Embora a imunização gênica apresente vantagens sobre as vacinas convencionais, nem sempre a produção de anticorpos e a conseqüente proteção conferida pelo sistema imune contra o antígeno de interesse são satisfatórias. As causas da baixa eficácia da imunização gênica, nestes casos, ainda são pouco conhecidas, porém um dos pontos mais relevantes em todo o processo é a eficiência da transfecção do DNA. O sucesso desta metodologia depende do estabelecimento de um sistema de entrega de gene eficiente e seguro. De acordo com a teoria proposta de Kuhn et al. (1999), baixas concentrações de moléculas anfifílicas podem ser usadas para neutralizar a carga do DNA, sem a formação de lipossomos. Este trabalho teve como objetivo avaliar o uso do lipídio catiônico dimetildioctadecil brometo de amônio (DDAB) como neutralizador da carga do DNA para a imunização de camundongos. Para a realização dos experimentos, um plasmídeo expressando a proteína do capsídeo (CA) do vírus da artrite encefalite caprina (CAEV), sob o comando do promotor citomegalovírus humano (CMV), foi utilizado nas imunizações. Os camundongos foram divididos em cinco grupos e receberam, via subcutânea, três inoculações de 10 μg de DNA linear (grupo 1), DNA linear mínimo (grupo 2), DNA circular (grupo 3) associados a 2,7 μg de DDAB ou DNA circular nu (grupo 4). O grupo controle foi inoculado com 2,7 μg de DDAB em solução fisiológica. Os camundongos imunizados com o plasmídeo na forma linear associado ao DDAB apresentaram maiores títulos de anticorpos CA que os inoculados com a forma circular ou linear mínima. Os dados sugerem que o lipídio catiônico DDAB tem potencial de uso como veículo de transfecção gênica em animais. / Genetic immunization has several advantages over conventional vaccines. However, antibody production and protection against the antigen of interest are often not satisfactory. In these cases, the causes of the low effectiveness of the genetic immunization are still poorly understood. One of the most relevant points in the immunization process is the DNA delivery. A successful DNA vaccine depends on the establishment of an efficient and safe gene delivery system. In accordance with Kuhn et al. (1999), low concentrations of amphiphilic molecules can be used to neutralize the DNA charge without the formation of liposomes. The aim of this study was to examine the effect of cationic lipid dimethildioctadecyl-ammonium bromide (DDAB) as a charge neutralizer for DNA for the immunization in mice. A plasmid expressing the capsid protein (CA) of caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) under the control of the human cytomegalovirus immediate early promoter (hCMVie1) was used in the immunization. Mice were grouped and immunized with three injections of either 10 μg of linear DNA (group 1), minimal linear DNA (group 2) or circular DNA (group 3) associated with 2,7 μg of DDAB or naked circular DNA (group 4). The control group received 2,7 μg of DDAB diluted in physiologic solution. Mice immunized with DNA in linear form associated with DDAB developed higher titers of antibodies against CA than the animals immunized with the circular or minimal linear form. The data suggest that lipidic cationic DDAB could be a useful delivery system for genetic immunization.

Embora a imunização gênica apresente vantagens sobre as vacinas convencionais, nem sempre a produção de anticorpos e a conseqüente proteção conferida pelo sistema imune contra o antígeno de interesse são satisfatórias. As causas da baixa eficácia da imunização gênica, nestes casos, ainda são pouco conhecidas, porém um dos pontos mais relevantes em todo o processo é a eficiência da transfecção do DNA. O sucesso desta metodologia depende do estabelecimento de um sistema de entrega de gene eficiente e seguro. De acordo com a teoria proposta de Kuhn et al. (1999), baixas concentrações de moléculas anfifílicas podem ser usadas para neutralizar a carga do DNA, sem a formação de lipossomos. Este trabalho teve como objetivo avaliar o uso do lipídio catiônico dimetildioctadecil brometo de amônio (DDAB) como neutralizador da carga do DNA para a imunização de camundongos. Para a realização dos experimentos, um plasmídeo expressando a proteína do capsídeo (CA) do vírus da artrite encefalite caprina (CAEV), sob o comando do promotor citomegalovírus humano (CMV), foi utilizado nas imunizações. Os camundongos foram divididos em cinco grupos e receberam, via subcutânea, três inoculações de 10 μg de DNA linear (grupo 1), DNA linear mínimo (grupo 2), DNA circular (grupo 3) associados a 2,7 μg de DDAB ou DNA circular nu (grupo 4). O grupo controle foi inoculado com 2,7 μg de DDAB em solução fisiológica. Os camundongos imunizados com o plasmídeo na forma linear associado ao DDAB apresentaram maiores títulos de anticorpos CA que os inoculados com a forma circular ou linear mínima. Os dados sugerem que o lipídio catiônico DDAB tem potencial de uso como veículo de transfecção gênica em animais. / Genetic immunization has several advantages over conventional vaccines. However, antibody production and protection against the antigen of interest are often not satisfactory. In these cases, the causes of the low effectiveness of the genetic immunization are still poorly understood. One of the most relevant points in the immunization process is the DNA delivery. A successful DNA vaccine depends on the establishment of an efficient and safe gene delivery system. In accordance with Kuhn et al. (1999), low concentrations of amphiphilic molecules can be used to neutralize the DNA charge without the formation of liposomes. The aim of this study was to examine the effect of cationic lipid dimethildioctadecyl-ammonium bromide (DDAB) as a charge neutralizer for DNA for the immunization in mice. A plasmid expressing the capsid protein (CA) of caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) under the control of the human cytomegalovirus immediate early promoter (hCMVie1) was used in the immunization. Mice were grouped and immunized with three injections of either 10 μg of linear DNA (group 1), minimal linear DNA (group 2) or circular DNA (group 3) associated with 2,7 μg of DDAB or naked circular DNA (group 4). The control group received 2,7 μg of DDAB diluted in physiologic solution. Mice immunized with DNA in linear form associated with DDAB developed higher titers of antibodies against CA than the animals immunized with the circular or minimal linear form. The data suggest that lipidic cationic DDAB could be a useful delivery system for genetic immunization.

Embora a imunização gênica apresente vantagens sobre as vacinas convencionais, nem sempre a produção de anticorpos e a conseqüente proteção conferida pelo sistema imune contra o antígeno de interesse são satisfatórias. As causas da baixa eficácia da imunização gênica, nestes casos, ainda são pouco conhecidas, porém um dos pontos mais relevantes em todo o processo é a eficiência da transfecção do DNA. O sucesso desta metodologia depende do estabelecimento de um sistema de entrega de gene eficiente e seguro. De acordo com a teoria proposta de Kuhn et al. (1999), baixas concentrações de moléculas anfifílicas podem ser usadas para neutralizar a carga do DNA, sem a formação de lipossomos. Este trabalho teve como objetivo avaliar o uso do lipídio catiônico dimetildioctadecil brometo de amônio (DDAB) como neutralizador da carga do DNA para a imunização de camundongos. Para a realização dos experimentos, um plasmídeo expressando a proteína do capsídeo (CA) do vírus da artrite encefalite caprina (CAEV), sob o comando do promotor citomegalovírus humano (CMV), foi utilizado nas imunizações. Os camundongos foram divididos em cinco grupos e receberam, via subcutânea, três inoculações de 10 μg de DNA linear (grupo 1), DNA linear mínimo (grupo 2), DNA circular (grupo 3) associados a 2,7 μg de DDAB ou DNA circular nu (grupo 4). O grupo controle foi inoculado com 2,7 μg de DDAB em solução fisiológica. Os camundongos imunizados com o plasmídeo na forma linear associado ao DDAB apresentaram maiores títulos de anticorpos CA que os inoculados com a forma circular ou linear mínima. Os dados sugerem que o lipídio catiônico DDAB tem potencial de uso como veículo de transfecção gênica em animais. / Genetic immunization has several advantages over conventional vaccines. However, antibody production and protection against the antigen of interest are often not satisfactory. In these cases, the causes of the low effectiveness of the genetic immunization are still poorly understood. One of the most relevant points in the immunization process is the DNA delivery. A successful DNA vaccine depends on the establishment of an efficient and safe gene delivery system. In accordance with Kuhn et al. (1999), low concentrations of amphiphilic molecules can be used to neutralize the DNA charge without the formation of liposomes. The aim of this study was to examine the effect of cationic lipid dimethildioctadecyl-ammonium bromide (DDAB) as a charge neutralizer for DNA for the immunization in mice. A plasmid expressing the capsid protein (CA) of caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) under the control of the human cytomegalovirus immediate early promoter (hCMVie1) was used in the immunization. Mice were grouped and immunized with three injections of either 10 μg of linear DNA (group 1), minimal linear DNA (group 2) or circular DNA (group 3) associated with 2,7 μg of DDAB or naked circular DNA (group 4). The control group received 2,7 μg of DDAB diluted in physiologic solution. Mice immunized with DNA in linear form associated with DDAB developed higher titers of antibodies against CA than the animals immunized with the circular or minimal linear form. The data suggest that lipidic cationic DDAB could be a useful delivery system for genetic immunization.

Submitted by Irene Nascimento (irene.kessia@ufpe.br) on 2016-07-13T17:18:53Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Marcelo Cordeiro definitiva 2015.pdf: 5642335 bytes, checksum: cb50fdd5ae64295157f0535b7f488925 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-13T17:18:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Marcelo Cordeiro definitiva 2015.pdf: 5642335 bytes, checksum: cb50fdd5ae64295157f0535b7f488925 (MD5) Previous issue date: 2015-03-13 / CAPES / Imunização genética contra o câncer cervical baseado no oncogene E5 do papilomavírus humano tipo 16 A infecção persistente pelo HPV16 está associada com cânceres cervicais anogenitais e um subconjunto de cânceres de cabeça e pescoço. E5, E6 e E7 são oncoproteínas virais que contribuem com a transformação de queratinócitos humanos. Além de potencializar a habilidade das proteínas E6 e E7 na imortalização/invasão de queratinócitos primários, as proteínas E5 de HPV de alto risco têm participação relevante nas fases precoces de transformação, como na alteração da via dependente do receptor do fator de crescimento epidermal. Entretanto, o antígeno E5 como candidato vacinal ainda não foi devidamente explorado. Ainda, as linhagens celulares mais utilizadas como modelos de desafio tumoral podem não simular os padrões de expressão dos oncogenes de HPV, já que, sua expressão é dirigida por promotores diferentes dos de HPV. Este trabalho utilizou um novo modelo de desafio para validar vacinas anti-HPV baseado em células C3, as quais apresentam a expressão do HPV sob controle de seu próprio promotor. Duas versões do oncogene E5 de HPV16 foram geradas como vacinas de DNA; uma mantendo a sequência íntegra do gene E5 e outra codificando apenas seus dois prováveis epítopos imunogênicos em duplicata. As candidatas vacinais foram submetidas a experimentos in vivo para demonstração de efeitos anti-tumorais contra células C3. Sob regime preventivo ou terapêutico, tumores em camundongos vacinados sofreram efeitos de imunidade celular, conforme indicado pelo acompanhamento do desenvolvimento tumoral e ensaios de ELISPOT. Os efeitos anti-tumorais elicitados pela imunização genética baseada em E5 foram equiparáveis àqueles obtidos por abordagem similar adotada por imunização genética baseada em E6 e E7. O aprimoramento técnico sobre esta abordagem deve, no futuro, resultar em perspectivas de estudos clínicos baseados na imunização genética com E5 contra o HPV e seus tumores associados / Genetic immunization against cervical cancer based on human papillomavirus 16 E5 oncogene HPV16 persistent infection is associated with cervical and anogenital cancers and a subset of head and neck cancers. E5, E6 and E7 are oncoproteins that contribute to human keratinocytes viral transformation. Further enhancing E6/E7-mediated immortalization/invasion of primary keratinocytes, high risk HPV E5 proteins have significant participation in early stages of transformation, for example, by triggering epidermal growth factor receptor (EGFR)-dependent cell growth. However, E5 antigen as a vaccine candidate has not been well explored yet. In addition, the most commonly cell lines used as tumor challenge models may not properly simulate the HPV oncogene expression patterns, since its expression is directed by non-HPV promoters. This study has adopted a new challenge model based on C3 cell line to evaluate anti-HPV vaccines, which present HPV expression driven by its own promoter. Two E5-based versions were generated as DNA vaccines; an HPV16 E5 whole gene sequence and another gene, that encodes only two likely immunogenic epitopes in duplicate. Vaccine candidates were subjected to in vivo experiments in order to demonstrate anti-tumor effects against HPV16-expressing C3 cells-bearing mice. Under preventive or therapeutic procedure, tumors in vaccinated mice suffered cellular immunity effects, as indicated by monitoring tumor growth and ELISPOT assays. The anti-tumor effects elicited by genetic immunization based on E5 were comparable to those obtained by similar approach taken by genetic immunization based on E6 and E7. The technical improvement on this approach should, in future, results in prospects for clinical studies based on E5 genetic immunization against HPV and its associated tumors.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-21T11:40:46Z No. of bitstreams: 1 carina-cantelli-pacheco-de-oliveira.pdf: 4119562 bytes, checksum: e15daef4939ba93f9357a8bbf218d494 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-21T11:40:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carina-cantelli-pacheco-de-oliveira.pdf: 4119562 bytes, checksum: e15daef4939ba93f9357a8bbf218d494 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O interferon beta (IFN-β) é uma proteína globular consistindo de cinco cadeias α-helicais e como biofármaco é principalmente utilizado para o tratamento da esclerose múltipla (EM). A EM é uma doença até o momento sem cura e das terapias imunomodulatórias disponíveis para melhoria do quadro da EM, o IFN-βé o biofármaco disponível mais bem caracterizado. Duas formas do IFN-βhumano recombinante são clinicamente utilizadas: IFN-β-1a, produzida em células de ovários de hamster chinês (CHO), similar ao IFN-βnativo; e a forma IFN-β-1b, produzida em sistema de Escherichia coli, não possuindo moléculas de açúcar na cadeia polipeptídica expressa. Testes para detecção e quantificação dos IFNs são principalmente do tipo ELISA sendo cruciais nos processos de desenvolvimento, monitoramento e no controle de qualidade, devido principalmente a relação sensibilidade/especificidade necessária. Os anticorpos monoclonais (Mabs) de alta afinidade, produzidos para estes testes são extremamente sensíveis e específicos e representam uma forma adequada de padronização de um ELISA para detecção e quantificação do IFN-β. Neste estudo, quatorze MAbs anti-IFN-βforam obtidos através da imunização genética e parcialmente caracterizados. Todos reconheceram no ELISA o IFN-βhumano recombinante. Os MAbs anti-IFN-βidentificados como AE9, AG8, AE6, AH7, AA11, AB1 e AA4 foram os mais reativos. Todos os quatorze MAbs foram isotipados e apresentaram um perfil com simultânea expressão tanto de IgM quantode IgG2a. Este perfil não-usual foi confirmado pela reação em cadeia da polimerase precedida da transcrição reversa específica para IgG e IgM. Somente um MAb denominado AG8 reagiu em Western-blotcom a isoforma monomérica de 18 KDa do IFN-β. Este estudo representou o primeiro passo em direção ao propósito de obtenção do ELISA descrito acima. / Beta interferon (IFN-β) is a globular protein consisting of five α-helical chains. As biopharmaceutical product it is mainly used for treatment of multiple sclerosis (MS). MS is a health disorder with no cure available so far. Its symptoms can be alleviated with immunomodulatory drugs. IFN-βis the most well characterized biopharmaceutical product in terms of structure and side affects. Two forms of human recombinant IFN-βare used in the treatment of MS: IFN-β-1a, expressed in Chinese hamster ovary cells, is similar to native IFN-β; and IFN-β-1b expressed in the Escherichia coli expression system. IFN-β-1b does not present glycosilation and therefore differs from native IFN-β. Tests to detect and to quantify IFNs are mainly enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). These tests are reliable and can be used in biopharmaceutical product development processes. Monitoring and quality control of IFN-βare quite important, mainly because of the physical and chemical nature of IFN-βas well the necessary sensitivity and specificity that allow for a precise characterization of the final product. Monoclonal antibodies (MAbs) used in ELISA to detect and quantify IFN-βusually present high affinity and specificity. In this study, fourteen MAbs against human recombinant IFN-βwere obtained by genetic immunization and partially characterized. All antibodies recognized human IFN-β. The anti-IFN-βMAbs AE9, AG8, AE6, AH7, AA11, AB1 and AA4 were the most reactives. All fourteen MAbs were subjected to antibody isotype characterization and presented a simultaneous expression of both IgM and IgG2a. Thisunusual profile was confirmed by specific reverse transcription polymerase chain reaction for IgG and IgM messenger RNA. Only MAb AG8 recognized the 18 KDa isoform of IFN-β. This study represents the first step towards the development of the ELISA described above.