A crescente prevalência de hipertensão arterial na população mundial e os riscos por ela apresentados nas doenças coronarianas eleva a importância de seu controle. Sendo sua causa, frequentemente multifatorial, o tratamento da patologia é dificultado. Fatores ambientais associados à predisposição genética levam o indivíduo a apresentar índices pressóricos elevados de pressão arterial quando comparados a indivíduos que não apresentam tal predisposição. Identificar a predisposição genética seria ideal para amenizar ou, até mesmo, evitar o desenvolvimento da patologia. As nanopartículas estão cada vez mais associadas com biomoléculas, uma vez que suas propriedades associadas às questões médicas podem criar novos métodos potencialmente eficientes, tanto no diagnóstico como na terapêutica. O presente trabalho teve como objetivo a conjugação de nanopartículas de ouro, estabilizadas com dendrímero poli(amidoamina) de geração 4, com oligonucleotídeo para obtenção de genossensores capazes de detectar o polimorfismo de inserção e deleção do gene da enzima conversora de angiotensina I, o qual está intimamente relacionado com a predisposição à hipertensão arterial sistêmica. As nanopartículas foram caracterizadas por Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM), potencial zeta e Espectroscopia no Ultravioleta-Visível (UV-VIS). A formação do conjugado entre a nanopartícula e o oligonucleotídeo foi confirmada por UV-VIS, Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) e Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR). Foram construídos três sistemas de detecção diferentes, nos quais as técnicas empregadas foram Espectroscopia de Impedância Elétrica, Espectroscopia de Impedância Eletroquímica e Transistor de Efeito de Campo de Porta Estendida e Separada (SEGFET). O polimorfismo foi detectado em concentrações da ordem de 1 nM. Com destaque para aqueles em que o emprego do conjugado amplificou o sinal pelas propriedades das nanopartículas de ouro. Os genossensores propostos são promissores e futuramente poderão contribuir com a medicina preventiva. / The increasing prevalence of hypertension in the world population and the risks presented by it in coronary heart disease reveals the importance of their control. Due to its multifactorial causes, the treatment of this disease is difficult. Environmental factors associated with genetic predisposition lead the individual to present high indexes of blood pressure when compared to individuals who do not have a predisposition. To identify the genetic predisposition would be ideal to minimize or even to prevent the pathology development. Nanoparticles are increasingly associated with biomolecules, their properties added with medical questions, can create new methods potentially efficient, both in diagnosis and therapy. This study aims at developing of poly(amidoamine) dendrimer-stabilized gold nanoparticles, conjugated with oligonucleotides to obtain genosensors able to detect the polymorphism of insertion and deletion of angiotensin I converting enzyme (ACE) gene, which is closely related with the predisposition to systemic blood hypertension. The nanoparticles were characterized by Transmission Electronic Microscopy (TEM), Zeta potential and Ultraviolet-Visible Spectroscopy (UV-VIS). The formation of the conjugate formed by the nanoparticle and the oligonucleotide was confirmed by UV-VIS, Dynamic Light Scattering (DLS) and Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR). Three different detection systems were built, in which the following techniques were applied: Electrical Impedance Spectroscopy, Electrochemical Impedance Spectroscopy and Separative Extended Gate Field Effect Transitor (SEGFET). For all systems polymorphism - related sequences were detected at concentrations down to nanomolar. The use of the conjugate amplified the signal of the genosensor due to the nanoparticles. The proposed genosensors may contribute to preventative medicine.

A crescente prevalência de hipertensão arterial na população mundial e os riscos por ela apresentados nas doenças coronarianas eleva a importância de seu controle. Sendo sua causa, frequentemente multifatorial, o tratamento da patologia é dificultado. Fatores ambientais associados à predisposição genética levam o indivíduo a apresentar índices pressóricos elevados de pressão arterial quando comparados a indivíduos que não apresentam tal predisposição. Identificar a predisposição genética seria ideal para amenizar ou, até mesmo, evitar o desenvolvimento da patologia. As nanopartículas estão cada vez mais associadas com biomoléculas, uma vez que suas propriedades associadas às questões médicas podem criar novos métodos potencialmente eficientes, tanto no diagnóstico como na terapêutica. O presente trabalho teve como objetivo a conjugação de nanopartículas de ouro, estabilizadas com dendrímero poli(amidoamina) de geração 4, com oligonucleotídeo para obtenção de genossensores capazes de detectar o polimorfismo de inserção e deleção do gene da enzima conversora de angiotensina I, o qual está intimamente relacionado com a predisposição à hipertensão arterial sistêmica. As nanopartículas foram caracterizadas por Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM), potencial zeta e Espectroscopia no Ultravioleta-Visível (UV-VIS). A formação do conjugado entre a nanopartícula e o oligonucleotídeo foi confirmada por UV-VIS, Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) e Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR). Foram construídos três sistemas de detecção diferentes, nos quais as técnicas empregadas foram Espectroscopia de Impedância Elétrica, Espectroscopia de Impedância Eletroquímica e Transistor de Efeito de Campo de Porta Estendida e Separada (SEGFET). O polimorfismo foi detectado em concentrações da ordem de 1 nM. Com destaque para aqueles em que o emprego do conjugado amplificou o sinal pelas propriedades das nanopartículas de ouro. Os genossensores propostos são promissores e futuramente poderão contribuir com a medicina preventiva. / The increasing prevalence of hypertension in the world population and the risks presented by it in coronary heart disease reveals the importance of their control. Due to its multifactorial causes, the treatment of this disease is difficult. Environmental factors associated with genetic predisposition lead the individual to present high indexes of blood pressure when compared to individuals who do not have a predisposition. To identify the genetic predisposition would be ideal to minimize or even to prevent the pathology development. Nanoparticles are increasingly associated with biomolecules, their properties added with medical questions, can create new methods potentially efficient, both in diagnosis and therapy. This study aims at developing of poly(amidoamine) dendrimer-stabilized gold nanoparticles, conjugated with oligonucleotides to obtain genosensors able to detect the polymorphism of insertion and deletion of angiotensin I converting enzyme (ACE) gene, which is closely related with the predisposition to systemic blood hypertension. The nanoparticles were characterized by Transmission Electronic Microscopy (TEM), Zeta potential and Ultraviolet-Visible Spectroscopy (UV-VIS). The formation of the conjugate formed by the nanoparticle and the oligonucleotide was confirmed by UV-VIS, Dynamic Light Scattering (DLS) and Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR). Three different detection systems were built, in which the following techniques were applied: Electrical Impedance Spectroscopy, Electrochemical Impedance Spectroscopy and Separative Extended Gate Field Effect Transitor (SEGFET). For all systems polymorphism - related sequences were detected at concentrations down to nanomolar. The use of the conjugate amplified the signal of the genosensor due to the nanoparticles. The proposed genosensors may contribute to preventative medicine.

Les épisodes de mortalité massive de l’huître creuse Crassostreae gigas observés sur les côtes françaises depuis 2008 ont été associés à certaines espèces appartenant au genre bactérien Vibrio. Ces mortalités, particulièrement intenses et rapides au cœur des lagunes méditerranéennes, atteignent 80 à 100% de la production ostréicole remettant ainsi en cause la pérennité de cette activité. Une surveillance environnementale de ces bactéries apparait donc essentielle et nécessite la mise au point de méthodes d’analyse innovantes, alternatives aux techniques couramment employées, afin de permettre un suivi rapide et en temps réel des Vibrio dans les milieux aquatiques côtiers.Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse a été de concevoir des outils analytiques de type génocapteurs pour la détection et la quantification des Vibrio dans les écosystèmes aquatiques. Dans un premier temps, un système basé sur un format d’hybridation « sandwich » reposant sur l’intercalation des acides nucléiques cibles entre une sonde capture immobilisée et une sonde signal marquée, couplé à une détection optique, a été élaboré. Après optimisation des conditions expérimentales, le test développé s’est avéré très sensible avec une limite de détection de 5 ng.µL-1 d’acides nucléiques, ainsi qu’hautement spécifique du genre Vibrio. La méthode a ensuite été appliquée avec succès à la détection des Vibrio dans des échantillons environnementaux, collectés dans la lagune de Salses-Leucate. Un second format d’hybridation, basé sur la compétition entre les acides nucléiques cibles et la sonde capture pour la sonde signal, a ensuite été envisagé en utilisant aussi bien une transduction optique qu’électrochimique. En parallèle, des méthodes de PCR quantitative en temps réel ont été mises au point afin de servir de références pour la validation des génocapteurs. / Mass mortality events affecting the Pacific oyster Crassostreae gigas on French coasts since 2008 have been associated to some Vibrio species. These mortalities, particularly severe and sudden in the mediterranean lagoons, can reach 80 to 100% of the oyster production threatening the sustainability of this activity. An environmental monitoring of these bacteria appears essential and, for this purpose, innovative analytical methods have to be developed as alternative to classical techniques, in order to allow the rapid and in real time monitoring of Vibrio in the coastal aquatic environments. In this context, the objective of the thesis was to design genosensors as analytical tools for Vibrio detection and quantification in aquatic ecosystems. In a first step, a system based on a « sandwich » hybridization format, in which nucleic acid targets were bound between an immobilized capture probe and a labeled signal probe, coupled with an optical detection method, was developed. After experimental condition optimization, the test showed high sensitivity with a limit of detection of 5 ng.µL-1 of nucleic acids and was highly specific to Vibrio spp. The method was then successfully applied to Vibrio detection in environmental samples collected in Salses-Leucate lagoon. A second hybridization format, based on a competition between the targeted nucleic acids and the capture probe for the signal probe has been considered using both optical and electrochemical transductions. Concurrently with the development of genosensors, quantitative real-time PCR have been designed as reference methods.