Made available in DSpace on 2014-06-12T18:07:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo901_1.pdf: 1845029 bytes, checksum: d92b20c269bd82c05d835c3ca4ccee60 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os papilomavírus constituem um grupo de pequenos vírus de DNA de dupla fita caracterizados por induzirem a formação de lesões que são em geral benignas, podendo regredir naturalmente ou se transformar em tumores malignos, gerando importantes perdas econômicas aos criadores. Os BPVs tipo 1 e 2 são carcinogênicos e estão relacionados com o câncer da bexiga urinária e o tumor sarcóide em eqüino. Como existem muitos animais já infectados e afetados pela doença, uma estratégia vacinal terapêutica torna-se necessária e muito aguardada pelos criadores. A imunização genética é uma estratégia bastante eficaz na indução de imunidades humoral e celular em grande número de modelos animais. O foco deste trabalho foi realizar a construção e avaliação funcional in vitro do vetor vacinal pCIE5sintB1/B2, usando o gene E5 otimizado para expressão em célula de mamífero. As sequências do gene E5 dos BPVs 1 e 2 foram obtidas do GeneBank e analisadas quanto a suas diferenças e ao uso preferencial de códons, sendo então construída uma sequência otimizada a qual foi sintetizada (E5sintB1/2), contendo um epitopo AU1 na região N-terminal. O gene E5sint foi então clonado no vetor de expressão pCI-neo usando sítios de restrição inseridos no gene sintético. A construção pCIE5sintB1/2 foi seqüenciada para confirmação. Para análise da funcionalidade o vetor pCIE5sintB1/2 foi utilizado para transfectar em células 293, usando o Kit TransFast. Após 48 horas de cultivo, as células foram coletadas e os extratos celulares processados para preparação do extrato protéico celular e de RNA total. A expressão gênica foi avaliada por meio de RT-PCR, SDS-PAGE, Dot Blot e Western Blot (usando anticorpo contra o epítopo AU1). Os resultados obtidos mostraram que apenas as células transfectadas com a construção pCIE5sintB1/B2 apresentaram transcrição do gene E5 e conseqüente produção da proteína. Estes resultados confirmam a expressão do antígeno vacinal em células de mamífero

Submitted by Luiz Felipe Barbosa (luiz.fbabreu2@ufpe.br) on 2015-03-13T15:00:05Z No. of bitstreams: 2 TESE_Eliane_Coimbra_ 2012.pdf: 2000368 bytes, checksum: 2ec0dc2be6907bc65cd246b36e95e551 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T15:00:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE_Eliane_Coimbra_ 2012.pdf: 2000368 bytes, checksum: 2ec0dc2be6907bc65cd246b36e95e551 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-09-04 / CAPES / O câncer cervical é considerado o segundo tipo de tumor a ocasionar maior número de mortes entre as mulheres no mundo, e a infecção pelo papilomavirus humano (HPV) é a principal causa relacionada com o desenvolvimento desta neoplasia. No Brasil, o câncer cervical produz uma média de 2,5 óbitos/100.000 indivíduos. Atualmente existem duas vacinas no mercado, baseadas em “Vírus-Like Particles” (VLPs), mas o alto custo inviabiliza seu uso pelos países em desenvolvimento. As VLPs de HPV são produzidas a partir da proteína capsidial L1, contra a qual é conferida forte imunidade humoral. Uma estratégia vacinal orientada para a prevenção do câncer cervical em humanos é muito importante para a saúde pública, no entanto, como há muitas pessoas já infectadas pelo HPV, uma abordagem terapêutica se torna necessária. Neste trabalho foi proposta a expressão do gene L1 de HPV-16 em células da levedura Pichia pastoris, como base de uma estratégia preventiva e a construção de uma vacina de DNA baseada na proteína E5 do HPV-16, identificada como potencial antígeno tumoral para terapia do câncer. O gene L1 otimizado de HPV-16 foi clonado em vetor de expressão pPGK para integração no genoma de P. pastoris, sua transcrição foi confirmada por RT-PCR e a expressão da proteína detectada por dot blot, colony blot e western blot. A vacina de DNA foi construída pela inserção do gene E5 de HPV-16 otimizado e adicionado do epítopo AU1, no vetor pCIneo. Para estudo inicial da funcionalidade da construção vacinal pCI-E5sintH16, foi realizada uma análise in vitro em células HEK-293, através de RT-PCR e western blot. O estudo do gene E5 de HPV como antígeno terapêutico, apesar de pouco explorado ainda, é bastante relevante.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-05T16:49:02Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-ElianeCoimbra.pdf: 2000368 bytes, checksum: 2ec0dc2be6907bc65cd246b36e95e551 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-05T16:49:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-ElianeCoimbra.pdf: 2000368 bytes, checksum: 2ec0dc2be6907bc65cd246b36e95e551 (MD5) Previous issue date: 2012-09-04 / O câncer cervical é considerado o segundo tipo de tumor a ocasionar maior número de mortes entre as mulheres no mundo,e ainfecção pelopapilomavirus humano (HPV) éa principalcausarelacionada com o desenvolvimento desta neoplasia. No Brasil, o câncer cervicalproduz uma média de 2,5 óbitos/100.000 indivíduos.Atualmente existem duas vacinas no mercado, baseadas em “Vírus-Like Particles”(VLPs), mas o alto custo inviabiliza seu uso pelos países em desenvolvimento. As VLPs de HPV são produzidasa partir daproteína capsidial L1, contra aqual é conferidaforte imunidade humoral.Uma estratégia vacinalorientada para a prevenção do câncer cervical em humanosé muito importante para a saúde pública, no entanto, como hámuitas pessoas já infectadas peloHPV, uma abordagem terapêutica se torna necessária.Neste trabalho foi proposta a expressão do gene L1 de HPV-16 em células da levedura Pichia pastoris, como base de uma estratégia preventiva e a construção de uma vacina de DNA baseada na proteína E5 do HPV-16, identificadacomo potencialantígeno tumoral para terapia docâncer. O gene L1 otimizado de HPV-16 foi clonado em vetor de expressão pPGK para integração no genoma de P. pastoris, sua transcrição foi confirmada por RT-PCR e a expressão da proteína detectada por dot blot, colony blot e western blot.A vacina de DNA foi construída pela inserçãodo gene E5 de HPV-16 otimizado e adicionado doepítopo AU1, novetor pCIneo.Para estudo inicial da funcionalidadeda construção vacinalpCI-E5sintH16, foi realizadaumaanálise in vitroem célulasHEK-293, através de RT-PCRe western blot.O estudo do gene E5 de HPVcomoantígeno terapêutico,apesar depouco exploradoainda, é bastante relevante. / Cervical cancer is the second type of tumor to cause deaths among women worldwide. The infection of human papillomavirus (HPV) is the leading cause related to the development of this neoplasia.In Brazil, cervical cancer produces an average of 2.5 deaths per 100.000 individuals. There are currently two vaccines on the market, based on Virus-Like Particles, but the high cost (U.S. $ 350.00) prevents its use by developing countries. HPV VLPs are formed from the L1 capsid protein, against which it is given strong humoral immunity. A targeted vaccination strategy for the prevention of cervical cancer in humans is very important to public health;however there are many people already infected with HPV, and therefore a therapeutic approach is needed. In this study was proposed the expression of the L1 gene of HPV-16 in Pichia pastorisyeast cells as the basis for a preventive strategy and the construction of a DNA vaccine based on the HPV-16 E5 protein, identified as a potential tumor antigen for cancer therapy. The optimized L1 gene of HPV-16 was cloned into the expression vector pPGK for integration into the genome of Pichia. The transcript of this gene was confirmed by RT-PCR and L1 protein expression detected by dot blot, colony blot and western blot. The DNA vaccine was constructed by cloning the optimized E5 gene of HPV-16, with the inserted AU1 epitope, in the pCIneo vector. In vitro analysis were performed with HEK-293 cells transfected with the PCI-E5sintH16 vector, including RT-PCR and western blot for the initial evaluation of DNA vaccine functionality. The study of the cancer therapy with the E5 gene of HPV-16 although still unexplored is quite relevant.