tumefaciens with the gene encoding the antibacterial peptide attacin A (attA), controlled by the promoters AtSUC2 and AtPP2, aiming to preferential gene expression in phloem. In addition, the genetic transformation of cell suspensions, via A. tumefaciens, of \'W-Murcott\' mandarin, \'Hamlin\' sweet orange and \'Page\' tangelo and the direct genetic transformation, via PEG, of \'W-Murcott\' mandarin protoplasts were evaluated with VvmybA1 and Ruby transcription factors driven by 6105 and DC3 promoters, with preferential expression in embryonic tissues. The in vitro organogenesis of the varieties studied was influenced by the type of explant and BAP concentration. After genetic transformation experiments of epicotyl and internodal segments of \'Fremont\', \'Thomas\' and \'Nules mandarins, regenerated plants were analyzed by PCR, Southern blot and RT-qPCR and confirmed as transgenic by presence and transcription of attA gene. The genetic transformation of cell suspensions was efficient with high anthocyanin production in the somatic embryos regenerated of \'W-Murcott\' mandarin, \'Hamlin\' sweet orange and \'Page\' tangelo. The direct genetic transformation of \'W-Murcott\' mandarin protoplasts revealed to be viable and it was also possible to obtain transgenic somatic embryos. The VvmybA1 and Ruby transcription factors were useful tools for visual detection of transgenic material
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Transformação genética de cana-de-açúcar por biolística e Agrobacterium tumefaciens visando estudar o mecanismo de morte celular programada / Genetic transformation of sugarcane by biolistic and Agrobacterium tumefaciens to study the mechanism of programmed cell deathMelotto-Passarin, Danila Montewka 08 April 2009 (has links)
A cana-de-açúcar é uma das principais culturas agrícolas plantadas no Brasil e apresenta significativa importância sócio-econômica e agroindustrial ao país. O cenário mundial encontrase bastante favorável no que concerne à comercialização de seus dois principais produtos derivados, o açúcar e o álcool, impulsionando o desenvolvimento do setor sucroalcooleiro nacional. Neste sentido, o melhoramento genético da cana-de-açúcar aparece como base fundamental para o desenvolvimento de novas variedades para a manutenção e incremento dos agronegócios da agroindústria sucroalcooleira. Técnicas de engenharia genética, como a transformação genética nuclear, estão trazendo excelentes resultados no melhoramento genético da cultura, permitindo diminuir o custo e o tempo de obtenção de novas variedades. Baseando-se na importância em se obter variedades tolerantes a diferentes estresses bióticos e abióticos que induzem perturbações metabólicas e ativam o processo de morte celular programada, o presente trabalho teve por objetivo transformar geneticamente a variedade de cana-de-açúcar RB835089 com o cDNA do gene AtBI-1 isolado de Arabidopsis thaliana, visando suprimir a indução do mecanismo de morte celular sob condição de estresse. Para isto, calos embriogênicos foram utilizados como explante alvo, empregando-se dois métodos de transformação, a cotransformação por biolística, e o mediado por Agrobacterium tumefaciens no qual foram testadas duas técnicas: (a) inoculação direta dos calos em suspensão bacteriana; e (b) agrobiolística que é o bombardeamento dos calos com partículas de tungstênio seguido da inoculação em suspensão bacteriana. A proteína AtBI-1 (Bax inhibitor-1) apresenta homólogos em outros organismos e está localizada na membrana do retículo endoplasmático. Ela apresenta funções citoprotetoras modulando o mecanismo de morte celular programada induzida por estresses bióticos e abióticos. Como resultados deste trabalho, diferentes taxas de eficiência da transformação genética foram obtidas pelo método mediado por A. tumefaciens nas duas técnicas testadas, sendo que suas taxas foram superiores às alcançadas pelo método de co-transformação por biolística. A expressão heteróloga do cDNA do gene AtBI-1 em cana-de-açúcar atenuou a indução das vias de morte celular em presença do antibiótico tunicamicina, indutor do estresse no retículo endoplasmático, sendo comprovado pela maior tolerância ao estresse das plantas transgênicas quando comparadas com as plantas não transformadas que foram afetas no crescimento do sistema radicular, conteúdo de clorofila total, apresentando sintomas típicos de morte celular programada como clorose foliar e morfologia irregular das raízes, com consequente morte do sistema radicular. / Sugarcane is one of the main crops planted in Brazil and presents significant socioeconomic and agribusiness importance to the country. The world scene is quite favorable as regards the marketing of its two main products, sugar and alcohol, driving the development of the national sugar-alcohol sector. Therefore, the sugarcane genetic breeding appears as the fundamental base for developing new varieties for the maintenance and increase of agribusiness in the sugarcane agroindustry. Genetic engineering techniques, such as the nuclear genetic transformation, are providing excellent results in genetic breeding of this crop allowing reducing the cost and time to obtain new varieties. Based on the importance of obtaining varieties tolerant to different biotic and abiotic stresses that induce metabolic disturbances and activate the process of programmed cell death, this work aimed to transform sugarcane variety RB835089 with the cDNA of AtBI-1 gene, isolated from Arabidopsis thaliana, to suppress the induction of the cell death mechanism under stress condition. For this, embryogenic calli were used as target explant, by using two methods of transformation, the cotransformation by biolistic, and mediated by Agrobacterium tumefaciens in which two techniques were tested: (a) direct inoculation of calli in bacterial suspension; (b) agrobiolistic which is the bombardment of calli with tungstein particles followed by inoculation in bacterial suspension. The AtBI-1 protein (Bax inhibitor-1) presents homologs in other organisms and is located in the endoplasmic reticulum membranes. It has cytoprotective functions by modulating the mechanism of programmed cell death induced by biotic and abiotic stresses. As results of this work, different efficiency rates in genetic transformation were obtained in the method mediated by A. tumefaciens in the two techniques tested, and that their rates were higher than those achieved using the cotransformation by biolistic. The heterologous expression of cDNA of AtBI-1 gene in sugarcane attenuated the induction of cell death pathways in the presence of tunicamycin antibiotic, an inducer of stress in the endoplasmic reticulum, being proven by the increased stress tolerance of transgenic plants compared with sugarcane wild type that were affected in the root growth, total chlorophyll content, showing typical symptoms of programmed cell death such as leaf chlorosis and irregular morphology of the roots, with subsequent death of the root system.
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Transformação genética de cana-de-açúcar por biolística e Agrobacterium tumefaciens visando estudar o mecanismo de morte celular programada / Genetic transformation of sugarcane by biolistic and Agrobacterium tumefaciens to study the mechanism of programmed cell deathDanila Montewka Melotto-Passarin 08 April 2009 (has links)
A cana-de-açúcar é uma das principais culturas agrícolas plantadas no Brasil e apresenta significativa importância sócio-econômica e agroindustrial ao país. O cenário mundial encontrase bastante favorável no que concerne à comercialização de seus dois principais produtos derivados, o açúcar e o álcool, impulsionando o desenvolvimento do setor sucroalcooleiro nacional. Neste sentido, o melhoramento genético da cana-de-açúcar aparece como base fundamental para o desenvolvimento de novas variedades para a manutenção e incremento dos agronegócios da agroindústria sucroalcooleira. Técnicas de engenharia genética, como a transformação genética nuclear, estão trazendo excelentes resultados no melhoramento genético da cultura, permitindo diminuir o custo e o tempo de obtenção de novas variedades. Baseando-se na importância em se obter variedades tolerantes a diferentes estresses bióticos e abióticos que induzem perturbações metabólicas e ativam o processo de morte celular programada, o presente trabalho teve por objetivo transformar geneticamente a variedade de cana-de-açúcar RB835089 com o cDNA do gene AtBI-1 isolado de Arabidopsis thaliana, visando suprimir a indução do mecanismo de morte celular sob condição de estresse. Para isto, calos embriogênicos foram utilizados como explante alvo, empregando-se dois métodos de transformação, a cotransformação por biolística, e o mediado por Agrobacterium tumefaciens no qual foram testadas duas técnicas: (a) inoculação direta dos calos em suspensão bacteriana; e (b) agrobiolística que é o bombardeamento dos calos com partículas de tungstênio seguido da inoculação em suspensão bacteriana. A proteína AtBI-1 (Bax inhibitor-1) apresenta homólogos em outros organismos e está localizada na membrana do retículo endoplasmático. Ela apresenta funções citoprotetoras modulando o mecanismo de morte celular programada induzida por estresses bióticos e abióticos. Como resultados deste trabalho, diferentes taxas de eficiência da transformação genética foram obtidas pelo método mediado por A. tumefaciens nas duas técnicas testadas, sendo que suas taxas foram superiores às alcançadas pelo método de co-transformação por biolística. A expressão heteróloga do cDNA do gene AtBI-1 em cana-de-açúcar atenuou a indução das vias de morte celular em presença do antibiótico tunicamicina, indutor do estresse no retículo endoplasmático, sendo comprovado pela maior tolerância ao estresse das plantas transgênicas quando comparadas com as plantas não transformadas que foram afetas no crescimento do sistema radicular, conteúdo de clorofila total, apresentando sintomas típicos de morte celular programada como clorose foliar e morfologia irregular das raízes, com consequente morte do sistema radicular. / Sugarcane is one of the main crops planted in Brazil and presents significant socioeconomic and agribusiness importance to the country. The world scene is quite favorable as regards the marketing of its two main products, sugar and alcohol, driving the development of the national sugar-alcohol sector. Therefore, the sugarcane genetic breeding appears as the fundamental base for developing new varieties for the maintenance and increase of agribusiness in the sugarcane agroindustry. Genetic engineering techniques, such as the nuclear genetic transformation, are providing excellent results in genetic breeding of this crop allowing reducing the cost and time to obtain new varieties. Based on the importance of obtaining varieties tolerant to different biotic and abiotic stresses that induce metabolic disturbances and activate the process of programmed cell death, this work aimed to transform sugarcane variety RB835089 with the cDNA of AtBI-1 gene, isolated from Arabidopsis thaliana, to suppress the induction of the cell death mechanism under stress condition. For this, embryogenic calli were used as target explant, by using two methods of transformation, the cotransformation by biolistic, and mediated by Agrobacterium tumefaciens in which two techniques were tested: (a) direct inoculation of calli in bacterial suspension; (b) agrobiolistic which is the bombardment of calli with tungstein particles followed by inoculation in bacterial suspension. The AtBI-1 protein (Bax inhibitor-1) presents homologs in other organisms and is located in the endoplasmic reticulum membranes. It has cytoprotective functions by modulating the mechanism of programmed cell death induced by biotic and abiotic stresses. As results of this work, different efficiency rates in genetic transformation were obtained in the method mediated by A. tumefaciens in the two techniques tested, and that their rates were higher than those achieved using the cotransformation by biolistic. The heterologous expression of cDNA of AtBI-1 gene in sugarcane attenuated the induction of cell death pathways in the presence of tunicamycin antibiotic, an inducer of stress in the endoplasmic reticulum, being proven by the increased stress tolerance of transgenic plants compared with sugarcane wild type that were affected in the root growth, total chlorophyll content, showing typical symptoms of programmed cell death such as leaf chlorosis and irregular morphology of the roots, with subsequent death of the root system.
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Genética da reação da soja a Fusarium solani f.sp. glycines. / Genetics of soybean reaction to Fusarium solani f.sp. glycines.Vanoli Fronza 04 April 2003 (has links)
Na última década, a podridão vermelha das raízes da soja (PVR), ou síndrome da morte súbita, causada pelo fungo Fusarium solani f.sp. glycines, tornou-se uma doença que é motivo de preocupação para os sojicultores, técnicos e pesquisadores nas regiões onde esta doença já foi constatada, sendo a única estratégia de controle viável a utilização de cultivares resistentes. Diante disto, o principal objetivo do presente trabalho foi o estudo do controle genético da reação da soja a PVR por meio de técnicas de genética clássica e molecular. Foi utilizada a geração F2 de um dialelo 5x5, sem os recíprocos, envolvendo cinco cultivares: Forrest, MG/BR-46 (Conquista), IAC-4, FT-Cristalina e FT-Estrela, sendo as duas primeiras mais resistentes a PVR que IAC-4, considerada moderadamente resistente e, as duas últimas, altamente suscetíveis. Além de testes de inoculação com as cultivares, foram conduzidos três experimentos com a geração F2: um em telado (semeadura em julho de 2001) e dois em casa de vegetação (semeadura em setembro de 2001 e julho de 2002), sendo os dois primeiros em blocos ao acaso e o terceiro no delineamento inteiramente casualizado. O patógeno foi inoculado com grãos de sorgo colonizados, colocando-se três grãos no fundo de cada cova, no momento da semeadura, fazendo-se cinco covas por vaso, cada qual constituindo uma parcela com cinco plantas. Em cada experimento, foram avaliadas individualmente 50 plantas de cada genitor e 150 plantas de cada cruzamento F2, entre os 30 e 40 dias após a emergência, utilizando-se uma escala de notas de 1 a 5 para a severidade dos sintomas foliares da PVR. A porcentagem de incidência da doença em cada parcela e um índice de doença também foram calculados. Nas análises de variância com os dados de médias de parcelas, observaram-se diferenças altamente significativas entre os genitores e entre populações F2 para a severidade e índice de doença dos sintomas foliares, na maioria dos casos, embora os genitores resistentes e suscetíveis não foram muito contrastantes. As cultivares Forrest e Conquista comportaram-se sempre como resistentes, e Cristalina e Estrela como suscetíveis, enquanto que IAC-4 apresentou comportamento instável. Pela análise dialélica de Jinks-Hayman reafirmou-se a influência do ambiente sobre o controle da resistência à manifestação dos sintomas foliares da PVR, a qual foi controlada quantitativamente. Nos experimentos de 2001, constatou-se apenas a ação de efeitos gênicos aditivos. Porém, no experimento conduzido em telado, a resistência demonstrou controle por genes recessivos, enquanto que na casa de vegetação, na maior parte, por genes dominantes. No experimento de 2002 constatou-se a presença de efeitos gênicos aditivos e de dominância, predominando o efeito destes últimos. Assim, com base no experimento de 2002, para o grupo de cultivares estudado, os parâmetros genéticos calculados permitiram verificar que: o grau médio de dominância indicou a presença de sobredominância; predominaram genes recessivos no grupo dos genitores; pelo menos três locos ou blocos gênicos que exibiram dominância foram responsáveis pelo controle da resistência a PVR; as herdabilidades estimadas no sentido restrito foram médias (0,33 a 0,62) e, no sentido amplo, altas (0,90 a 0,96), confirmando a presença de dominância; a resistência foi controlada, na maior parte, por genes dominantes e a ordem decrescente de dominância das cultivares foi a seguinte: 'Conquista', 'Cristalina', 'Forrest', 'Estrela' e 'IAC-4'; a exclusão de 'Cristalina', por suspeita de apresentar distribuição de genes correlacionada com 'Conquista' e 'Estrela', melhorou a adequação dos dados de índice de doença ao modelo genético aditivo-dominante de Jinks-Hayman. A utilização de cinco marcadores moleculares microssatélites (Satt163, Satt309, Satt354, Satt371 e Satt570), relatados como ligados a cinco QRLs da PVR, indicou a provável presença de multialelismo nestes locos, o que não invalidou a adequação dos dados ao modelo de Jinks-Hayman. Pela análise de ligação entre 126 indivíduos F2 do cruzamento 'Conquista' x 'Estrela' com os marcadores Satt163 e Satt354, no experimento conduzido em telado, houve ligação fraca (P<0,10) entre estes locos e os respectivos QRLs, havendo tendência dos alelos recessivos serem os responsáveis pelo controle da resistência nestes dois locos, concordando com os resultados da análise dialélica para este experimento. / In order to study the genetic control of soybean resistance to sudden death syndrome (SDS) by classical and molecular genetic techniques a 5x5 diallel with the F2 generation, without the reciprocals, was carried out. The following parents were used: 'Forrest', 'MG/BR-46 (Conquista)', 'IAC-4', 'FT-Cristalina' and 'FT-Estrela'. The first two cultivars are more resistant to SDS than 'IAC-4', that is considered to be moderately resistant to SDS, and the last two cultivars are highly susceptible. Tests of inoculation were done with the cultivars and three experiments with the F2 generation (two in 2001 and one in 2002) were carried out, all of them in greenhouses. The fungus was inoculated by three colonized sorghum grains placed at the bottom of the holes at the planting. It was used five-holes/clay pot, which one was considered a plot with five plants. In each experiment with the F2 generation 50 single plants of each parent and 150 single plants of each F2 population were evaluated between 30 and 40 days after emergency by using a scale (1 to 5) based on foliar severity symptoms. The disease incidence and a disease index also were calculated for each plot. In the ANOVAs with data plot average for severity and disease index highly significant differences were detected among the treatments in almost all cases, although the resistant and the susceptible parents did not differ too much. The parents 'Forrest' and 'Conquista' were always more resistant than the others. 'Cristalina' and 'Estrela' were the most susceptible parents, while 'IAC-4' was unstable. Jinks-Hayman's analysis reaffirmed the environment effect on the genetic control of the resistance to SDS foliar symptoms, which was quantitatively controlled. In the 2001 experiments there was observed only additive genic effects, but in one experiment recessive genes had controlled the resistance, while in the other, in major part, dominant genes had controlled the resistance to SDS. In the 2002 experiment it was showed mainly dominance effects and also some additive genic effects. In the last experiment, for the group of parents used, the genetic parameters indicated that: the average degree of dominance showed the presence of overdominance; there were more recessive than dominants genes in the group of the parents; at least three loci or genic blocks that exhibited dominance were responsible for the genetic control of the resistance to SDS; the heritability in the narrow-sense had middle values (0.33 to 0.62), and in the broad-sense had high values (0.90 to 0.96), reinforcing the presence of dominance effects; the resistance to SDS was controlled, mostly, by dominant genes; the decreasing order of dominance of the parents were: 'Conquista', 'Cristalina', 'Forrest', 'Estrela' and 'IAC-4'; and the exclusion of 'Cristalina' of the diallel for disease index by suspect of gene correlated distribution with 'Conquista' and 'Estrela' improved the fitting of the data to Jinks-Hayman's additive-dominant model. Five microsatellite markers (Satt163, Satt309, Satt354, Satt371 and Satt570), reported as linked to five SDS QRLs, were used and showed the possibility of occurrence of multiallelism in those loci, but this evidence did not invalidate the fitting of the data to Jinks-Hayman's model. The molecular analysis in 126 plants of 'Conquista' x 'Estrela' cross with the markers Satt163 and Satt354, in the first experiment of 2001, showed the tendency of weakly association (P<0,10), between those loci and the QRLs. This analysis showed also tendency that the recessive genes controlled the resistance to SDS in both loci, in according to the results obtained in the diallel analysis for this experiment.
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