Orientador: José Osmar Gaspar / Banca: Claudia Regina Bonini Domingos / Banca: Eliezer Rodrigues de Souto / Resumo: O presente trabalho consistiu no seqüenciamento e caracterização molecular das Cadeias Abertas de Leitura (Open Reading Frames - ORFs) 2 e 3 do genoma do isolado São Paulo do Southern bean mosaic virus (SBMV-SP), completando-se o seqüenciamento de todo o genoma desse isolado. A ORF 2 codifica uma poliproteína (serino protease - VPg - RNA polimerase RNA-dependente) e a ORF 3 um produto com função desconhecida. O seqüenciamento da ORF 2 apresentou 2889 nucleotídeos, incluindo-se o códon de terminação UGA, com 962 aminoácidos deduzidos e massa molecular estimada de aproximadamente 105 kDa. Dentro da ORF 2, localiza-se a ORF 3 contendo 398 nucleotídeos, incluindo-se o códon de terminação UAA, com 132 aminoácidos e massa molecular estimada de aproximadamente 15 KDa. A análise feita a partir das seqüências das ORFS 2 e 3 do genoma do SBMV-SP, quando comparadas com outras espécies do mesmo gênero e isolados do SBMV, depositadas no GenBank, mostrou que a ORF 2 apresenta maior identidade (91,4% na seqüência de nucleotídeos e 95,0% na seqüência de aminoácidos deduzidos) com o isolado de Arkansas. Resultado similar foi obtido em relação à ORF 3 com valores de identidade de 97,0% tanto para as seqüências de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos. Dados de filogenia corroboram os dados de identidade. Regiões conservadas do gênero Sobemovirus também foram identificadas, tais como Sítio de Ligação à Capa Protéica (CBPS), a tríade catalítica da serino protease (H-D-S) e a seqüência de heptanucleotídeos (TTTAAAC). A expressão em Escherichia coli da porção C-terminal da RNA Polimerase RNA Dependente (RpRd) produziu uma proteína de fusão de aproximadamente 67 kDa no sistema pMAL c2-x e de 30 kDa no sistema pET 28a. Quando a proteína de fusão foi injetada em coelhos houve a produção de anti-soro específico para a proteína recombinante. / Abstract: The present work consisted of the sequencing and molecular characterization of the Open Reading Frames (ORFs) 2 and 3 from the São Paulo isolate genome of Southern bean mosaic virus (SBMV-SP), completing the sequencing of all the genome of this isolate. The ORF 2 encodes a polyprotein (serine protease - VPg - RNA dependent RNA polimarase) and the ORF 3 one product with unknown function. The sequencing of the ORF 2 reveals 2889 nucleotides, including the stop codon (UGA), with 962 deduced amino acids e and estimated molecular weight of approximately 105 kDa. Nested in the ORF 2 were found the ORF 3 with 398 nucleotides, including the stop codon (UAA), with 132 deduced amino acids and estimated molecular weight of approximately 15 kDa. The analysis made from the sequences of the ORFs 2 and 3 from the SBMV-SP genome, when compared with other species of the same gender and isolates of SBMV, deposited in the GenBank, showed that the ORF 2 presents higher identity (91,4% in the nucleotide sequence and 95,0% in the deduced amino acids sequence) with Arkansas isolate. Similar result was obtained in relation to the ORF 3 with identity values of 97,0% for the nucleotides and deduced amino acids sequences. Phylogeny data corroborate the identity data. Conserved regions of the Sobemovirus gender had also been identified such as Coat Protein Binding Site (CPBS), serine protease catalytic triad (H-D-S) and heptanucleotide sequence (TTTAAAC). The Expression in Escherichia coli of the C-terminal region of the RNA dependent RNA polimerase produced a fusion protein of approximately 67 kDa in pMAL c2-x system and a 30 kDa protein in pET 28a system. When the fusion protein ...(Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Walter Filgueira de Azevedo Júnior / Banca: Paulo Sérgio Lopes de Oliveira / Banca: Paula Regina Kuser Falcão / Banca: Jorge Chahine / Banca: José Roberto Ruggiero / Resumo: O seqüenciamento de genomas em larga escala estão nos munindo com várias informações biológicas sobre centenas de organismos. O entendimento das diferentes funções de proteínas expressas por genes obtidos nos projetos de seqüenciamento, nos leva à era pós-genômica, com a caracterização das estruturas 3D de proteínas. A determinação de estruturas de proteínas nem sempre é possível devido a limitações nas técnicas de cristalografia de raios X e RMN, tornando a utilização da modelagem molecular comparativa muito útil. O principal interesse no estudo de vias metabólicas identificadas em genomas de patógenos, é o fato de que algumas destas vias não estão presentes em humanos, o que as tornam alvos seletivos para desenho de drogas, diminuindo o impacto das drogas em humanos. O DBMODELING é um banco de dados relacional, criado para evidenciar a importância dos métodos de modelagem molecular aplicadas ao genoma do Mycobacterium tuberculosis. A motivação deste trabalho é o fato de que o M. tuberculosis é a causa de morte de milhões de pessoas no mundo, assim a caracterização estrutural de proteínas alvo para propor novas drogas tornou-se essencial. Há atualmente no banco de dados mais de 260 modelos de proteínas do genoma do M. tuberculosis e outros genomas de interesse também serão acrescentados. Este banco de dados contém uma descrição detalhada da reação catalisada, do gene e da qualidade estrutural de cada proteína, e suas coordenadas atômicas estão disponíveis para download, podendo ser acessadas em http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/tools. Este trabalho aumenta a certeza de que a modelagem comparativa é uma ferramenta útil em bioinformática estrutural, uma vez que não se tem acesso às estruturas determinadas experimentalmente, podendo ser valiosa na anotação de seqüências genômicas, contribuindo para a genômica estrutural e funcional, e simulações de docking proteína-ligante. / Abstract: The large-scale genome sequencing are providing us with several information about hundreds of organisms. Understanding of different protein functions expressed by genes obtained in the sequencing projects, lead us to the post-genomic era, with characterization of protein 3D structure. The determination of protein structure, is not always possible, due to limitations in X-ray crystallography and NMR techniques. This fact makes the utilization of comparative modeling very useful. The main interest in the study of metabolic pathways is the fact that some of these pathways are not present in human, which make them selective targets for drug design, decreasing the impact of drugs in humans. DBMODELING is a relational database, created to highlight the importance of molecular modeling methods applied in the Mycobacterium tuberculosis genome. The motivation of this work is the fact that M. tuberculosis is the cause of the deaths of milions of people in the world, thus the protein target structural characterization to propose new drugs became essential. There are currently in the database more than 260 protein models of the M. tuberculosis genome, and other genomes of interest will be added. This database contains a detailed description of reaction catalized, of gene and structural quality of each protein, and their atomic coordinates are available to download, can be accessed at http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/tools.This work increase the conviction that comparative modeling is an useful tool in structural bioinfomatics, once that we have not access to the experimentally structures determinated, can be valuable in annotating genome sequence, contributing to the structural and functional genomics, and protein-ligand docking simulations. / Doutor

Orientador: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Ricardo Antonio Polanczyk / Banca: Sabrina Moutinho Chabregas / Banca: Janete Apparecida Desidério Sena / Banca: Antonio Sérgio Ferraudo / Resumo: A bactéria B. thuringiensis caracteriza-se pela produção de proteínas tóxicas a representantes de diversas ordens de insetos, as quais são codificadas por genes cry. Este trabalho foi realizado com objetivo de selecionar isolados de B. thuringiensis por meio da caracterização morfológica e molecular identificando as diferentes subclasses dos genes cry3, cry7, cry8, cry9 e cry35 e determinar a patogenicidade contra Sphenophorus levis, que é uma das mais importantes pragas da cultura da cana-de-açúcar. Foram utilizados 1128 isolados de B. thuringiensis e com a observação em microscópio com contraste de fases foram confirmadas como pertencentes à espécie de B. thuringiensis e três linhagens padrões. O material genético foi extraído pela matriz de troca iônica "Instagene Matrix" e submetido a PCR com iniciadores gerais cry3, cry7, cry8, cry9 e cry35 identificando-se 45 isolados com produto de amplificação para coleópteros, os quais juntamente com as linhagens padrões de B. thuringiensis var. tenebrionis, var. morrissone e var. tolworthi e testemunhas foram utilizados para a realização do bioensaio. A análise discriminante alocou os isolados em três grupos quanto à toxicidade de B. thuringiensis e os grupos ficaram assim definidos: um grupo de BAIXA efetividade, com 19,60% do total dos isolados, nesse grupo ficaram as testemunhas e uma linhagem padrão B. thuringiensis var. morrissone e isolados do LGBBA; um grupo de MÉDIA efetividade, com 66,67% do total dos isolados, nesse grupo ficaram duas linhagens padrões B. thuringiensis var. tolworthi e var. morrissone e isolados do LGBBA e um grupo com ALTA efetividade com 13,72% do total dos isolados do LGBBA, os quais podem ser considerados promissores no controle biológico de S. levis. / Abstract: Molecular characterization and selection of B. thuringiensis isolates exhibiting potential control on Sphenophorus levis larvae. Bacillus thuringiensis is characterized by the production of toxic proteins to insects from a number of different orders which are coded by the cry genes. This work was developed aiming to select B. thuringiensis isolates using morphological and molecular analysis so as to identify different cry genes subclass for cry3, cry7, cry8, cry9 and cry35 and also to determine the pathogenicity levels against Sphenophorus levis larvae, that is one of the most important sugar-cane pests. As much as 1128 bacterial isolates together with three control strains were used and for the phase contrast microscopy and molecular analysis. The genetic materials were obtained using the Instagene Matrix that is an ionic matrix and the PCR primers used were developed for cry3, cry7, cry8, cry9 and cry35 genes. A total of 45 isolates were selected showing possible amplicons for coleopterans. These isolates together with the standard strains B. thuringiensis var. tenebrionis, var. morrissone a var. tolworthi were used for bioassays. A discriminating analysis has allocated the bacterial isolates within three groups of B. thuringiensis toxicity and these groups were defined as one with LOW effectivity, comprising 19,6% of the isolates and the control strains together with one of the control strains B. thuringiensis var. morrissone. Another group has revealed a MEDIAN effectivity with a total of 66.7% of the isolates including two other control strains B. thuringiensis var. tolworthi e var. morrissone and a third group with HIGH effectivity with 13.7% of the isolates which were considered as promising B. thuringiensis isolates for the control of S. levis larvae. / Doutor

Orientadora: Eliana Gertrudes Macedo Lemos / Banca: Maria José Valarini / Banca: Haroldo Alves Pereira Junior / Banca: Lúcia Maria Carareto Alves / Banca: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Resumo: Bactérias simbiontes conhecidos como rizóbios interagem com raízes de leguminosas e induzem a formação de nódulos fixadores de nitrogênio. Em rizóbios, genes essenciais para simbiose são compartimentalizados em ilhas simbióticas ou em ilhas no cromossoma. Para o entendimento da estrutura e evolução dessas ilhas simbióticas, é necessário analisar seu contexto genético e sua organização. O genoma parcial de B. elkanii SEMIA 587 apresenta hoje um total de 5.821.111 pb seqüenciados contendo 62,6 % de GC em 3941 Contigs, onde foram identificados 5381 ORFs. Uma suposta ilha simbiótica foi localizada através da identificação de genes relacionados à fixação e nodulação em comparação à ilha simbiótica de B. japonicum, encontrando 267 ORFs em B. elkanii, onde 17 ORFs foram identificadas como transposases. Assim, através destes resultados parciais pode ser possível averiguar que B. elkanii provavelmente sofreu um rearranjo genético no cromossoma, já que ele apresenta um tamanho menor que B. japonicum em relação ao tamanho do genoma. / Abstract: Symbiont bacteria, commonly known as rhizobia interact with root legume and induce the formation of Nitrogen-fixing nodules. Among rhizobia, essential genes for symbioses are compartmentalized either in symbiotic islands or in chromosomal islands. For better understanding of the structure and evolution of these symbiotic islands, it is necessary to analyze their genetic context and organization. The work had as objective to analyze genes related to the symbiotic island in the partial genoma of the B. elkanii strain 587 has 5.821.111 bp sequenced, containing 62,6 % of GC in 3941 Contigs, been identified 5381 ORFs. A purported symbiotic island was localized through of the identification of related genes of fixing nitrogen and nodulation in comparison with the symbiotic island of B. japonicum, founding 267 ORFs in B. elkanii, where 17 ORFs were identified as transposases. So through these partial results could be possible to infer that B. elkanii probably shows a symbiotic island with genetic rearrange into chromosome, because it showed lower genome size than B. japonicum. / Doutor

Resumo: O búfalo de rio (Bubalus bubalis) é uma espécie de interesse econômico pertencente à família Bovidae, utilizado para a produção de carne e leite, além de força de trabalho no campo. Recentemente, a construção de um painel de linhagens celulares contendo fragmentos do genoma do búfalo de rio, incorporado ao genoma de hamster (BBURH5000), está permitindo o mapeamento de todos os cromossomos bubalinos, representando a única ferramenta genômica desta categoria para o estudo da espécie. A utilização deste painel de células associado a análises estatísticas está gerando mapas genômicos de alta resolução contendo diferentes tipos de marcadores moleculares. O presente trabalho teve por objetivo utilizar este painel de células para a construção de um mapa genômico preliminar do braço curto do cromossomo 4 bubalino. Para tal, foram testados com o DNA bubalino, seqüências de oligonucleotídeos para PCR de 39 marcadores moleculares previamente mapeados no cromossomo 28 bovino, o qual foi descrito na literatura como o homólogo ao braço curto do cromossomo 4 de búfalo. Do total de marcadores testados, 14 (8 genes e 6 microssatélites) geraram produtos de PCR adequados ao mapeamento utilizando o painel BBURH5000. A freqüência de retenção de cada marcador no painel variou de 34,4%, para os marcadores, ANXA8, PPYR1 e ZNF33A a 43,3% para o marcador BMC6020. Utilizando os 14 marcadores, acrescidos de outros 10 marcadores (1 EST, 5 STS e 4 microssatélites) genotipados por pesquisadores da Texas A&M University, um mapa genômico RH preliminar foi construído para o braço curto do cromossomo 4 bubalino. A comparação desse mapa com mapas do cromossomo 28 bovino (BTA28) evidenciou extensa conservação na ordem dos marcadores no mapa obtido. / Abstract: The river buffalo (Bubalus bubalis), a member of the Bovidae family, is an economically important livestock specie useful to produce milk, meat, as well as source of labor. Recently, a whole-genome 5000-rad radiation hybrid panel was constructed for the river buffalo genome (BBURH5000 panel), which has been used to generated RH maps of several chromosomes from the specie. The goal of this study was to construct a preliminary RH map of the river buffalo chromosome 4 (BBU4p), using the BBURH5000 panel. Previous studies identified bovine chromosome 28 (BTA28) as homologous to BBU4p. Cattle derived PCR primers from 39 markers previously mapped in cattle, were tested with buffalo DNA. A total of 14 (8 genes and 6 microsatellites) of the 39 markers amplified PCR products suitable for the RH mapping. Retention frequencies of individual markers ranged from 34.4% for ANXA8, PPYR1 and ZNF33A to 43.3% for BMC6020. The preliminary RH map for BBU4p was constructed with a total of 24 markers, 14 from this study combined with 10 markers (1 EST, 5 STS and 4 microsatellites) genotyped by researchers at Texas A&M University. Comparisons of the BBU4p RH map with BTA28 revealed extensive conservation in the order of the mapped markers. Keywords: Bubalus bubalis; genome; river buffalo; RH mapping / Orientador: Maria Elisabete Jorge Amaral / Coorientador: Claudia Regina Bonini-Domingos / Banca: Artur Luiz da Costa da Silva / Banca: Mary Massumi Itoyama / Mestre

Resumo: Com o seqüenciamento completo do genoma do fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), em 2002, inúmeras possibilidades de estudo foram viabilizadas, dando margem à busca de novas formas de controle do cancro cítrico, baseadas em alvos moleculares. Estudos dessa natureza têm mostrado a existência de genes que somente são expressos quando a bactéria está se desenvolvendo in planta. Sabe-se que essa regulação é dependente da região promotora e sua identificação pode possibilitar avanços significativos na busca do controle dessa doença. Apesar do crescente avanço das técnicas experimentais in vitro em biologia molecular, identificar um número significante de promotores ainda é uma tarefa difícil e dispendiosa. Os métodos computacionais existentes enfrentam a falta de um número adequado de promotores conhecidos para identificar padrões conservados entre as espécies. Logo, um método para predizê-Ios em qualquer organismo procariótico ainda é um desafio. O Modelo Oculto de Markov é um modelo estatístico aplicável a muitas tarefas em biologia molecular. Entre elas, predição e mapeamento de seqüências promotoras no genoma de um procarioto. Neste trabalho, estudou-se o mapeamento in silico de promotores gênicos de todo o genoma da Xac e em 68% dos genes a localização de um promotor foi indicada. A análise comparativa com dados experimentais de proteômica mostrou que 72% das proteínas expressas identificaram-se com elementos desta lista de promotores, o que corresponde a 27% do total de genes do genoma. À partir destes dados foi possível levantar um rol de informações sobre estes candidatos a promotores incitando a novos estudos moleculares. / Abstract: With the complete genome sequencing of the phytopathogen Xanthomonas axonopodis pv. Citri (Xac), in 2002, several study possibilities were made practical and then creating the search of new citrus canker control ways, based in molecular aims. This kind of studies has shown the genes existences that are only expressed when the bacteria are developing itself in plant. It has been known that this regulation is promoter region dependent and its identification can allow significant advances in the search of this disease control. Although increasing advance of in vitro experimental techniques in molecular biology, identifying a meaningful number of promoters is still a hard and expensive task. The existents computer science methods face the need of a proper number of known promoters to identify conserved patterns among the species. Therefore, a method to predict them in any prokaryote organism is still a challenge. The Hidden Markov Model (HMM) is a statistic model applicable in many tasks in molecular biology. Among them, prediction and mapping of the promoters sequences in prokaryotic genome. In this work, which has studied the genic promoters in silico mapping of the whole Xac genome, in 68% of the genes the promoter localization was indicated. The proteomic experimental data comparative analysis showed that 72% of the expressed proteins identified with elements from the promoters list, which corresponds 27% of the genome genes total. According to these data it was possible to generate an information roll about these promoters candidates inciting new molecular studies. / Orientadora: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Coorientador: Marcelo Luiz de Laia / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Poliana Fernanda Giachetto / Mestre

Resumo: O búfalo de rio (Bubalus bubalis) é uma espécie de interesse econômico pertencente à família Bovidae, utilizado para a produção de carne e leite, além de força de trabalho no campo, constituindo-se em um animal de tripla aptidão. Recentemente, a construção de um painel de células somáticas híbridas irradiadas (linhagens celulares) contendo fragmentos do genoma do búfalo de rio, incorporado ao genoma de hamster (BBURH5000), está permitindo, pela primeira vez, o mapeamento de todos os cromossomos bubalinos. A utilização desse painel de células associado a análises estatísticas, está gerando mapas genômicos de alta resolução contendo diferentes tipos de marcadores moleculares. O presente trabalho teve por objetivo utilizar este painel de células para gerar grupos de ligação com os marcadores mapeados no cromossomo 9 bubalino e assim comparar a organização dos grupos de ligação obtidos com aqueles já descritos para o cromossomo 7 bovino. Para tal, foram testados com DNA bubalino, seqüências de "primers" para PCR de 26 marcadores moleculares previamente mapeados no cromossomo 7 bovino, o qual foi descrito na literatura como o homólogo ao cromossomo 9 de búfalo. Do total de marcadores testados, 18 geraram produtos de PCR adequados ao mapeamento utilizando o painel BBURH5000, sendo que destes 18, foi possível a genotipagem final de 10 marcadores. A partir das análises de ligação com os 10 marcadores genotipados, foi possível distribuir os mesmos em três grupos de ligação no BBU9. A análise comparativa entre os grupos de ligação do BBU9 e do BTA7 revelou a presença dos mesmos grupos de ligação nos cromossomos de ambas espécies, evidenciando conservação de sintenia. / Abstract: The river buffalo (Bubalus bubalis), a member of the Bovidae family, is an economically important livestock specie useful to produce milk and meat, as well as source of labor, comprising an animal of triple aptness. The recent construction of a whole-genome 5000-rad radiation hybrid somatic cell panel for the river buffalo genome (BBURH5000), is allowing for the first time the mapping of all chromosomes from the specie. The use of BBURH5000 panel associated with statistical analyses is generating high-resolution RH maps integrating different types of molecular markers. The goal of this study was to genarate linkage groups with the markers mapped on the river buffalo chromosome 9 (BBU9), using the BBURH5000 panel, and then compare these groups with those already described in BTA7. Previous studies have identified bovine chromosome 7 as homologous to BBU9. Cattle derived PCR primers from 26 markers, previously mapped in cattle, were tested with buffalo DNA. A total of 18 of the 26 markers amplified PCR products suitable for RH mapping. From these 18 markers, it was possible the genotyping of 10. The analyses of linkage with the 10 markers genotyped turned possible to distribute them in three linkage groups on the BBU9. The comparative analyses between the linkage groups of BBU9 and BTA7 revealed the presence of the same linkage groups on the chromosome of both species, revealing conservation of synteny between them. / Orientadora: Maria Elisabete Jorge Amaral / Coorientadora: Vera Fernanda Martins H. de Lima / Banca: Humberto Tonhati / Banca: Simone Cristina Méo Niciura / Mestre