Einleitung: Toxoplasma (T.) gondii zählt zu den häufigsten intrazellulären Parasiten weltweit. Alleinige Endwirte im fakultativ heteroxenen Lebenszyklus sind die Feliden. Als Zwischenwirte können jedoch zahlreiche Säugetier- und Vogelarten dienen, in denen sich parasitäre Gewebezysten entwickeln. Einer der Hauptübertragungswege auf den Menschen stellt der Verzehr von T. gondii-haltigem Fleisch infizierter Nutztiere dar. Inwieweit Putenfleisch ein potentielles Infektionsrisiko birgt und welche Bedeutung Puten in der Epidemiologie der humanen Toxoplasmose besitzen ist nicht ausreichend geklärt. Ziel der Untersuchungen: Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein reproduzierbares Infektionsmodell bei Puten für T. gondii zu entwickeln, um die Verteilung und Persistenz des Parasiten im Gewebe zu ermitteln. Es wurden verschiedene Parameter, wie Infektionsstadium, Infektionsdosis, Applikationsmodus und Untersuchungszeitpunkt hinsichtlich ihres Einflusses auf die Entwicklung parasitärer Gewebestadien verglichen. Material und Methoden: Insgesamt wurden 74 Puten nach einer Aufzuchtperiode von 4 bis 8 Wochen experimentell mit T. gondii-Tachyzoiten oder Oozysten infiziert. Je nach Versuchsgruppe wurden Tachyzoiten vom Stamm ME49 intravenös und/oder intramuskulär appliziert oder Oozysten vom Stamm ME49, DX oder Hannover 1 oral verabreicht. Die Verifikation der Infektion erfolgte über den Nachweis T. gondii-spezifischer Antikörper mit Hilfe eines kinetischen ELISA. Drei bis acht Puten jeder Versuchsgruppe wurden 6 bis 8 oder 10 bis 12 Wochen nach der Infektion getötet. Von jedem Tier wurden folgende Gewebeproben entnommen: Brust-, Oberschenkel- und Unterschenkelmuskulatur, Herz, Leber, Muskel- und Drüsenmagen, Gehirn, Lunge, Milz, Nieren, Darm, Pankreas und Hoden (sofern vorhanden). Die Organe wurden getrennt vollständig homogenisiert. Bei den Muskeln wurden Proben von verschiedenen Lokalisationen entnommen und ebenfalls einzeln homogenisiert. Der Nachweis von T. gondii-DNA in den Gewebeproben erfolgte mittels konventioneller PCR, basierend auf der Amplifizierung eines 469 bp Fragments des B1-Gens, und anschließender nested PCR (Länge Zielfragment: 375 bp). Zusätzlich wurden zu Beginn der Studie lichtmikroskopische Untersuchungen einzelner Organe in Form nativer Quetschpräparate (400fache Vergrößerung) auf T. gondii-Zysten durchgeführt. Ergebnisse: Ungeachtet der Infektionsdosis und des inokulierten Parasitenstadiums konnten bei keinem der Versuchstiere klinische Symptome einer Toxoplasmose beobachtet werden. Die unterschiedlich hohen Infektionsdosen hatten im Allgemeinen keinen signifikanten Einfluss auf die Anzahl positiv getesteter Puten oder Organproben. Lediglich die Anzahl positiver Gehirnproben nahm mit ansteigender Oozystendosis signifikant zu. Bei der Betrachtung aller Versuchsgruppen fiel auf, dass die Befallshäufigkeit der Organe sowohl zwischen den Tieren verschiedener Infektionsgruppen als auch innerhalb einer Infektionsgruppe stark schwankte. So variierte die Anzahl positiv getesteter Organe bei den Tachyzoiten-infizierten Puten zwischen 0 und 7, bei den Oozysten-infizierten Puten zwischen 0 und 9 Organen pro Tier. Die Untersuchungsergebnisse zeigen, dass sich T. gondii heterogen in der Pute verteilt und mindestens 12 Wochen persistieren kann. Bezogen auf alle Versuchstiere gab es kein Organ, dass durchgängig negativ blieb. Nach der Tachyzoiteninfektion waren am häufigsten Leber (43,3%), gefolgt von Brustmuskel (26,7%) und Herz (20,0%) infiziert, während bei den Oozysten-infizierten Tieren der Erreger am häufigsten im Gehirn (47,2%), gefolgt von Oberschenkelmuskulatur (25,0%) und Herz und Unterschenkelmuskulatur (je 22,2%) nachgewiesen werden konnte. Schlussfolgerungen: Tachyzoiten und Oozysten erwiesen sich als gleichermaßen geeignete Infektionsmedien und führten hinsichtlich der systemischen Verteilung des Parasiten in der Pute zu vergleichbaren Ergebnissen. Ein spezifischer Organtropismus des Erregers konnte nicht festgestellt werden. Aus Sicht der Lebensmittelhygiene und des Verbraucherschutzes bedeuten die Ergebnisse, dass im Fall einer T. gondii-Infektion ein potentielles Infektionsrisiko für den Menschen durch infiziertes Putenfleisch nicht ausgeschlossen werden kann.

Einleitung: Toxoplasma (T.) gondii zählt zu den häufigsten intrazellulären Parasiten weltweit. Alleinige Endwirte im fakultativ heteroxenen Lebenszyklus sind die Feliden. Als Zwischenwirte können jedoch zahlreiche Säugetier- und Vogelarten dienen, in denen sich parasitäre Gewebezysten entwickeln. Einer der Hauptübertragungswege auf den Menschen stellt der Verzehr von T. gondii-haltigem Fleisch infizierter Nutztiere dar. Inwieweit Putenfleisch ein potentielles Infektionsrisiko birgt und welche Bedeutung Puten in der Epidemiologie der humanen Toxoplasmose besitzen ist nicht ausreichend geklärt. Ziel der Untersuchungen: Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein reproduzierbares Infektionsmodell bei Puten für T. gondii zu entwickeln, um die Verteilung und Persistenz des Parasiten im Gewebe zu ermitteln. Es wurden verschiedene Parameter, wie Infektionsstadium, Infektionsdosis, Applikationsmodus und Untersuchungszeitpunkt hinsichtlich ihres Einflusses auf die Entwicklung parasitärer Gewebestadien verglichen. Material und Methoden: Insgesamt wurden 74 Puten nach einer Aufzuchtperiode von 4 bis 8 Wochen experimentell mit T. gondii-Tachyzoiten oder Oozysten infiziert. Je nach Versuchsgruppe wurden Tachyzoiten vom Stamm ME49 intravenös und/oder intramuskulär appliziert oder Oozysten vom Stamm ME49, DX oder Hannover 1 oral verabreicht. Die Verifikation der Infektion erfolgte über den Nachweis T. gondii-spezifischer Antikörper mit Hilfe eines kinetischen ELISA. Drei bis acht Puten jeder Versuchsgruppe wurden 6 bis 8 oder 10 bis 12 Wochen nach der Infektion getötet. Von jedem Tier wurden folgende Gewebeproben entnommen: Brust-, Oberschenkel- und Unterschenkelmuskulatur, Herz, Leber, Muskel- und Drüsenmagen, Gehirn, Lunge, Milz, Nieren, Darm, Pankreas und Hoden (sofern vorhanden). Die Organe wurden getrennt vollständig homogenisiert. Bei den Muskeln wurden Proben von verschiedenen Lokalisationen entnommen und ebenfalls einzeln homogenisiert. Der Nachweis von T. gondii-DNA in den Gewebeproben erfolgte mittels konventioneller PCR, basierend auf der Amplifizierung eines 469 bp Fragments des B1-Gens, und anschließender nested PCR (Länge Zielfragment: 375 bp). Zusätzlich wurden zu Beginn der Studie lichtmikroskopische Untersuchungen einzelner Organe in Form nativer Quetschpräparate (400fache Vergrößerung) auf T. gondii-Zysten durchgeführt. Ergebnisse: Ungeachtet der Infektionsdosis und des inokulierten Parasitenstadiums konnten bei keinem der Versuchstiere klinische Symptome einer Toxoplasmose beobachtet werden. Die unterschiedlich hohen Infektionsdosen hatten im Allgemeinen keinen signifikanten Einfluss auf die Anzahl positiv getesteter Puten oder Organproben. Lediglich die Anzahl positiver Gehirnproben nahm mit ansteigender Oozystendosis signifikant zu. Bei der Betrachtung aller Versuchsgruppen fiel auf, dass die Befallshäufigkeit der Organe sowohl zwischen den Tieren verschiedener Infektionsgruppen als auch innerhalb einer Infektionsgruppe stark schwankte. So variierte die Anzahl positiv getesteter Organe bei den Tachyzoiten-infizierten Puten zwischen 0 und 7, bei den Oozysten-infizierten Puten zwischen 0 und 9 Organen pro Tier. Die Untersuchungsergebnisse zeigen, dass sich T. gondii heterogen in der Pute verteilt und mindestens 12 Wochen persistieren kann. Bezogen auf alle Versuchstiere gab es kein Organ, dass durchgängig negativ blieb. Nach der Tachyzoiteninfektion waren am häufigsten Leber (43,3%), gefolgt von Brustmuskel (26,7%) und Herz (20,0%) infiziert, während bei den Oozysten-infizierten Tieren der Erreger am häufigsten im Gehirn (47,2%), gefolgt von Oberschenkelmuskulatur (25,0%) und Herz und Unterschenkelmuskulatur (je 22,2%) nachgewiesen werden konnte. Schlussfolgerungen: Tachyzoiten und Oozysten erwiesen sich als gleichermaßen geeignete Infektionsmedien und führten hinsichtlich der systemischen Verteilung des Parasiten in der Pute zu vergleichbaren Ergebnissen. Ein spezifischer Organtropismus des Erregers konnte nicht festgestellt werden. Aus Sicht der Lebensmittelhygiene und des Verbraucherschutzes bedeuten die Ergebnisse, dass im Fall einer T. gondii-Infektion ein potentielles Infektionsrisiko für den Menschen durch infiziertes Putenfleisch nicht ausgeschlossen werden kann.

Einleitung: Aviäre Influenzaviren (AIV) gehören zu den Influenza A-Viren (IAV) und sind sehr wandelbar. Die Bandbreite der Erkrankungsverläufe reicht, abhängig von Faktoren wie Virussubtyp und -stamm oder der Wirtstierart, von einer asymptomatischen Erregerausscheidung, z. B. bei Wasservögeln, über ausgeprägte respiratorische Erkrankungen bei vielen Säugern einschließlich des Menschen bis hin zu systemischen Infektionen mit Nekrosen und Entzündungen in vielen Organen und hoher Letalität, häufig bei Hühnern und Puten und in Verbindung mit hochpathogenen AIV (HPAIV). Weltweit und auch in Deutschland dauert aktuell ein AIV-Ausbruch an, sodass eine Gefährdung für die Tiergesundheit und aufgrund des zoonotischen Potenzials auch für den Menschen besteht. Im Gegensatz zu galliformen Spezies steht bei anderen Vogelarten und insbesondere Säugern die Virulenz nicht in besonders enger Verbindung mit dem Vorhandensein einer polybasischen Spaltstelle des Hämagglutinins (HA), wobei die pathogenetische Grundlage dieser Virulenzunterschiede bisher wenig erforscht ist. Die vorliegende Arbeit ist Teil einer größeren tierexperimentellen Versuchsreihe zur näheren Charakterisierung von virulenzdeterminierenden Regionen des AIV-Genoms, insbesondere von Variationen in der Spaltstelle des HA und des Nichtstrukturproteins 1 (NS1), hinsichtlich ihres Einflusses auf Pathogenität, Virulenz und Gewebetropismus. Ziele der Untersuchungen: Die übergreifende Hypothese der Studien war, dass neben der Variation der Spaltstelle des HA weitere, im Genom der IAV kodierte Virulenzdeterminanten existieren, deren Auswirkungen tierartspezifisch unterschiedlich ausgeprägt sind. Ziel der ersten Studie war die Etablierung eines semiquantitativen Scoringsystems für die wichtigsten histopathologischen Veränderungen sowie die Verteilung des Virusantigens in verschiedenen Organen. Ziel der zweiten Studie war die Automatisierung der Messung des Virusantigens, um die Untersuchung einer höheren Probenzahl zu ermöglichen sowie einen schnellen Überblick über die jeweiligen Zielorgane zu erhalten. Ein weiteres Ziel aller vier vorgestellten Studien war die Anwendung der Methoden zur Untersuchung des Einflusses genetischer Variationen, insbesondere der Spaltstelle des HA sowie des NS1, auf den Gewebetropismus und den Grad der Läsionen in experimentellen Infektionen bei Hühnern, Puten und Enten. Tiere, Material und Methoden: In allen Studien wurden Gewebeproben verwendet, die aus verschiedenen, am Friedrich-Loeffler-Institut (Greifswald-Insel Riems) durchgeführten Infektionsexperimenten stammen. Gruppen von Hühnern, Puten und Enten wurden zur Untersuchung unterschiedlicher Fragestellungen mit einer Vielzahl an teilweise genetisch modifizierten AIV oculonasal oder intravenös infiziert: Insbesondere wurden H4-Viren mit Reassortment mit H5N1-Viren, H5N1-, H5N8- und H7N7-Wildtypviren, H9N2-Viren mit modifizierter HA-Spaltstelle sowie H7N1-Viren mit variabler Länge der C-terminalen Effektordomäne des NS1 näher betrachtet. Von einem Teil der infizierten Tiere wurde jeweils ein breites Organspektrum histopathologisch und immunhistochemisch untersucht. Zur Etablierung der semiquantitativen und quantitativen Untersuchungsmethoden sowie zur Analyse der Ergebnisse wurden die verfügbaren Gruppen aufgrund ihrer oft geringen Größe (2 bis 10 histopathologisch und immunhistochemisch untersuchte Tiere pro Gruppe) unter Berücksichtigung der jeweiligen Fragestellung teils zusammenfassend analysiert, wobei zum Teil auch Daten aus vorangegangenen Experimenten reevaluiert und miteinbezogen wurden. Ergebnisse der semiquantitativen Analysen aus verschiedenen Experimenten wurden mittels Kruskal-Wallis- und Mann-Whitney-U-Tests und die quantitativen Daten mittels Mann-Whitney-U- und Friedman-Tests miteinander verglichen sowie Spearman- und Pearson-Korrelationsanalysen durchgeführt. Ergebnisse: Es wurde ein semiquantitatives Scoringsystem zur Erfassung nekrotisierender Läsionen sowie der Virusverteilung in Parenchym- und Endothelzellen etabliert. Bei Anwendung dieses Systems zeigten sich teils signifikante, oft durch genetische Variationen in Virulenzfaktoren bedingte Unterschiede. So waren mit H7N7 HPAIV assoziierte, nekrotisierende Läsionen bei Puten größtenteils stärker ausgeprägt als bei Hühnern. Bei Hühnern zeigte sich zusätzlich ein Endotheltropismus. Dagegen fanden sich bei mit demselben Virus infizierten Enten keine nekrotisierenden Läsionen und kein Virusantigen. H9N2-Viren mit Variationen in der Spaltstelle des HA unterschieden sich insbesondere in der Schwere der klinischen Erkrankung bei Puten sowie im Verhalten in zellkulturbasierten Analysen. Bei einer Infektion von Puten mit H7N1-Viren, die eine variable Länge des NS1 aufwiesen, fand sich für die untersuchten Varianten eine systemische Streuung des Virusantigens mit Nekrosen bzw. nekrotisierender Entzündung und einer Depletion der lymphatischen Organe in ähnlicher Ausprägung. Auch bei weiteren Untersuchungen, z. B. bezüglich des Schweregrads der klinischen Erkrankung sowie der Virusreplikation, zeigten sich keine signifikanten Unterschiede. Zudem wurde eine automatisierte Organauswahl sowie eine anschließende schwellenwertbasierte Messung des Virusantigens für sechs verschiedene Organe entwickelt. Auch hier fanden sich teils signifikante Unterschiede hinsichtlich des Gewebetropismus im Zusammenhang mit dem Infektionsweg. Die Ergebnisse der semiquantitativen und der quantitativen Untersuchungsmethoden zeigten eine signifikante positive Korrelation sowohl untereinander als auch jeweils mit Daten aus einer quantitativen reversen Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Schlussfolgerungen: Die hier vorgestellten semiquantitativen und quantitativen Methoden wurden validiert und zeigten eine Korrelation mit bisher verwendeten Untersuchungsmethoden sowie eine breite Anwendbarkeit, wenngleich eine Erprobung und Etablierung an einer größeren Probenzahl und Gruppengröße der Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein sollte. In den vorgestellten Studien konnte gezeigt werden, dass die polybasische Spaltstelle des HA die wichtigste Determinante für die Virulenz und den Endotheltropismus von H7N7 HPAIV bei Hühnern darstellt, jedoch nicht alle vorhandenen Virulenzunterschiede bei Puten und Enten erklären kann. Zudem weist die untersuchte genetische Variation der Spaltstelle des HA von H9N2 einen quantitativen Effekt auf die Virulenz in Puten auf. Die C-terminale Effektordomäne des NS1 scheint bei Puten hingegen keine wesentliche Rolle für die Virulenz und den Gewebetropismus zu spielen. Auch andere Faktoren wie der Infektionsweg können einen Einfluss auf die Virusverteilung nehmen. Wenngleich in diagnostischen Einzelfällen aufgrund der inhärenten Variabilität der Immunhistochemie eine qualitative Untersuchung das Mittel der Wahl bleibt, weisen die hier vorgestellten semiquantitativen und quantitativen Methoden aufgrund ihrer studienübergreifenden Anwendbarkeit sowie ihrer biometrischen Auswertbarkeit entscheidende Vorteile für den Einsatz im experimentellen Bereich auf.