Staphylococcus aureus resistente à meticilina (SARM) é um dos principais patógenos responsáveis pela infecção nosocomial e recentemente tem sido isolada fora do ambiente hospitalar, trazendo uma grande preocupação a médicos e pesquisadores. Esta resistência à meticilina é devida à presença do gene mecA, o qual codifica a PLP2a, uma proteína ligadora de penicilina, que tem baixa afinidade pelos antibióticos β-Lactâmicos. A vancomicina, até recentemente, era o tratamento de escolha para pacientes acometidos pela SARM; porém o isolamento de cepas com resistência intermediária e S. aureus totalmente resistentes à vancomicina, gerou uma grande mobilização da comunidade científica na busca de alternativas para o tratamento destas cepas multirresistentes, através do desenvolvimento de vacinas e soroterapia. A vacina de DNA é uma técnica recente que, entre outras vantagens, não necessita da purificação do antígeno protéico para induzir uma resposta imune, diminuindo o custo de produção, quando comparada às vacinas protéicas. Neste trabalho, demonstramos que a utilização de uma vacina de DNA com um fragmento do gene mecA produz uma resposta imune humoral, com a produção de anticorpos específicos anti-PLP2a em eqüinos imunizados com esta vacina, e que estes anticorpos, após sua purificação, permanecem ativos. Como ainda não existe informação suficiente em relação à segurança do uso das vacinas de DNA diretamente em humanos, o uso desta técnica em eqüinos, com o objetivo de gerar um soro hiperimune, para utilizá-lo após sua purificação no tratamento de pacientes acometidos com infecção provocada por SARM, poderia ser uma alternativa viável e segura no combate a esta bactéria resistente a quase todos agentes antimicrobianos. / Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the major pathogens responsible for nosocomial infection and has been recently isolated outside the hospital environment, causing a great concern to physicians and researchers. This methicillinresistance is due to the presence of the mecA gene, which codes for PBP2a, a penicillinbinding protein, which has low affinity for β-Lactamic antibiotics. The treatment of choice for patients afflicted by MRSA was, until recently, vancomicyn; however the isolation of vancomycin-intermediate and resistant S. aureus strains generated a great mobilization of the scientific community for the search of alternatives for the treatment of these multiresistant strains, such as, for example vaccines and soroterapy. The DNA vaccine is a recent method that, among others, does not require the purification of the of the proteic antigen to induce a immune response, reducing production costs as compared to protein vaccines. In the present study we demonstrated that the use of a DNA vaccine with a fragment of the mecA gene produces an humoral immune response, with the production of anti-PBP2a specific antibodies in horses immunized with this vaccine, and these antibodies, once purified, maintain their activity. Since there is not sufficient information about the safety of DNA vaccines used directly to humans, the use of this vaccine in horses, with the intent of generating an hyperimmune serum to be used after its purification in the treatment of patients afflicted with infection caused by MRSA could be a possible and safe alternative to fight this bacteria resistant to almost all antimicrobial agents.

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (SARM) é um dos principais patógenos responsáveis pela infecção nosocomial e recentemente tem sido isolada fora do ambiente hospitalar, trazendo uma grande preocupação a médicos e pesquisadores. Esta resistência à meticilina é devida à presença do gene mecA, o qual codifica a PLP2a, uma proteína ligadora de penicilina, que tem baixa afinidade pelos antibióticos β-Lactâmicos. A vancomicina, até recentemente, era o tratamento de escolha para pacientes acometidos pela SARM; porém o isolamento de cepas com resistência intermediária e S. aureus totalmente resistentes à vancomicina, gerou uma grande mobilização da comunidade científica na busca de alternativas para o tratamento destas cepas multirresistentes, através do desenvolvimento de vacinas e soroterapia. A vacina de DNA é uma técnica recente que, entre outras vantagens, não necessita da purificação do antígeno protéico para induzir uma resposta imune, diminuindo o custo de produção, quando comparada às vacinas protéicas. Neste trabalho, demonstramos que a utilização de uma vacina de DNA com um fragmento do gene mecA produz uma resposta imune humoral, com a produção de anticorpos específicos anti-PLP2a em eqüinos imunizados com esta vacina, e que estes anticorpos, após sua purificação, permanecem ativos. Como ainda não existe informação suficiente em relação à segurança do uso das vacinas de DNA diretamente em humanos, o uso desta técnica em eqüinos, com o objetivo de gerar um soro hiperimune, para utilizá-lo após sua purificação no tratamento de pacientes acometidos com infecção provocada por SARM, poderia ser uma alternativa viável e segura no combate a esta bactéria resistente a quase todos agentes antimicrobianos. / Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the major pathogens responsible for nosocomial infection and has been recently isolated outside the hospital environment, causing a great concern to physicians and researchers. This methicillinresistance is due to the presence of the mecA gene, which codes for PBP2a, a penicillinbinding protein, which has low affinity for β-Lactamic antibiotics. The treatment of choice for patients afflicted by MRSA was, until recently, vancomicyn; however the isolation of vancomycin-intermediate and resistant S. aureus strains generated a great mobilization of the scientific community for the search of alternatives for the treatment of these multiresistant strains, such as, for example vaccines and soroterapy. The DNA vaccine is a recent method that, among others, does not require the purification of the of the proteic antigen to induce a immune response, reducing production costs as compared to protein vaccines. In the present study we demonstrated that the use of a DNA vaccine with a fragment of the mecA gene produces an humoral immune response, with the production of anti-PBP2a specific antibodies in horses immunized with this vaccine, and these antibodies, once purified, maintain their activity. Since there is not sufficient information about the safety of DNA vaccines used directly to humans, the use of this vaccine in horses, with the intent of generating an hyperimmune serum to be used after its purification in the treatment of patients afflicted with infection caused by MRSA could be a possible and safe alternative to fight this bacteria resistant to almost all antimicrobial agents.

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (SARM) é um dos principais patógenos responsáveis pela infecção nosocomial e recentemente tem sido isolada fora do ambiente hospitalar, trazendo uma grande preocupação a médicos e pesquisadores. Esta resistência à meticilina é devida à presença do gene mecA, o qual codifica a PLP2a, uma proteína ligadora de penicilina, que tem baixa afinidade pelos antibióticos β-Lactâmicos. A vancomicina, até recentemente, era o tratamento de escolha para pacientes acometidos pela SARM; porém o isolamento de cepas com resistência intermediária e S. aureus totalmente resistentes à vancomicina, gerou uma grande mobilização da comunidade científica na busca de alternativas para o tratamento destas cepas multirresistentes, através do desenvolvimento de vacinas e soroterapia. A vacina de DNA é uma técnica recente que, entre outras vantagens, não necessita da purificação do antígeno protéico para induzir uma resposta imune, diminuindo o custo de produção, quando comparada às vacinas protéicas. Neste trabalho, demonstramos que a utilização de uma vacina de DNA com um fragmento do gene mecA produz uma resposta imune humoral, com a produção de anticorpos específicos anti-PLP2a em eqüinos imunizados com esta vacina, e que estes anticorpos, após sua purificação, permanecem ativos. Como ainda não existe informação suficiente em relação à segurança do uso das vacinas de DNA diretamente em humanos, o uso desta técnica em eqüinos, com o objetivo de gerar um soro hiperimune, para utilizá-lo após sua purificação no tratamento de pacientes acometidos com infecção provocada por SARM, poderia ser uma alternativa viável e segura no combate a esta bactéria resistente a quase todos agentes antimicrobianos. / Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the major pathogens responsible for nosocomial infection and has been recently isolated outside the hospital environment, causing a great concern to physicians and researchers. This methicillinresistance is due to the presence of the mecA gene, which codes for PBP2a, a penicillinbinding protein, which has low affinity for β-Lactamic antibiotics. The treatment of choice for patients afflicted by MRSA was, until recently, vancomicyn; however the isolation of vancomycin-intermediate and resistant S. aureus strains generated a great mobilization of the scientific community for the search of alternatives for the treatment of these multiresistant strains, such as, for example vaccines and soroterapy. The DNA vaccine is a recent method that, among others, does not require the purification of the of the proteic antigen to induce a immune response, reducing production costs as compared to protein vaccines. In the present study we demonstrated that the use of a DNA vaccine with a fragment of the mecA gene produces an humoral immune response, with the production of anti-PBP2a specific antibodies in horses immunized with this vaccine, and these antibodies, once purified, maintain their activity. Since there is not sufficient information about the safety of DNA vaccines used directly to humans, the use of this vaccine in horses, with the intent of generating an hyperimmune serum to be used after its purification in the treatment of patients afflicted with infection caused by MRSA could be a possible and safe alternative to fight this bacteria resistant to almost all antimicrobial agents.

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-08-29T20:51:35Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Ana Paula Ferreira Campos.pdf: 2091702 bytes, checksum: 206e041438756822063cb0f534cef65e (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-09-10T19:33:36Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Ana Paula Ferreira Campos.pdf: 2091702 bytes, checksum: 206e041438756822063cb0f534cef65e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-10T19:33:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Ana Paula Ferreira Campos.pdf: 2091702 bytes, checksum: 206e041438756822063cb0f534cef65e (MD5) Previous issue date: 2017-02-24 / CAPES / Os papilomavírus incluem vírus de DNA circular, geralmente envolvidos em lesões benignas do epitélio e mucosas. No entanto, alguns papilomavírus apresentam potencial oncogênico levando ao desenvolvimento de doenças como a papilomatose bovina. Atualmente, é sabido que a proteína L2 que compõe a estrutura do capsídeo, e alguns de seus epítopos são capazes de induzir a produção de anticorpos neutralizantes. Além disso, a oncoproteína E5 é responsável pelo crescimento e transformação celular, sendo o principal gene de transformação em bovinos. Entretanto, não existe disponível vacina comercial eficaz contra a infecção pelo BPV. Dessa forma, o presente trabalho consiste na construção de candidatos vacinais por meio de vacina de DNA contra a infecção por BPV. Para tal, tivemos como objetivo específico a construção de vetores vacinais a partir do plasmídeo pCI-neo e avaliamos in vitro a expressão dos respectivos antígenos em células de mamíferos. Os genes escolhidos para o estudo, L2 selvagem e o seu epítopo contido entre os aminoácidos 11 a 200, além do oncogene E5 selvagem, foram amplificados por PCR, clonados individualmente no vetor plasmidial pGEM-T easy e propagados em Escherichia coli (linhagem DH5α). Em seguida, os genes de trabalho foram previamente digeridos e subclonados no vetor pCI-neo para expressão em células de mamífero, incluindo o gene E5 sintético códon otimizado. Ambas as sequências foram avaliadas por digestão enzimática e por sequenciamento. A avaliação da funcionalidade das construções foi realizada pela expressão das mesmas em cultura de células embrionárias do Rim Humano (HEK-293 - Human embrionic kidney cell) seguida por análise da expressão gênica via RT-PCR e dos extratos proteicos por SDS-PAGE e Western-Blot. Os resultados obtidos apresentaram a expressão dos genes L2ʷᵗ, L2¹¹⁻²⁰⁰ e E5ᵒᵗⁱᵐⁱᶻᵃᵈᵒ confirmada por RT-PCR. No entanto, a produção das respectivas proteica não foi detectada pela análise via immunoblotting, demonstrando que melhorias no protocolo são necessárias. / Papillomaviruses are circular DNA viruses, generally involved in benign lesions of the epithelium and mucous membranes. However, some papillomaviruses present oncogenic potential leading to the development of diseases such as bovine papillomatosis. Currently, it is known that the viral capsid L2 protein and some of its epitopes are capable of inducing the production of neutralizing antibodies. In addition, the E5 oncoprotein is responsible for cell growth and transformation, being the main transformation gene in cattle. However, no effective commercial vaccine against BPV infection is available. Thus, the present work consists of the construction of vaccine candidates by means of DNA vaccine against BPV infection. For this propose, we specifically aimed to construct vaccine vectors from the plasmid pCI-neo and evaluated the expression of the respective antigens in vitro in mammalian cells. The genes chosen for the study, the entire L2 sequence and its epitope contained between the amino acids 11 to 200 and the wild-type E5 oncogene, were amplified by PCR, individually cloned into the pGEM-T easy vector and propagated in Escherichia coli (strain DH5α). Then, the working genes were pre-digested and subcloned into the pCI-neo vector for expression in mammalian cells, including the synthetic codon optimized E5 gene. Both sequences were evaluated by enzymatic digestion and sequencing. The evaluation of the functionality of the constructs was performed by gene expression in Human Kidney embryo cell (HEK-293) followed by analysis of the gene transcription via RT-PCR and of protein extract via SDS-PAGE and Western Blot. The results obtained showed the expression of the genes L2ʷᵗ, L2¹¹⁻²⁰⁰ and E5ᵒᵖᵗⁱᵐⁱᶻᵉᵈ confirmed by RT-PCR. However, production of the respective proteins was not detected by immunoblotting analysis, demonstrating that improvements in the protocol are required.

O presente estudo teve como principal objetivo aprimorar os efeitos antitumorais de uma nova estratégia imunoterapêutica para controle de tumores induzidos pelo vírus do papiloma humano tipo 16 (HPV-16). Para tal finalidade foi utilizado um novo conceito de imunoterapia ativa, baseada em uma vacina de DNA recombinante, desenvolvida no Laboratório de Desenvolvimento de Vacinas da USP (pgDE7h) e diferentes abordagens experimentais delineadas com a finalidade de aumentar a eficácia terapêutica do tratamento. Desta forma, o presente trabalho focou no desenvolvimento de novos sistemas de entrega para a vacina de DNA empregando três nanocarregadores distintos, de natureza lipídica, proteica ou peptídica, e a avaliação da eficácia terapêutica desses frente a tumores pré-estabelecidos. O presente trabalho também avaliou a combinação da imunoterapia, baseada no vetor pgDE7h, com a quimioterapia, empregando o composto cisplatina, de forma a permitir o tratamento de tumores em estágios mais avançados de crescimento. Os resultados demonstram que a associação do plasmídeo vacinal com vesículas peptídicas mostrou-se capaz de ativar células dendríticas murinas in vitro e promover aumento na sobrevivência de animais frente ao modelo de tumores subcutâneos, sem induzir toxicidade. Quando combinada ao tratamento com cisplatina, a vacina, principalmente associada à eletroporação, demonstrou um efeito sinérgico, promovendo regressão total de tumores, aumento expressivo na ativação de linfócitos T CD8 E7-específicos, indução de resposta de memória efetora e memória residente e controle de populações imunossupressoras de forma sistêmica e no microambiente tumoral. Em resumo, a pesquisa ampliou os conhecimentos sobre a ação da imunoterapia ativa contra tumores induzidos por HPV e abriu perspectivas importantes para sua utilização em condições clínicas. / The present study aimed to improve the antitumor effects of a new immunotherapeutic strategy for the control of tumors induced by human papillomavirus type 16 (HPV-16). For this purpose, a new concept of active immunotherapy based on a recombinant DNA vaccine developed at the Laboratory of Vaccine Development at USP (pgDE7h) was used, and different experimental approaches were designed to increase the therapeutic efficacy of the treatment. Thus, the present work focused on the development of new delivery systems for the DNA vaccine using three distinct nanocarregadores, of a lipid, protein or peptidic nature, and the evaluation of the therapeutic efficacy of these in front of pre-established tumors. The present study also evaluated the combination of pgDE7h-based immunotherapy with chemotherapy using the cisplatin compound to allow the treatment of tumors in more advanced stages of growth. The results demonstrate that the association of the peptide-vesicle vaccine plasmid was shown to activate murine dendritic cells in vitro and promote increased survival of animals against the subcutaneous tumor model without inducing toxicity. When combined with cisplatin treatment, the vaccine, mainly associated with electroporation, demonstrated a synergistic effect, promoting total tumor regression, expressive increase in the activation of CD8 E7-specific T lymphocytes, induction of effector and resident memory response and control of immunosuppressive populations in a systemic way and in the tumor microenvironment. In summary, the research expanded knowledge about the action of active immunotherapy against HPV-induced tumors and opened important perspectives for its use under clinical conditions.

Submitted by Luiz Felipe Barbosa (luiz.fbabreu2@ufpe.br) on 2015-03-13T15:00:05Z No. of bitstreams: 2 TESE_Eliane_Coimbra_ 2012.pdf: 2000368 bytes, checksum: 2ec0dc2be6907bc65cd246b36e95e551 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T15:00:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE_Eliane_Coimbra_ 2012.pdf: 2000368 bytes, checksum: 2ec0dc2be6907bc65cd246b36e95e551 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-09-04 / CAPES / O câncer cervical é considerado o segundo tipo de tumor a ocasionar maior número de mortes entre as mulheres no mundo, e a infecção pelo papilomavirus humano (HPV) é a principal causa relacionada com o desenvolvimento desta neoplasia. No Brasil, o câncer cervical produz uma média de 2,5 óbitos/100.000 indivíduos. Atualmente existem duas vacinas no mercado, baseadas em “Vírus-Like Particles” (VLPs), mas o alto custo inviabiliza seu uso pelos países em desenvolvimento. As VLPs de HPV são produzidas a partir da proteína capsidial L1, contra a qual é conferida forte imunidade humoral. Uma estratégia vacinal orientada para a prevenção do câncer cervical em humanos é muito importante para a saúde pública, no entanto, como há muitas pessoas já infectadas pelo HPV, uma abordagem terapêutica se torna necessária. Neste trabalho foi proposta a expressão do gene L1 de HPV-16 em células da levedura Pichia pastoris, como base de uma estratégia preventiva e a construção de uma vacina de DNA baseada na proteína E5 do HPV-16, identificada como potencial antígeno tumoral para terapia do câncer. O gene L1 otimizado de HPV-16 foi clonado em vetor de expressão pPGK para integração no genoma de P. pastoris, sua transcrição foi confirmada por RT-PCR e a expressão da proteína detectada por dot blot, colony blot e western blot. A vacina de DNA foi construída pela inserção do gene E5 de HPV-16 otimizado e adicionado do epítopo AU1, no vetor pCIneo. Para estudo inicial da funcionalidade da construção vacinal pCI-E5sintH16, foi realizada uma análise in vitro em células HEK-293, através de RT-PCR e western blot. O estudo do gene E5 de HPV como antígeno terapêutico, apesar de pouco explorado ainda, é bastante relevante.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-04T18:49:12Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2011-Dissertação-ElydaLima.pdf: 2803583 bytes, checksum: 5b93b96556bc230adb5bb7ca5a4fb423 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-04T18:49:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2011-Dissertação-ElydaLima.pdf: 2803583 bytes, checksum: 5b93b96556bc230adb5bb7ca5a4fb423 (MD5) Previous issue date: 2011-03-16 / A bovinocultura é um dos principais destaques do agronegócio brasileiro no cenário mundial. No entanto, algumas doenças vêm causando prejuízos consideráveis entre elas está a papilomatose bovina, uma doença infectocontagiosa, de caráter tumoral, com etiologia relacionada a infecção pelo papilomavírus bovino (BPV) que se caracteriza pela formação de tumores em tecidos da pele e mucosa. Hoje se conhecem 11 tipos diferentes de Papilomavírus bovino, sendo os BPvs tipos 1, 2 e 4 oncogênicos. Até o momento não existe vacinas para o controle ou tratamento das papilomaviroses. Diferentes estudos vêm demonstrando que a proteína L2 pode ser uma candidata ao desenvolvimento de estratégias vacinais profiláticas contra o BPV. Neste trabalho, tivemos como objetivo construir um vetor vacinal a partir do plasmídeo pCINeo (Promega®) e do gene L2 de BPV1, avaliando in vitro a expressão do antígeno L2 em células de mamíferos. O gene L2 foi amplificado pela técnica de PCR a partir do genoma completo de BPV1, com uso de oligonucleotídeos específicos contendo um epítopo AU1 no primer forwarde posteriormente clonado em vetor de passagem pGEM-T Easy (Promega®) e subclonado no vetor de expressão pCIneo, gerando a construção pCIL2B1. O plasmídeo foi transfectado in vitroem células 293 para análise funcional da expressão de L2. Os resultados obtidos confirmaram a construção pCIL2B1 por PCR e sequenciamento. A capacidade desta construção expressar o gene L2 e produzir a respectiva proteína em células de mamífero foi confirmada por RT-PCR e western blot (usando anticorpo contra o epítopo AU1). / The cattle industry is one of the main highlights of the Brazilian agribusiness on the international stage. However, some diseases have caused considerable damage including bovine papillomatosis which is an infectious tumorous disease related to bovine papillomavirus (BPV) etiology and characterized by the formation of tumors in tissues of the skin and mucosa. Currently we know 11 different types of bovine papillomavirus, among which the BPv types 1, 2 and 4 are oncogenic. So far there is no vaccine or treatment for the papilomaviroses control. Different studies have reported that the L2 protein may be a candidate for the development of prophylactic vaccine strategies against BPV. The L2 protein has a potential cross-reaction with different BPVs and HPV (HumanPapillomavirus). On this paper, our objective was to construct a vector vaccine from pCINeo plasmid (Promega ®) and the gene of BPV1 L2, evaluating in vitro L2 antigen expression in mammalian cells.The L2 gene was amplifiedby PCR from thecomplete genome ofBPV1, using specifico ligo nucleotidescontainingan AU1epitopein the for wardprimerand subsequently cloned intop GEM-T Easyvector(Promega ®)and subclonedin expression vector pCIneo, pCIL2B1generatingbuilding. The plasmid was transfectedinto 293 cellsin vitrofunctional analysisforthe expression ofL2. ObtainingconstructionpCIL2B1was confirmed by PCRand sequencing.The capacityof this construction to express the geneand produce their L2 protein inmammalian cellswas confirmed by RT-PCR and western blot (usinganti body against the epitopeAU1). The results confirmed the L2 gene expression in mammalian cellsand the consequent production of the protein L2 BPV-1.

As grandes mudanças para os pesquisadores da área de vacinas sao a optimizaçao das vacinas de DNA para uso em humanos ou animais de grande porte e criar vacinas efetivas de uma única dose usando sistemas de liberação controlada apropriados. O plasmídeo de DNA codificando a proteína de heatshock 65 (hsp65) (DNA-hsp65) foi capaz de induzir resposta imune protetora e terapêutica no modelo murino da tuberculose (TB). Apesar do sucesso da vacina baseada na DNA-hsp65 em solução para proteger camundongos contra TB, esta requer múltiplas doses de grande quantidade de DNA para imunização efetiva. No intuito de otimizar esta vacina e simplificar o protocolo de vacinação, nós co-encapsulamos DNA-hsp65 e o adjuvante dimicolato de trealose (DMT) em microesferas biodegradáveis de ácido polilático-poliglicólico (PLGA) para uma única administração. Além disso, foi também desenvolvida uma formulação prime-boost da vacina de dose única baseada na mistura de duas diferentes microesferas de PLGA, apresentando liberação rápida e lenta, de DNAhsp65 e proteína hsp65 recombinante, respectivamente. Essas formulações foram testadas em cobaias pela comparação da eficácia protetora (components efetores da imunidade protetora) e toxicidade (componentes efetores da patologia) induzida pela preparação da preparação do DNA em solução ou BCG. A formulação de dose única prime-boost nitidamente apresentou maior eficácia e reduziu a patologia nos pulmões de cobaias. / The great challenges for researchers working in the field of vaccinology are optimizing DNA vaccines for use in humans or large animals and creating effective single-dose vaccines using appropriated controlled delivery systems. Plasmid DNA encoding the heat-shock protein 65 (hsp65) (DNAhsp65) has been shown to induce protective and therapeutic immune responses in a murine model of tuberculosis (TB). Despite the success of naked DNAhsp65-based vaccine to protect mice against TB, it requires multiple doses of high amounts of DNA for effective immunization. In order to optimize this DNA vaccine and simplify the vaccination schedule, we coencapsulated DNAhsp65 and the adjuvant trehalose dimycolate (TDM) into biodegradable poly(DLlactide- co-glycolide) (PLGA) microspheres for a single dose administration. Moreover, a single-shot prime-boost vaccine formulation based on a mixture of two different PLGA microspheres, presenting faster and slower release of, respectively, DNAhsp65 and the recombinant hsp65 protein was also developed. These formulations were tested in guinea pigs by comparison with the efficacy (effector components of protective immunity) and toxicity (effector components of pathology) induced by the naked DNA preparation or BCG. The single-shot prime-boost formulation clearly presented good efficacy and diminished lung pathology in guinea pigs.

Submitted by Maria Beatriz Vieira (mbeatriz.vieira@gmail.com) on 2017-08-29T11:52:09Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_thais_larre_oliveira.pdf: 616408 bytes, checksum: 404ac55ee19b90246334aac10658a361 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-08-29T19:49:36Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_thais_larre_oliveira.pdf: 616408 bytes, checksum: 404ac55ee19b90246334aac10658a361 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-08-29T19:49:43Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_thais_larre_oliveira.pdf: 616408 bytes, checksum: 404ac55ee19b90246334aac10658a361 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-29T19:49:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_thais_larre_oliveira.pdf: 616408 bytes, checksum: 404ac55ee19b90246334aac10658a361 (MD5) Previous issue date: 2014-08-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / A leptospirose é uma doença infecciosa emergente causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira, com complicações humana e veterinária. Essa doença é transmitida através do contato direto com um animal reservatório ou com o ambiente contaminado com a urina destes animais. O desenvolvimento de vacinas seguras e multivalentes contra leptospirose, que substituam as bacterinas existentes, permanece um desafio. Bacterinas são reatogênicas e conferem imunidade sorovar-específica e de curta duração. Esforços para o desenvolvimento de vacinas recombinantes tem focado em proteínas de membrana externa (OMPs). A proteína de membrana externa OmpL37 é conservada entre diferentes sorovares de Leptospira e atua na adesão aos tecidos do hospedeiro. Neste estudo, nós relatamos pela primeira vez, a avaliação do potencial imunoprotetor de OmpL37 como antígeno vacinal em hamsters, sob diferentes estratégias: vacina de subunidade, vacina de DNA e prime-boost. A caracterização da resposta imune através de ELISA indireto e qRT-PCR demonstrou que os maiores níveis de IgG foram estimulados pela vacina de subunidade, a qual também induziu resposta inflamatória. A vacina de DNA falhou em induzir imunidade humoral, porém também estimulou TNF-α. Apesar da resposta induzida, nenhuma formulação protegeu significativamente os animais contra a doença. / Leptospirosis is an emerging infectious disease caused by pathogenic spirochetes of Leptospira genus, of human and veterinary concern. This infectious disease is transmitted through direct contact with an animal reservoir or an environmental contaminated with their urine. The development of safe and multivalent vaccines against leptospirosis, which replace existing bacterins, remains a challenge. Bacterins are reactogenic and afford serovar specific and short-term immunity. Efforts to develop recombinant vaccines against leptospirosis have focused on outer membrane proteins (OMPs). The outer membrane protein OmpL37 is conserved among different Leptospira serovars and plays a role in adherence to host tissues. In this study we report for the first time, the evaluation of OmpL37 immunoprotective potential as a vaccine antigen in hamsters, under different strategies: subunit vaccine, DNA vaccine and prime-boost. The characterization of the immune response by indirect ELISA and qRT-PCR showed that higher levels of IgG were stimulated by the vaccine subunit, which also induced an inflammatory response. The DNA vaccine failed to induce humoral immunity, but also stimulated TNF-α. Despite the induced response, no formulation significantly protected the animals against the disease.

Submitted by Maria Beatriz Vieira (mbeatriz.vieira@gmail.com) on 2017-08-29T13:03:02Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_karina_colonetti.pdf: 1293824 bytes, checksum: 7b2f2dd5717e841df6224f67290648ff (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-08-29T19:50:07Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_karina_colonetti.pdf: 1293824 bytes, checksum: 7b2f2dd5717e841df6224f67290648ff (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-08-29T19:50:15Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_karina_colonetti.pdf: 1293824 bytes, checksum: 7b2f2dd5717e841df6224f67290648ff (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-29T19:50:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_karina_colonetti.pdf: 1293824 bytes, checksum: 7b2f2dd5717e841df6224f67290648ff (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / A leptospirose humana e animal é uma doença de ocorrência mundial. Várias tentativas tem sido realizadas visando o desenvolvimento de novas abordagens para a prevenção, diagnóstico e tratamento da doença.... / The human and animal leptospirosis diseases are both worldwide spread......