O Semliki Forest Vírus recombinante (rSFV) vem sendo apontado como um dos vetores virais mais promissores, tanto para a expressão de proteínas de interesse biotecnológico, como para a utilização como vetor vacinal. Neste trabalho obtivemos um rSFV carregando o gene da proteína verde fluorescente GFP (rSFV-GFP), que foi utilizado para a padronização de métodos de obtenção do vetor viral e de sua titulação, duas etapas importantes para os trabalhos que utilizam rSFVs. Por meio da análise da expressão da GFP em células BHK-21 infectadas por lotes de vírus obtidos por um reagente de transfecção lipídico ou por eletroporação, estabelecemos as melhores condições de obtenção dos rSFV e de sua utilização para a infecção e produção de proteínas recombinantes de interesse. Além disso, padronizamos criteriosamente uma metodologia de RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) absoluta, baseada em uma curva padrão, para realizar a titulação de partículas rSFV, independentemente do gene heterólogo clonado. A análise direta da quantidade de células infectadas, por citometria de fluxo e por microscopia de fluorescência, fez do rSFV-GFP a ferramenta adequada para nossos estudos de titulação viral por qRT-PCR. Foi demonstrada a associação entre o número de cópias do RNA viral utilizado para a infecção das células e a quantidade de células expressando GFP. Essa abordagem levou ao desenvolvimento de competências técnica e tecnológica (construção, avaliação e titulação) que facilitarão a obtenção de outros rSFV de interesse. Concluímos que a eletroporação é o melhor método de obtenção das partículas e que o título viral, determinado por qRT-PCR, pode ser utilizado para calcular o volume de um lote de rSFV necessário para obter a multiplicidade de infeção desejada. / The recombinant Semliki Forest Virus (rSFV) has been considered as one of the most promising viral vectors, both for the expression of proteins of biotechnological interest or as a vector for immunizations. In this study, an rSFV carrying the gene of the green fluorescent protein (GFP) was obtained (rSFV-GFP) and used for the standardization of rSFV production and of a novel titration methodology. Through the analysis of the amounts of GFP expressed in BHK-21 cells infected with virus stocks obtained by transfection with a lipid reagent or electroporation, we established the best conditions for rSFV production based on the production of this recombinant protein. In addition, a standardized method of absolute quantitative RT-PCR (qRT-PCR), based in a standard curve and applicable to virtually all rSFV particles, regardless of the heterologous gene cloned, was validated. The direct analysis of the quantity of infected cells, by flow cytometry and fluorescence microscopy, confirmed that the rSFV-GFP was an appropriated tool to support ours studies of viral titration by qRT-PCR. It was demonstrated the association between the amount of copies of viral RNA used for culture infection and the amount of GFP expression. This approach led to the development of technical and technological competence (construction, evaluation and titration) in the laboratory, that shall help the establishment of other rSFV of interest. We concluded that electroporation is the best methodology to obtain rSFV particles and the viral titre, as determined by qRT-PCR, can be used to calculate the volume of an rSFV stock necessary to obtain the desired multiplicity of infection.

A raiva é uma antropozoonose e causa a morte de 55 mil pessoas anualmente no mundo. Neste trabalho foi utilizado um sistema genético derivado do Vírus da Floresta de Semliki (SFV) carregando RNA para expressão gênica da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) e da proteína verde fluorescente (GFP), a título de controle do experimento. Lotes de partículas virais de SFV-RVGP e SFV-GFP foram obtidos em células BHK-21 e quantificados através de qRT-PCR. Foram realizados ensaios de infecção tanto com vírus ativado e não ativado em duas linhagens de macrófagos murinos IC-21 e J774A-1. A expressão da proteína RVGP foi avaliada pelo teste de Imunofluorescência Indireta (IFI) e a expressão da proteína GFP analisada por Microscopia de Fluorescência e Citometria de Fluxo em ambas as linhagens. A entrada do vírus SFV em células de mamíferos ocorre após 2 horas da infeção e de acordo com o experimento no qual analisamos a titulação viral do sobrenadante celular, indicaram que até as 72 horas pós infecção a titulação viral se manteve com o mesmo valor inicial, sugerindo que não houve entrada dos vírus na célula por transdução ou por fagocitose. / Rabies is a anthropozoonosis and causes the death of 55,000 people worldwide each year. In this work we used a genetic system derived from the Semliki forest virus (SFV) carrying RNA for gene expression of the rabies virus glycoprotein (RVGP) and green fluorescent protein (GFP), by way of experiment control. Plots of viral particles of SFV-RVGP and SFV-GFP were obtained in BHK-21 cells and quantified by qRT-PCR. Infection assays were performed both with activated and not activated in two virus strains of murine macrophages IC-21 and J774A-1. The expression of RVGP protein was assessed by indirect immunofluorescence test (IFI) and the expression of GFP protein analyzed by fluorescence microscopy and flow cytometry in both strains. The SFV entry of viruses into mammalian cells occurs after 2 hours of infection and according to the experiment in which we analyzed the viral titer of the cell supernatant showed that by 72 hours post-infection viral titer remained at the same initial value, suggesting no entry of virus into the cell by transduction or by phagocytosis.

No presente trabalho estudamos a renaturação sob alta pressão hidrostática de uma forma mutante da proteína verde fluorescente (enhanced GFP, eGFP), a qual somente emite fluorescência característica quando enovelada na sua forma nativa. A abordagem do presente estudo foi focada no controle da bioatividade da proteína recombinante, a fluorescência, como alternativa à determinação de solubilidade da proteína, fator que não é um indicador ideal de enovelamento proteico adequado. A ação da alta pressão na solubilização dos corpos de inclusão (CI) de eGFP produzidos em bactérias E. coli recombinantes e no enovelamento da proteína foi estudada. A compressão dos CI de eGFP em 2,4 kbar durante 30 minutos promoveu a dissociação dos agregados. No entanto, a incubação nesta condição não favoreceu o enovelamento da eGFP. O processo de renaturação foi avaliado em diversas condições de descompressão após a dissociação em 2,4 kbar. Durante a descompressão gradual, o aumento da fluorescência foi obtido em pressões que variaram entre a pressão atmosférica e 1,38kbar. Os níveis mais elevados de fluorescência de eGFP foram obtidos por incubação durante várias horas a níveis de pressão entre 0,35 e 0,69 kbar. Esta condição de pressão se mostrou favorável à renaturação de eGFP e é possível que também possa ser utilizada para favorecer o enovelamento de outras proteínas monoméricas. Ainda utilizando a eGFP como modelo, verificamos que os CI desta proteína produzidos por bactérias cultivadas em menor temperatura (37ºC) possuem maior quantidade de proteína recombinante apresentando a fluorescência característica em 509 nm, ou seja, na sua forma nativa, do que os CI expressos em temperaturas mais elevadas (42ºC e 47ºC). A análise realizada por espectroscopia de infravermelho (FT-IR) também demonstrou que os CI produzidos em temperaturas mais brandas possuem maior grau de estruturas secundárias semelhantes às da proteína na sua forma nativa. Além disso, os CI produzidos a 37ºC também são mais facilmente solubilizados pela ação da alta pressão do que aqueles produzidos em maior temperatura. Conforme esperado, a renaturação da eGFP a partir de CI produzidos a 37ºC foi 25 vezes mais eficiente do que a obtida utilizando CI produzidos a 47ºC. No presente estudo demonstramos também que a dissociação dos agregados exercida pela ação da alta pressão (2,4 kbar) pode ser amplificada quando em associação com a incubação em baixa temperatura (-9ºC) e que a combinação destas duas propriedades físicas eleva a solubilização dos agregados em CI, com a consequente elevação dos rendimentos de renaturação de eGFP. Mostramos ainda no presente estudo que a cinética de renaturação de eGFP em 0,69 kbar é proporcional à temperatura de incubação (entre 10ºC e 50ºC). O nível mais elevado de fluorescência foi obtido quando a renaturação de eEGP foi realizada a 20ºC. A taxa de maturação do cromóforo da eGFP é mais fortemente afetada pela temperatura do que a taxa de enovelamento da proteína. Em conclusão, a temperatura de produção dos CI, a temperatura de dissociação dos agregados e a temperatura de enovelamento podem afetar muito o rendimento e a cinética da renaturação de eGFP em alta pressão. Os resultados do presente estudo podem abrir novas perspectivas para melhorias no processo de enovelamento de proteínas a partir de CI utilizando alta pressão. Também neste trabalho descrevemos a renaturação das proteínas de Xac, PilB e os produtos dos genes XAC2810 e XAC3272 nunca antes obtidas na forma solúvel. Os rendimentos de solubilização destas três proteínas foram muito altos, entre 75% e 89%. A proteína PilB renaturada em alta pressão apresentou atividade ATPasica elevada, o que nunca antes foi demonstrado para a PilB de Xac. / In the present work we studied the refolding under high hydrostatic pressure of a mutant form of the green fluorescent protein (eGFP), which only emits the green characteristic fluorescence when in the native folded state. The approach of the present study was focused on controlling the bioactivity of the recombinant protein, the fluorescence, as an alternative for the determination of protein solubility, which is not an ideal indicator of proper protein folding. We studied the action of high pressure in the solubilization of the inclusion bodies (IB) of eGFP produced in bacteria E. coli and in the folding of this protein. The compression of a suspension of eGFP IB at 2.4 kbar for 30 minutes promoted dissociation of aggregates. However, the eGFP folding, monitored by the fluorescence at 509 nm, does not occur in this pressure level. The process of eGFP refolding was evaluated under various decompression conditions after dissociation of the IB at 2.4 kbar. During the gradual decompression, the increase in fluorescence was achieved at pressures ranging between atmospheric pressure and 1.38 kbar. The higher levels of eGFP fluorescence were obtained by incubation for several hours at pressure levels between 0.35 and 0.69 kbar. It is possible that the pressure condition that proved favorable for refolding of eGFP can also be used to favor the folding of other monomeric proteins. Using eGFP as a model, we also found that the IB produced by bacteria grown in a relatively low temperature (37ºC) is more fluorescent, presenting a higher amount of recombinant protein with the characteristic fluorescence at 509 nm, i.e., in its native form, than the IB expressed at higher temperatures (42ºC and 47ºC). The analysis by infrared spectroscopy (FT-IR) also demonstrated that the IB produced at milder temperatures have a higher degree of secondary structure similar to the protein in its native form. Furthermore, the IB produced at 37ºC are also more readily solubilized by the action of high pressure than those produced at the higher temperatures. As expected, the folding of eGFP from IB produced at 37ºC was 25 times more efficient than that obtained using IB produced at 47ºC. In this study we demonstrated that the dissociation of aggregates exerted by the action of high pressure (2.4 kbar) can be amplified by combination with incubation at low temperature (-9ºC) and the association of these two physical properties can be used to increase the solubilization of the aggregates in IB, with a consequent increase in the yield of eGFP refolding. In the present study we also showed that the kinetics of refolding of eGFP is proportional to temperature (10ºC 50ºC). The higher level of fluorescence was obtained when the refolding of eGFP was performed at 20°C. The rate of maturation of the eGFP chromophore is more strongly affected by temperature than the rate of folding of the protein. In conclusion, the temperature of production of IB, the temperature of dissociation of aggregates and the folding temperature can greatly affect the yield and kinetics of refolding of eGFP at high pressure. The results of this study may open new perspectives for improvements in the process of protein folding from IB using high pressure. In this paper we also describe the refolding of the proteins of Xac, PilB and the gene products XAC2810 and XAC3272, which have never before been achieved in soluble form. The yields of solubilization/refolding of these three proteins were very high, between 75% and 89%. The protein PilB refolded at high pressure presented high ATPase activity, which has never been shown for the PilB of Xac.

Stem cells have great potential value for treating a number of diseases and conditions, including diabetes, Parkinson's, and spinal cord injuries. Applying stem cells for therapeutic purposes will require an in-depth understanding of their biology, not only of the genes they express, but also the functions of the proteins encoded by the genes. The goal of the project presented in this thesis was to develop a method for high-throughput analyses of protein localization in mouse stem cells. Localization information can provide insight into the functions and biological roles of proteins. <br /><br /> One means of studying protein localization involves creating proteins with a green fluorescent protein (GFP) reporter gene and analyzing their localization using fluorescence microscopy. The research outlined in this thesis focused on developing a system to create a large number of GFP-tagged proteins by constructing a cDNA?GFP fusion library. This involved exploring methods for optimizing cDNA synthesis, designing a retroviral vector (pBES23) for the expression of cDNA?GFP fusions in mouse stem cells, and constructing a cDNA?GFP fusion library in this vector using R1 mouse embryonic stem cell mRNA. The library constructed was not successfully delivered to target cells for GFP-tagged protein expression; it was therefore not possible to characterize protein localization in mouse stem cells. Suggestions are given as to how the methods used in this thesis might be optimized further.

Foram utilizadas proteínas da famÌlia das GFPs e nanocristais fluorescentes de CdSe/ZnS para caracterização da interação e verificação de transferência de energia por ressonância (FRET) entre estes compostos. Formou-se dois pares doador-receptor onde ora uma proteína figurava como doadora, ora um nanocristal ocupava este papel. Verificou-se que, em ambos os casos, o doador sofre supressão da fluorescência após a formação de complexo com o receptor, complexo este motivado por interação eletrostática e dependente de pH. Foi possível comprovar, através da observação de emissão sensitizada e redução da anisotropia, que entre o par formado por nanocristal com emissão no verde e proteína HcRed1 como receptora, de fato ocorre FRET. As distâncias aparentes entre doador e receptor foram determinadas a partir da eficiência da supressão da fluorescência do doador e da distância de Förster. As distâncias assim obtidas são compatíveis com as dimensões das proteínas e dos nanocristais / Proteins belonging to the GFP family were used to characterize their interaction with fluorescent CdSe/ZnS nanocrystals and to verify the occurrence of resonance energy transfer (FRET) among these elements. Two donor-acceptor pairs were established, one having a protein as donor and the other having a nanocrystal as donor. In both cases the donor suffers quenching of its fluorescence after the formation of a complex with the acceptor. The complex formation is dependent on pH and is due to electrostatic interaction. It was possible to prove the occurrence of FRET between CdSe/ZnS nanocrystals emitting green fluorescence as donors and the protein HcRed1 as acceptor, through the detection of sensitized emission and anisotropy reduction. Apparent donor-acceptor distances were determined from efficiency measurements and Förster distances. The obtained distances agreed with the protein and nanocrystal dimensions

O Semliki Forest Vírus recombinante (rSFV) vem sendo apontado como um dos vetores virais mais promissores, tanto para a expressão de proteínas de interesse biotecnológico, como para a utilização como vetor vacinal. Neste trabalho obtivemos um rSFV carregando o gene da proteína verde fluorescente GFP (rSFV-GFP), que foi utilizado para a padronização de métodos de obtenção do vetor viral e de sua titulação, duas etapas importantes para os trabalhos que utilizam rSFVs. Por meio da análise da expressão da GFP em células BHK-21 infectadas por lotes de vírus obtidos por um reagente de transfecção lipídico ou por eletroporação, estabelecemos as melhores condições de obtenção dos rSFV e de sua utilização para a infecção e produção de proteínas recombinantes de interesse. Além disso, padronizamos criteriosamente uma metodologia de RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) absoluta, baseada em uma curva padrão, para realizar a titulação de partículas rSFV, independentemente do gene heterólogo clonado. A análise direta da quantidade de células infectadas, por citometria de fluxo e por microscopia de fluorescência, fez do rSFV-GFP a ferramenta adequada para nossos estudos de titulação viral por qRT-PCR. Foi demonstrada a associação entre o número de cópias do RNA viral utilizado para a infecção das células e a quantidade de células expressando GFP. Essa abordagem levou ao desenvolvimento de competências técnica e tecnológica (construção, avaliação e titulação) que facilitarão a obtenção de outros rSFV de interesse. Concluímos que a eletroporação é o melhor método de obtenção das partículas e que o título viral, determinado por qRT-PCR, pode ser utilizado para calcular o volume de um lote de rSFV necessário para obter a multiplicidade de infeção desejada. / The recombinant Semliki Forest Virus (rSFV) has been considered as one of the most promising viral vectors, both for the expression of proteins of biotechnological interest or as a vector for immunizations. In this study, an rSFV carrying the gene of the green fluorescent protein (GFP) was obtained (rSFV-GFP) and used for the standardization of rSFV production and of a novel titration methodology. Through the analysis of the amounts of GFP expressed in BHK-21 cells infected with virus stocks obtained by transfection with a lipid reagent or electroporation, we established the best conditions for rSFV production based on the production of this recombinant protein. In addition, a standardized method of absolute quantitative RT-PCR (qRT-PCR), based in a standard curve and applicable to virtually all rSFV particles, regardless of the heterologous gene cloned, was validated. The direct analysis of the quantity of infected cells, by flow cytometry and fluorescence microscopy, confirmed that the rSFV-GFP was an appropriated tool to support ours studies of viral titration by qRT-PCR. It was demonstrated the association between the amount of copies of viral RNA used for culture infection and the amount of GFP expression. This approach led to the development of technical and technological competence (construction, evaluation and titration) in the laboratory, that shall help the establishment of other rSFV of interest. We concluded that electroporation is the best methodology to obtain rSFV particles and the viral titre, as determined by qRT-PCR, can be used to calculate the volume of an rSFV stock necessary to obtain the desired multiplicity of infection.

A raiva é uma antropozoonose e causa a morte de 55 mil pessoas anualmente no mundo. Neste trabalho foi utilizado um sistema genético derivado do Vírus da Floresta de Semliki (SFV) carregando RNA para expressão gênica da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) e da proteína verde fluorescente (GFP), a título de controle do experimento. Lotes de partículas virais de SFV-RVGP e SFV-GFP foram obtidos em células BHK-21 e quantificados através de qRT-PCR. Foram realizados ensaios de infecção tanto com vírus ativado e não ativado em duas linhagens de macrófagos murinos IC-21 e J774A-1. A expressão da proteína RVGP foi avaliada pelo teste de Imunofluorescência Indireta (IFI) e a expressão da proteína GFP analisada por Microscopia de Fluorescência e Citometria de Fluxo em ambas as linhagens. A entrada do vírus SFV em células de mamíferos ocorre após 2 horas da infeção e de acordo com o experimento no qual analisamos a titulação viral do sobrenadante celular, indicaram que até as 72 horas pós infecção a titulação viral se manteve com o mesmo valor inicial, sugerindo que não houve entrada dos vírus na célula por transdução ou por fagocitose. / Rabies is a anthropozoonosis and causes the death of 55,000 people worldwide each year. In this work we used a genetic system derived from the Semliki forest virus (SFV) carrying RNA for gene expression of the rabies virus glycoprotein (RVGP) and green fluorescent protein (GFP), by way of experiment control. Plots of viral particles of SFV-RVGP and SFV-GFP were obtained in BHK-21 cells and quantified by qRT-PCR. Infection assays were performed both with activated and not activated in two virus strains of murine macrophages IC-21 and J774A-1. The expression of RVGP protein was assessed by indirect immunofluorescence test (IFI) and the expression of GFP protein analyzed by fluorescence microscopy and flow cytometry in both strains. The SFV entry of viruses into mammalian cells occurs after 2 hours of infection and according to the experiment in which we analyzed the viral titer of the cell supernatant showed that by 72 hours post-infection viral titer remained at the same initial value, suggesting no entry of virus into the cell by transduction or by phagocytosis.

BCG é uma das vacinas mais usadas no mundo. Avanços na manipulação genética têm permitido o seu uso como carreador de antígenos heterólogos, porém o aprimoramento dos sistemas de expressão se faz necessário, sendo o promotor um importante elemento, uma vez que regula o nível de produção do antígeno, induzindo uma resposta imunológica adequada. Avaliamos a atividade de diferentes promotores de micobactérias, como o PAg, PAN, PBlaF*, Phsp60 e um promotor ainda não caracterizado do micobacteriófago L5, usando o gene gfp como repórter da expressão, todos clonados no vetor extracromossomal, pLA71. Foi possível avaliar as cepas de M. smegmatis e BCG fluorescentes para quase todas as construções e alguns plasmídeos pLA71-p mostraram características diferentes dependentes da micobactéria transformada. Numa escala de força de expressão, os diferentes promotores se apresentaram como fraco (pLA71-PAN-gfp), médio (pLA71-PBlaf*-gfp) e forte (pLA71-Phsp60-gfp). Os rBCG foram usados para infecção de macrófagos e a atividade dos promotores não foi afetada após a internalização. Para ensaio de localização, camundongos foram inoculados com BCG e foi possível confirmar a presença de colônias (recombinantes ou não) nos pulmões após 1 e 3 dias de inoculação, por plaqueamento em meio sólido e por microscopia confocal. / BCG is one of the most widely used vaccines in the world. Advances in genetic manipulation have allowed their use as a carrier for heterologous antigens, however the improvement of systems of expression is necessary, the promoter being an important element, since it regulates the expression level of the antigen, inducing an adequate immune response. We evaluated the activity of different promoters of mycobacteria, such as PAg, PAN, PBlaF* and Phsp60, and the not yet characterized promoter of the micobacteriophage L5, using GFP as a reporter gene expression activity, all cloned in the extrachromosomal vector, pLA71. It was possible to evaluate promoters in the M. smegmatis and BCG strains, fluorescent for almost all constructions and some pLA71-p plasmids showed different characteristics dependent on the transformed mycobacterium. The different promoters showed expression levels as weak (pLA71-PAN-gfp), medium (pLA71-PBlaf*-gfp) and strong (pLA71-Phsp60-gfp). The rBCG were used for infection of macrophages and the activity of the promoters wasnt affected after internalization. For BCG location test, mice were inoculated and it was possible to confirm the presence of colonies (recombinant or not) in the lungs after 1 and 3 days after inoculation by plating on solid medium and by confocal microscopy.

Les imidazolones sont des molécules étudiées de longue date, soit en tant que molécules bioactives, soit pour leurs propriétés de fluorescence, l'exemple le plus connu étant la GFP. De nombreuses synthèses étaient déjà décrites, en particulier la condensation d'une amine avec une oxazolone (méthode d'Erlenmeyer). Au cours de ce travail, nous avons non seulement amélioré le protocole d'Erlenmeyer, mais surtout développé une synthèse originale consistant à utiliser l'arylation C-H de 2-H imidazolones. Dans cet objectif, il a fallu tout d'abord mettre au point un protocole de synthèse des 2-H imidazolones, jusqu'alors très peu décrites, puis mettre au point les conditions d'arylation et de vinylation directe de ces molécules. Deux séries d'imidazolones ont été étudiées et publiées séparément : en premier lieu, les 4,4'-dialkyl-imidazolones, fréquemment employées pour leurs propriétés biologiques, puis, au cours du travail qui a suivi, l'arylation et la vinylation des 4- arylidène-2-H imidazolones. / Imidazolones have been studied for a long time, either as bioactive molecules or for their fluorescence properties, the best known example being the Green Fluorescent Protein or GFP. Numerous syntheses are already described, in particular the condensation of an amine with an oxazolone (Erlenmeyer method). In this work, we not only improved the condensation protocol but also developed an original synthesis consisting in using 2-H imidazolones CH arylation. To this end, it was first necessary to develop a protocol for the synthesis of 2-H imidazolones, hitherto very little described, and then to develop the conditions for arylation and direct vinylation of these molecules. Two sets of imidazolones have been studied and published separately: first, the 4,4'- dialkylimidazolones, frequently used for their biological properties, followed by arylation and vinylation of 4-arylidene-2-H imidazolones.

Depuis ces dix dernières années, notre laboratoire a développé une expertise dans le domaine de la fonctionnalisation de liaisons carbone-hydrogène (dite fonctionnalisation C-H) d’hétérocycles par catalyse aux métaux de transition. Le sujet de thèse s’inscrit dans un programme de recherche dirigé vers les hétérocycles pro-aromatiques à système N-acylamidine. Les travaux antérieurs ont porté sur les 4-alkyl et 4-arylidène imidazolones avec la production de nouvelles sondes GFP. Le présent travail de thèse vise à poursuivre le développement méthodologique en série pyrimidin-4-ones,encore très peu concernée dans ce domaine de recherche. Une méthode d’arylation C2-H de lapyrimidin-4-one substituée sur l’atome d’azote par divers chélates directeurs a été mise au point en utilisant une catalyse coopérative Pd(0)-Cu(I) et des halogénures d’aryles comme partenaires de couplage. L’étendue de la réactivité a été examinée de façon exhaustive puis la méthodologie a été évaluée pour l’arylation C2-H d’analogues structurels fonctionnalisés en positions C5. Une seconde étude s’inscrit dans le projet de rigidification des sondes GFP à coeur 4-arylidène imidazolone. Un travail préliminaire d’ortho-palladation C-H a été effectué en collaboration avec le Dr Esteban Urriolabeitia de l’université de Saragosse en Espagne. Les propriétés photophysiques des palladacycles originaux ainsi préparés ont été déterminées et leurs réactivités aux agents de couplage et aux oxydants évaluées. / Since past decade, our laboratory is concerned with transition-metal catalyzed C-H functionalization of heterocycles. A recent research program is dedicated to the class of N-acyl amidine pro-aromatic heterocycles. This present thesis work is first directed to the pyrimidin-4-one series that remains highly sparsely evaluated. As main results, Pd(0)-catalyzed and Cu(I)-assisted C2-H arylation of pyrimidin-4-one flanked with picolinyl and other ortho-directed groups at the nitrogen atom was set up using arylhalides as coupling partners. The C5-substituted pyrimidin-4-ones were also evaluated. To pursue recent investigations in 4-alkyl and 4-arylidene imidazolone series leaing ding to innovative GFP probes, the second work aims at evaluating the first step of an ultimate intramolecular C-H/C-H coupling to stiffen the 4-arylidene imidazolone core. For that, the intramolecular ortho-palladation was achieved in collaboration with Dr. Esteban Urriolabeitia of the University of Zaragoza in Spain providing a broad panel of original imidazolone-based palladacycles. Their photophysical properties were determined and their reactivity towards cross-coupling as well as oxidating agents were also evaluated.