Leguminosas do gênero Stylosanthes são amplamente utilizadas na pecuária Brasileira e por sua alta qualidade nutricional são importantes para pastagens em consorcio com gramíneas. Um dos materiais mais cultivados é o denominado Campo Grande, lançado pela EMBRAPA Gado de Corte e formado pela mistura das espécies Stylosanthes capitata Vog. (80%) e Stylosanthes macrocephala M.B Ferreira et Sousa Costa (20%). De ambas as espécies que formam essa mistura, a espécie S. capitata vem sendo utilizada na pesquisa do Projeto Temático FAPESP Nº 08/58075-8 Experimentos FACE para analisar os efeitos do elevado CO e do aquecimento sobre a fotossíntese, expressão gênica, bioquímica, crescimento, dinâmica de nutrientes e produtividade de duas espécies forrageiras tropicais contrastantes que tem por objetivo determinar os efeitos do elevado nível de CO2 e do aquecimento nas espécies forrageiras S. capitata e Panicum maximum crescendo em consorcio. Antes do plantio, foi observado que o lote de sementes de S. capitata, enviadas gentilmente pela EMBRAPA Gado de Corte, apresentava sementes de diversa coloração desde amarelas, vermelhas até pretas. Em vista que a análise da expressão gênica das plantas submetidas aos tratamentos de CO2 e temperatura é um dos objetivos do projeto, surgiu a necessidade de fazer uma avaliação mais rigorosa das sementes a fim de determinar a pureza genética do lote de sementes de S. capitata, assim como determinar a presença de possíveis contaminações com S. macrocephala. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo avaliar a pureza genética de plantas da espécie S. capitata em comparação a S. macrocephala, selecionando e utilizando marcadores moleculares ideais para essa análise. Para a etapa de seleção dos marcadores, foram plantadas separadamente as sementes de diferentes cores de cada uma das espécies S. capitata e S. macrocephala. Depois de germinadas, o DNA das folhas foi extraído e analisado com os três tipos de marcadores moleculares disponíveis, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeat) e ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat polymorphic DNA). Os marcadores moleculares RAPD (OPB10), SSR (SC18-01B3, SC18-01E11, SC18-01TF11A) e ISSR (UBC1, UBC2, UBC834, UBC851, UBC862, UBC864, UBC885, UBC886) foram testados, dos quais os ISSR mostraram-se ideias, pois apresentaram claros perfis eletroforéticos diferenciando cada uma das espécies. Posteriormente à análise das sementes, foi realizada a análise de pureza genética de material vegetal de S. capitata plantado no campo para o referido projeto temático. Uma vez que S. macrocephala não foi objeto de pesquisa do projeto, sementes desta espécie foram plantadas separadamente em oito vasos, com vinte sementes cada. Após o crescimento das plantas, o DNA de folhas de ambas as espécies foi extraído e amplificado com os marcadores moleculares ISSR previamente selecionados. Através de análises estatísticas dos perfis de eletroforese, foi possível verificar que as sementes de diferentes cores pertencem à mesma espécie e que a diferente coloração estaria mais relacionada com o grau de amadurecimento das sementes do que com possíveis contaminações. No entanto, independentemente da cor, os lotes individuais de sementes de S. capitata e S. macrocephala apresentaram algum grau de contaminação. Assim, conclui-se que para a melhor caracterização da espécie em estudo e aumentar a confiabilidade das análises de expressão gênica diferencial é necessário avaliar a pureza genética de S. capitata usando marcadores moleculares. A análise da expressão gênica diferencial permitirá determinar os efeitos de elevada concentração de CO2 e da elevada temperatura a nível molecular nas plantas forrageiras em estudo. / Legumes of the genus Stylosanthes are widely used in Brazilian cattle and for their high nutritional quality are important in consortium with grasses. One of the most cultivated materials is called \"Campo Grande\" released by EMBRAPA Gado de Corte and formed by the mixture of species Stylosanthes capitata Vog. (80%) and Stylosantes macrocephala MB Ferreira et Sousa Costa (20%). Of both species forming this mixture, the species S. capitata has been used in research of the Thematic Project FAPESP No. 08/58075-8 \"FACE experiments to analyze the effects of elevated CO and warming on photosynthesis, gene expression, biochemistry, growth, nutrient dynamics and productivity of two contrasting tropical forage species\" that aims to determine the effects of high levels of CO2 and warming on forage species S. capitata and Panicum maximum growing in consortium. Before planting, it was observed that the lot of seeds of S. capitata, kindly sent by EMBRAPA, presented seeds of different coloration from yellow, red to black. Given that the analysis of gene expression in plants exposed to elevated CO2 and warming is one of the major objectives, we decided to make a more accurate assessment of the seeds in order to determine the genetic purity of the seeds of S. capitata, as well as determine the presence of possible contamination with S. macrocephala. Therefore, this study aimed to evaluate the genetic purity of the species S. capitata plants compared to S. macrocephala, selecting and using ideal molecular marker for this analysis. For the selection of markers, were separately planted in pots the seeds of different colors of each of the species S. capitata and S. macrocephala. Once germinated, DNA was extracted from leaves and analyzed with the three available types of molecular markers, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeat) and ISSR (Inter-simple sequence Repeat Polymorphic DNA). The RAPD molecular markers (OPB10), SSR (SC18-01B3, SC18-01E11, SC18-01TF11A) and ISSR (UBC1, UBC2, UBC834, UBC851, UBC862, UBC864, UBC885, UBC886) were tested, of which the ISSR were the selected, because they showed clear electrophoretic profiles differentiating each species. After the seed analysis, the analysis of genetic purity of plant material of S. capitata planted in the field for the thematic project was held. Once S. macrocephala was not the object of the research project, seeds of this species were planted separately in eight pots, with twenty seeds each. After the growth of plants, DNA from leaves of both species was extracted and amplified with the preselected molecular ISSR. Through statistical analysis of electrophoretic profiles, we found that seeds of different colors belong to the same species and the different coloring would be more related to the degree of ripening of seeds than with possible contamination. However, regardless of color, individual seed lots of S. capitata and S. macrocephala showed contamination. Thus, it is concluded that for better characterization of this species and increase the reliability of the analysis of differential gene expression is necessary to assess the genetic purity of S. capitata using molecular markers. The analysis of differential gene expression will determine the effects of elevated CO2 concentration and high temperature at the molecular level in forage plants under study.

Leguminosas do gênero Stylosanthes são amplamente utilizadas na pecuária Brasileira e por sua alta qualidade nutricional são importantes para pastagens em consorcio com gramíneas. Um dos materiais mais cultivados é o denominado Campo Grande, lançado pela EMBRAPA Gado de Corte e formado pela mistura das espécies Stylosanthes capitata Vog. (80%) e Stylosanthes macrocephala M.B Ferreira et Sousa Costa (20%). De ambas as espécies que formam essa mistura, a espécie S. capitata vem sendo utilizada na pesquisa do Projeto Temático FAPESP Nº 08/58075-8 Experimentos FACE para analisar os efeitos do elevado CO e do aquecimento sobre a fotossíntese, expressão gênica, bioquímica, crescimento, dinâmica de nutrientes e produtividade de duas espécies forrageiras tropicais contrastantes que tem por objetivo determinar os efeitos do elevado nível de CO2 e do aquecimento nas espécies forrageiras S. capitata e Panicum maximum crescendo em consorcio. Antes do plantio, foi observado que o lote de sementes de S. capitata, enviadas gentilmente pela EMBRAPA Gado de Corte, apresentava sementes de diversa coloração desde amarelas, vermelhas até pretas. Em vista que a análise da expressão gênica das plantas submetidas aos tratamentos de CO2 e temperatura é um dos objetivos do projeto, surgiu a necessidade de fazer uma avaliação mais rigorosa das sementes a fim de determinar a pureza genética do lote de sementes de S. capitata, assim como determinar a presença de possíveis contaminações com S. macrocephala. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo avaliar a pureza genética de plantas da espécie S. capitata em comparação a S. macrocephala, selecionando e utilizando marcadores moleculares ideais para essa análise. Para a etapa de seleção dos marcadores, foram plantadas separadamente as sementes de diferentes cores de cada uma das espécies S. capitata e S. macrocephala. Depois de germinadas, o DNA das folhas foi extraído e analisado com os três tipos de marcadores moleculares disponíveis, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeat) e ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat polymorphic DNA). Os marcadores moleculares RAPD (OPB10), SSR (SC18-01B3, SC18-01E11, SC18-01TF11A) e ISSR (UBC1, UBC2, UBC834, UBC851, UBC862, UBC864, UBC885, UBC886) foram testados, dos quais os ISSR mostraram-se ideias, pois apresentaram claros perfis eletroforéticos diferenciando cada uma das espécies. Posteriormente à análise das sementes, foi realizada a análise de pureza genética de material vegetal de S. capitata plantado no campo para o referido projeto temático. Uma vez que S. macrocephala não foi objeto de pesquisa do projeto, sementes desta espécie foram plantadas separadamente em oito vasos, com vinte sementes cada. Após o crescimento das plantas, o DNA de folhas de ambas as espécies foi extraído e amplificado com os marcadores moleculares ISSR previamente selecionados. Através de análises estatísticas dos perfis de eletroforese, foi possível verificar que as sementes de diferentes cores pertencem à mesma espécie e que a diferente coloração estaria mais relacionada com o grau de amadurecimento das sementes do que com possíveis contaminações. No entanto, independentemente da cor, os lotes individuais de sementes de S. capitata e S. macrocephala apresentaram algum grau de contaminação. Assim, conclui-se que para a melhor caracterização da espécie em estudo e aumentar a confiabilidade das análises de expressão gênica diferencial é necessário avaliar a pureza genética de S. capitata usando marcadores moleculares. A análise da expressão gênica diferencial permitirá determinar os efeitos de elevada concentração de CO2 e da elevada temperatura a nível molecular nas plantas forrageiras em estudo. / Legumes of the genus Stylosanthes are widely used in Brazilian cattle and for their high nutritional quality are important in consortium with grasses. One of the most cultivated materials is called \"Campo Grande\" released by EMBRAPA Gado de Corte and formed by the mixture of species Stylosanthes capitata Vog. (80%) and Stylosantes macrocephala MB Ferreira et Sousa Costa (20%). Of both species forming this mixture, the species S. capitata has been used in research of the Thematic Project FAPESP No. 08/58075-8 \"FACE experiments to analyze the effects of elevated CO and warming on photosynthesis, gene expression, biochemistry, growth, nutrient dynamics and productivity of two contrasting tropical forage species\" that aims to determine the effects of high levels of CO2 and warming on forage species S. capitata and Panicum maximum growing in consortium. Before planting, it was observed that the lot of seeds of S. capitata, kindly sent by EMBRAPA, presented seeds of different coloration from yellow, red to black. Given that the analysis of gene expression in plants exposed to elevated CO2 and warming is one of the major objectives, we decided to make a more accurate assessment of the seeds in order to determine the genetic purity of the seeds of S. capitata, as well as determine the presence of possible contamination with S. macrocephala. Therefore, this study aimed to evaluate the genetic purity of the species S. capitata plants compared to S. macrocephala, selecting and using ideal molecular marker for this analysis. For the selection of markers, were separately planted in pots the seeds of different colors of each of the species S. capitata and S. macrocephala. Once germinated, DNA was extracted from leaves and analyzed with the three available types of molecular markers, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeat) and ISSR (Inter-simple sequence Repeat Polymorphic DNA). The RAPD molecular markers (OPB10), SSR (SC18-01B3, SC18-01E11, SC18-01TF11A) and ISSR (UBC1, UBC2, UBC834, UBC851, UBC862, UBC864, UBC885, UBC886) were tested, of which the ISSR were the selected, because they showed clear electrophoretic profiles differentiating each species. After the seed analysis, the analysis of genetic purity of plant material of S. capitata planted in the field for the thematic project was held. Once S. macrocephala was not the object of the research project, seeds of this species were planted separately in eight pots, with twenty seeds each. After the growth of plants, DNA from leaves of both species was extracted and amplified with the preselected molecular ISSR. Through statistical analysis of electrophoretic profiles, we found that seeds of different colors belong to the same species and the different coloring would be more related to the degree of ripening of seeds than with possible contamination. However, regardless of color, individual seed lots of S. capitata and S. macrocephala showed contamination. Thus, it is concluded that for better characterization of this species and increase the reliability of the analysis of differential gene expression is necessary to assess the genetic purity of S. capitata using molecular markers. The analysis of differential gene expression will determine the effects of elevated CO2 concentration and high temperature at the molecular level in forage plants under study.

Morphological markers are useful tools for identifying off-type (atypical plants) in seed production fields. However, environmental factors can cause changes in certain individuals phenotype, turning molecular markers into useful tools for verification of possible genotypic differences between these individuals and the variety studied. The aim of this study was to evaluate the efficiency of SNP markers in identifying off-type based on genotypic and phenotypic (false positive) discrimination in soybean field production. Ten lines developed by Syngenta Breeding Program located in Cascavel-PR, Uberlândia-MG and Lucas do Rio Verde-MT were used. Each line was planted in its adaptation environment in the summer season / 2009-10. Data was collected from 22 morphological features for each line. After properly describing each line, field increases of these ten lines were carried out in Planura-MG, in the winter season / 2010. In the growth stages R6 and R7 the plants phenotypically atypical for each line were collected and evaluated, to which were considered only characteristics controlled by complex genetics. The DNA of the collected plants was analyzed using SNP markers. Twenty SNP assays were used, where each marker represented one soybean chromosome in order to cover the entire genome. Among the plants considered phenotypic off-type using visual morphological traits analyses, only 27.64% were confirmed by molecular tool as genetically distinct from the standard population, with a confidence interval between 19.7% and 35.5%. The use of molecular tools is effective for the discrimination of off-type genotypic and phenotypic (false positive) process due to environmental factors, preventing the write-off of seed lots that may meet the high genetic standards. / Os marcadores morfológicos são ferramentas úteis no processo de identificação de off-type (plantas atípicas) em campos de produção de sementes, mas fatores ambientais podem gerar alteração no fenótipo de determinados indivíduos, sendo os marcadores moleculares ferramentas úteis no processo de validação da real diferença genotípica entre esses indivíduos e a cultivar em estudo. Objetivou-se nesse trabalho avaliar a eficiência do uso de marcadores moleculares SNP s na discriminação de off-type genotípicos e fenotípicos (falso positivos) em campos de produção de sementes de soja. Foram utilizadas dez linhagens desenvolvidas pelos programas de melhoramento genético da Syngenta Seeds Ltda., situados em Cascavel-PR, Uberlândia-MG e Lucas do Rio Verde-MT. Cada linhagem foi semeada em seu ambiente de adaptação na safra de verão do ano 2009/10. Foram então coletados dados de 22 características morfológicas para cada linhagem. Após devidamente descrita cada linhagem, na safra de inverno do ano 2010 foram implantados campos de multiplicação das dez linhagens, na cidade de Planura-MG. Nos estádios fenológicos R6 e R7 foram coletadas as plantas fenotipicamente avaliadas como atípicas para cada linhagem, para qual foram consideradas características de controle genético complexo. As plantas foram encaminhadas para o Laboratório de Genética Molecular da Syngenta, em Uberlândia-MG, onde suas sementes foram germinadas e o DNA das plântulas analisado com o uso de marcadores moleculares SNP. Foram utilizados 20 SNP assays, sendo que cada marcador representou um cromossomo da soja, visando cobrir todo o genoma. Entre as plantas consideradas off-type fenotípicos por meio da análise visual dos descritores morfológicos, apenas 27,64% foram confirmados pela ferramenta molecular como geneticamente distintos da população padrão, com um intervalo de confiança entre 19,7% e 35,5%. O uso de ferramentas moleculares é útil no processo de distinção de off-type genotípicos e fenotípicos (falso positivos) devido a fatores ambientais, evitando o descarte de lotes de sementes com alto padrão genético. / Mestre em Agronomia