Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cervical cancer is the second most common cancer among women worldwide and one of the most prevalent female cancers in Brazil. In premalignant and malignant lesions of the uterine cervix the p16INK4a protein, which participates in cell cycle control, exhibits a dramatic increase in its expression possibly due to the presence of human papillomavirus (HPV) oncoproteins. Two polymorphisms in the p16 gene, p16INK4a 540C>G and p16 580C> T, are located in the 3' untranslated region (3'UTR), which is involved in the post-transcriptional regulation of gene expression. The aim of this study was to investigate possible associations between the p16 500C>G and p16 540C>T polymorphisms and the developing of cervical neoplasias and/or lesion severity, considering the expression levels of the p16INK4a protein in cervical lesions, and some classic risk factors for cervical cancer, including HPV infection. A total of 567 women residents in Rio de Janeiro was selected, 319 with abnormal cervical cytology results (case group), and 248 with no previous history of cervical cytological changes (comparison group). Peripheral blood samples from all participants were used for molecular analysis of the polymorphisms p16 500C>G and p16 540C>T, which was performed by PCR-RFLP (polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism) using the restriction enzymes MspI and HaeIII, respectively. The expression of p16 in 137 biopsies of women belonging to the group of cases was assessed by immunohistochemistry. The detection of HPV DNA in cervical cells was performed in all samples of the comparison group and in 194 samples of the case group by a PCR-based method using two primers pairs, MY09/MY11 and GP05+/GP06+. TheINK4a two study groups are in Hardy-Weinberg equilibrium. The genotype distributions for p16 500C>G and p16 540C>T and the distributions of haplotype combinations in the two groups were not statistically different. The analysis of the subgroup HSIL+cancer (cases with high-grade intraepithelial lesion or invasive carcinoma) compared to the subgroup HSIL (cases with low-grade squamous intraepithelial lesions) revealed a significant difference in the distribution of haplotype combinations (p = 0.036) and marginal differences in the genotype distributions for p16 500C>G (p = 0.071) and p16 540C>T (p = 0.051). The p16 540G allele, in heterozygosis or homozygosis (OR = 1.91, 95% CI = 1.08-3.37), and the haplotype combination p16 500C-540C 500G-540C (OR = 2.34, 95% CI = 1.202-4.555) showed to be associated with the severity of cervical lesions. On the other hand the p16 580T/T genotype (OR = 0.25, 95% CI = 0.08-0.79), and the haplotype combination p16 500C-540T 500C-540T (OR=0.27, 95% CI = 0.088-0.827) exhibited a protective effect against the development of higher grade cervical lesions. Interaction analyses between the p16 polymorphisms and the p16 protein expression or the HPV infection were compromised by the reduced number of analyzed samples. No interaction was observed between the studied polymorphisms and the classical risk factor for cervical cancer. Our data point out the importance of the p16 gene polymorphisms as severity markers in cervical neoplasia. INK4aINK4aINK4a. / O câncer de colo do útero é o segundo carcinoma mais frequente em mulheres no mundo e um dos cânceres femininos mais incidentes no Brasil. Em lesões pré-malignas e malignas do colo uterino, a proteína p16INK4a, que participa do controle do ciclo celular, apresenta um aumento considerável de sua expressão, devido possivelmente à presença de oncoproteínas do papilomavírus humano (HPV). Dois polimorfismos no gene p16INK4a, p16 500C>G e p16 540C>T, estão localizados na região 3 não traduzida (3UTR), que está envolvida na regulação pós-transcricional da expressão gênica. O objetivo deste estudo foi avaliar possíveis associações entre os polimorfismos p16 500C>G e p16 540C>T e o desenvolvimento de neoplasias cervicais e/ou a severidade das lesões, considerando os níveis de expressão da proteína p16INK4a nas lesões cervicais e certos fatores de risco clássicos para o câncer cervical, incluindo a infecção pelo HPV. Para isso, foram selecionadas 567 mulheres residentes no Rio de Janeiro, 319 com citologia cervical alterada (grupo de casos) e 248 sem história prévia de alteração citológica do colo uterino (grupo de comparação). Amostras de sangue periférico de todas as participantes foram utilizadas na análise molecular dos polimorfismos p16 500C>G e p16 540C>T através da técnica de PCR-RFLP (reação em cadeia da polimerase - polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição), usando as enzimas de restrição MspI e HaeIII, respectivamente. A expressão da proteína p16INK4a em 137 biópsias de mulheres pertencentes ao grupo de casos foi avaliada por imunohistoquímica. A detecção de DNA do HPV em células cervicais foi feita em todas as amostras do grupo de comparação e em 194 amostras do grupo de casos pela técnica de PCR, usando dois pares de oligonucleotídeos, MY09/MY11 e GP05+/GP06+. Os dois grupos de estudo se encontram em equilíbrio de Hardy-Weinberg. As distribuições genotípicas para p16 500C>G e p16 540C>T e as distribuições de combinações haplotípicas nos dois grupos não apresentaram diferenças significativas. A análise do subgrupo HSIL+câncer (casos com lesão intraepitelial de alto grau ou carcinoma invasivo) em comparação com o subgrupo LSIL (casos com lesão intraepitelial de baixo grau) revelou diferença significativa entre as distribuições das combinações haplotípicas (p = 0,036) e diferenças marginais entre as distribuições genotípicas para p16 500C>G (p = 0,071) e p16 540C>T (p = 0,051). O alelo p16 540G, em heterozigose ou homozigose (OR = 1,91, IC 95% = 1,08-3,37), e a combinação haplotípica p16 500C-540C 500G-540C (OR = 2,34, IC 95% = 1,202-4,555) mostraram-se associados com a severidade da lesões cervicais. Já o genótipo p16 540T/T (OR = 0,25, IC 95% = 0,08-0,79), e a combinação haplotípica p16 500C-540T 500C-540T (OR = 0,27, IC 95% = 0,088-0,827) exibiram papel protetor contra o desenvolvimento de lesões mais severas. As análises de interação entre os polimorfismos de p16INK4a e a expressão de p16 ou a infecção pelo HPV foram comprometidas pelo número reduzido de amostras analisadas. Não se observou qualquer interação entre os polimorfismos estudados e os fatores de risco clássicos para o câncer de colo uterino. Nossos resultados apontam para a importância dos polimorfismos do gene p16INK4a como marcadores de severidade da neoplasia cervical.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cervical cancer is the second most common cancer among women worldwide and one of the most prevalent female cancers in Brazil. In premalignant and malignant lesions of the uterine cervix the p16INK4a protein, which participates in cell cycle control, exhibits a dramatic increase in its expression possibly due to the presence of human papillomavirus (HPV) oncoproteins. Two polymorphisms in the p16 gene, p16INK4a 540C>G and p16 580C> T, are located in the 3' untranslated region (3'UTR), which is involved in the post-transcriptional regulation of gene expression. The aim of this study was to investigate possible associations between the p16 500C>G and p16 540C>T polymorphisms and the developing of cervical neoplasias and/or lesion severity, considering the expression levels of the p16INK4a protein in cervical lesions, and some classic risk factors for cervical cancer, including HPV infection. A total of 567 women residents in Rio de Janeiro was selected, 319 with abnormal cervical cytology results (case group), and 248 with no previous history of cervical cytological changes (comparison group). Peripheral blood samples from all participants were used for molecular analysis of the polymorphisms p16 500C>G and p16 540C>T, which was performed by PCR-RFLP (polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism) using the restriction enzymes MspI and HaeIII, respectively. The expression of p16 in 137 biopsies of women belonging to the group of cases was assessed by immunohistochemistry. The detection of HPV DNA in cervical cells was performed in all samples of the comparison group and in 194 samples of the case group by a PCR-based method using two primers pairs, MY09/MY11 and GP05+/GP06+. TheINK4a two study groups are in Hardy-Weinberg equilibrium. The genotype distributions for p16 500C>G and p16 540C>T and the distributions of haplotype combinations in the two groups were not statistically different. The analysis of the subgroup HSIL+cancer (cases with high-grade intraepithelial lesion or invasive carcinoma) compared to the subgroup HSIL (cases with low-grade squamous intraepithelial lesions) revealed a significant difference in the distribution of haplotype combinations (p = 0.036) and marginal differences in the genotype distributions for p16 500C>G (p = 0.071) and p16 540C>T (p = 0.051). The p16 540G allele, in heterozygosis or homozygosis (OR = 1.91, 95% CI = 1.08-3.37), and the haplotype combination p16 500C-540C 500G-540C (OR = 2.34, 95% CI = 1.202-4.555) showed to be associated with the severity of cervical lesions. On the other hand the p16 580T/T genotype (OR = 0.25, 95% CI = 0.08-0.79), and the haplotype combination p16 500C-540T 500C-540T (OR=0.27, 95% CI = 0.088-0.827) exhibited a protective effect against the development of higher grade cervical lesions. Interaction analyses between the p16 polymorphisms and the p16 protein expression or the HPV infection were compromised by the reduced number of analyzed samples. No interaction was observed between the studied polymorphisms and the classical risk factor for cervical cancer. Our data point out the importance of the p16 gene polymorphisms as severity markers in cervical neoplasia. INK4aINK4aINK4a. / O câncer de colo do útero é o segundo carcinoma mais frequente em mulheres no mundo e um dos cânceres femininos mais incidentes no Brasil. Em lesões pré-malignas e malignas do colo uterino, a proteína p16INK4a, que participa do controle do ciclo celular, apresenta um aumento considerável de sua expressão, devido possivelmente à presença de oncoproteínas do papilomavírus humano (HPV). Dois polimorfismos no gene p16INK4a, p16 500C>G e p16 540C>T, estão localizados na região 3 não traduzida (3UTR), que está envolvida na regulação pós-transcricional da expressão gênica. O objetivo deste estudo foi avaliar possíveis associações entre os polimorfismos p16 500C>G e p16 540C>T e o desenvolvimento de neoplasias cervicais e/ou a severidade das lesões, considerando os níveis de expressão da proteína p16INK4a nas lesões cervicais e certos fatores de risco clássicos para o câncer cervical, incluindo a infecção pelo HPV. Para isso, foram selecionadas 567 mulheres residentes no Rio de Janeiro, 319 com citologia cervical alterada (grupo de casos) e 248 sem história prévia de alteração citológica do colo uterino (grupo de comparação). Amostras de sangue periférico de todas as participantes foram utilizadas na análise molecular dos polimorfismos p16 500C>G e p16 540C>T através da técnica de PCR-RFLP (reação em cadeia da polimerase - polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição), usando as enzimas de restrição MspI e HaeIII, respectivamente. A expressão da proteína p16INK4a em 137 biópsias de mulheres pertencentes ao grupo de casos foi avaliada por imunohistoquímica. A detecção de DNA do HPV em células cervicais foi feita em todas as amostras do grupo de comparação e em 194 amostras do grupo de casos pela técnica de PCR, usando dois pares de oligonucleotídeos, MY09/MY11 e GP05+/GP06+. Os dois grupos de estudo se encontram em equilíbrio de Hardy-Weinberg. As distribuições genotípicas para p16 500C>G e p16 540C>T e as distribuições de combinações haplotípicas nos dois grupos não apresentaram diferenças significativas. A análise do subgrupo HSIL+câncer (casos com lesão intraepitelial de alto grau ou carcinoma invasivo) em comparação com o subgrupo LSIL (casos com lesão intraepitelial de baixo grau) revelou diferença significativa entre as distribuições das combinações haplotípicas (p = 0,036) e diferenças marginais entre as distribuições genotípicas para p16 500C>G (p = 0,071) e p16 540C>T (p = 0,051). O alelo p16 540G, em heterozigose ou homozigose (OR = 1,91, IC 95% = 1,08-3,37), e a combinação haplotípica p16 500C-540C 500G-540C (OR = 2,34, IC 95% = 1,202-4,555) mostraram-se associados com a severidade da lesões cervicais. Já o genótipo p16 540T/T (OR = 0,25, IC 95% = 0,08-0,79), e a combinação haplotípica p16 500C-540T 500C-540T (OR = 0,27, IC 95% = 0,088-0,827) exibiram papel protetor contra o desenvolvimento de lesões mais severas. As análises de interação entre os polimorfismos de p16INK4a e a expressão de p16 ou a infecção pelo HPV foram comprometidas pelo número reduzido de amostras analisadas. Não se observou qualquer interação entre os polimorfismos estudados e os fatores de risco clássicos para o câncer de colo uterino. Nossos resultados apontam para a importância dos polimorfismos do gene p16INK4a como marcadores de severidade da neoplasia cervical.

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A metilação da região promotora do DNA é a principal alteração epigenética pela qual um gene é inativado em seres humanos. A metilação do gene P16INK4a, que é um supressor de tumor e atua como inibidor da cinase dependente da ciclina, tem sido descrita como um evento precoce na carcinogênese vulvar. A metilação do gene TIMP-2, que atua como regulador de metaloproteinases, tem sido descrito como marcador de matriz extracelular. Esta pesquisa tem como objetivo estudar a presença da metilação dos genes P16INK4a e TIMP-2 no líquen escleroso vulvar e avaliar a associação das variáveis idade, doença de tireóide, tabagismo, uso de hormônio e prurido vulvar com a metilação dos referidos genes. Trata-se de um estudo transversal, onde foram analisadas 32 amostras obtidas por biópsia de pacientes com líquen escleroso vulvar. As amostras foram submetidas à extração do DNA por meio da técnica do fenol:clorofórmio e à avaliação da metilação dos genes P16INK4a e TIMP-2 pela modificação química do DNA pelo método do bissulfito. O DNA modificado foi submetido à PCR e a visualização do produto pelo gel de poliacrilamida. O estudo da associação de cada uma das variáveis com a metilação de ambos genes não mostrou significado estatístico. Notou-se que 39% (11/28) das amostras exibiram metilação somente para o gene TIMP-2, e nenhuma para o gene P16INK4a isoladamente, enquanto 32% (9/28) apresentaram metilação em ambos genes de forma simultânea. A análise da associação da metilação entre ambos genes mostrou significado estatístico (p=0,0292). Esses resultados sugerem que a associação da metilação entre os genes P16INK4a e TIMP-2 possa promover instabilidade genômica, podendo funcionar como marcador na evolução da doença. Estudos futuros sobre alterações moleculares da matriz extracelular, que por precederem as alterações morfológicas, talvez possam funcionar como sinalizador, individualizando as pacientes com maior risco de evolução do líquen escleroso vulvar para a NIV diferenciada e/ou câncer de vulva / The vulvar lichen sclerosus is involved in one of the pathways of vulvar carcinogenesis linked to differentiated vulvar intraepithelial neoplasia. The methylation of the promoter region of the DNA is the main epigenetic modification in humans in which a gene is inactivated. Methylation of P16INK4a gene, which is a tumor suppressor and acts as an inhibitor of cyclin-dependent kinase, has been described as an early event in carcinogenesis vulva. Methylation of TIMP-2 gene, which acts as a regulator of metalloproteinases, has been described as a marker of extracellular matrix. This research aims to study the presence of methylation of the P16INK4a gene and TIMP-2 in vulvar lichen sclerosus and evaluate the association of age, thyroid disease, smoking, hormone use and vulvar itching with methylation of these genes. It is a cross-sectional study, which analyzed 32 samples obtained by biopsy from patients with vulvar lichen sclerosus. The samples were subjected to DNA extraction by using the technique of phenol: chloroform and evaluation of methylation of the p16INK4a gene and TIMP-2 by chemical modification of DNA by the method of bisulfite. The modified DNA was subjected to PCR and visualization of the product by polyacrylamide gel electrophoresis. The association of each variable in the methylation of both genes showed no statistical significance. It was noted that 39% (11/28) samples showed methylation only to TIMP-2 gene, and none only for the P16INK4a gene, while 32% (9/28) exhibited methylation on both genes simultaneously. The analysis of the association between methylation of both genes showed statistical significance (p = 0.0292). These results suggest that the association between methylation of the P16INK4a gene and TIMP-2 can promote genomic instability, which can act as a marker in the evolution of the disease. Future studies on the molecular alterations of the extracellular matrix, which precede morphological changes, maybe they can function as a signal, separating the patients with higher risk of evolution of vulvar lichen sclerosus to differentiated VIN and / or cancer of the vulva