O desenvolvimento de técnicas complementares a métodos experimentais clássicos, tais como a cristalografia de raios-X e a ressonância magnética nuclear (RMN), capazes de descrever e prever a diversidade estrutural e conformacional de carboidratos e glicoconjugados, consiste em um potencial impacto no entendimento dos processos biológicos em que estas moléculas estão envolvidas. Neste sentido, o presente trabalho tem por objetivo: 1) a validação de um conjunto de parâmetros, desenvolvidos no nosso grupo de pesquisas, na reprodução de dados de RMN descrevendo a conformação de uma série de glicoproteínas em solução aquosa, e 2) a avaliação do emprego de geometrias de dissacarídeos em solução como modelo para a construção de glicanas complexas, na ausência de dados experimentais. Através do emprego de técnicas de modelagem molecular como cálculos ab initio, construção de mapas de contorno para dissacarídeos e simulações de dinâmica molecular (DM) em escalas de tempo de até 0.1 ms, os resultados obtidos confirmam a adequação dos parâmetros gerados na descrição da conformação de carboidratos e glicoproteínas. Adicionalmente, sugerem que o emprego de populações de confôrmeros de dissacarídos em solução, obtidos através de simulações de DM, constitui-se em uma estratégia promissora na obtenção de modelos de glicanas condizentes com condições biológicas. Esperamos, a partir destas observações, que os resultados obtidos na presente dissertação possam contribuir no crescimento do número de trabalhos de DM abordando carboidratos e glicoproteínas biológicas e, assim, no crescimento do entendimento de processos biológicos nos quais estas biomoléculas estejam envolvidas. / The development of novel techniques, capable of describing and predicting the structural and conformational diversity of carbohydrates and glycoconjugates, in complement to experimental methods as X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance (NMR), might bring a potential impact in the comprehension of the biological processes in which such molecules are involved. In this context, this work aims to: 1) validate a set of parameters, developed by our research group, to reproduce NMR data describing the conformation of a series of glycoproteins in aqueous solutions; and 2) evaluate the use of solution geometries of disaccharides to assemble complex glycans, in the absence of experimental data. Employing molecular modelling techniques as ab initio calculations, construction of energy contour plots for disaccharides and molecular dynamics (MD) simulations with time scales up to 0.1 ms, the obtained results confirm the adequacy of the studied parameters to describe the conformation of carbohydrates and glycoproteins. Additionaly, such data suggest that the use of solution conformations of disaccharides, as obtained through MD simulations, consists in a promissing strategy to obtain glycans representation in accordance to biological conditions. We expect, with such observations, that the obtained results contribute to increase the number of works employing MD simulations of biological carbohydrates and glycoproteins and, thus, to raise the comprehension of the biological processes in which such molecules are involved.

O desenvolvimento de técnicas complementares a métodos experimentais clássicos, tais como a cristalografia de raios-X e a ressonância magnética nuclear (RMN), capazes de descrever e prever a diversidade estrutural e conformacional de carboidratos e glicoconjugados, consiste em um potencial impacto no entendimento dos processos biológicos em que estas moléculas estão envolvidas. Neste sentido, o presente trabalho tem por objetivo: 1) a validação de um conjunto de parâmetros, desenvolvidos no nosso grupo de pesquisas, na reprodução de dados de RMN descrevendo a conformação de uma série de glicoproteínas em solução aquosa, e 2) a avaliação do emprego de geometrias de dissacarídeos em solução como modelo para a construção de glicanas complexas, na ausência de dados experimentais. Através do emprego de técnicas de modelagem molecular como cálculos ab initio, construção de mapas de contorno para dissacarídeos e simulações de dinâmica molecular (DM) em escalas de tempo de até 0.1 ms, os resultados obtidos confirmam a adequação dos parâmetros gerados na descrição da conformação de carboidratos e glicoproteínas. Adicionalmente, sugerem que o emprego de populações de confôrmeros de dissacarídos em solução, obtidos através de simulações de DM, constitui-se em uma estratégia promissora na obtenção de modelos de glicanas condizentes com condições biológicas. Esperamos, a partir destas observações, que os resultados obtidos na presente dissertação possam contribuir no crescimento do número de trabalhos de DM abordando carboidratos e glicoproteínas biológicas e, assim, no crescimento do entendimento de processos biológicos nos quais estas biomoléculas estejam envolvidas. / The development of novel techniques, capable of describing and predicting the structural and conformational diversity of carbohydrates and glycoconjugates, in complement to experimental methods as X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance (NMR), might bring a potential impact in the comprehension of the biological processes in which such molecules are involved. In this context, this work aims to: 1) validate a set of parameters, developed by our research group, to reproduce NMR data describing the conformation of a series of glycoproteins in aqueous solutions; and 2) evaluate the use of solution geometries of disaccharides to assemble complex glycans, in the absence of experimental data. Employing molecular modelling techniques as ab initio calculations, construction of energy contour plots for disaccharides and molecular dynamics (MD) simulations with time scales up to 0.1 ms, the obtained results confirm the adequacy of the studied parameters to describe the conformation of carbohydrates and glycoproteins. Additionaly, such data suggest that the use of solution conformations of disaccharides, as obtained through MD simulations, consists in a promissing strategy to obtain glycans representation in accordance to biological conditions. We expect, with such observations, that the obtained results contribute to increase the number of works employing MD simulations of biological carbohydrates and glycoproteins and, thus, to raise the comprehension of the biological processes in which such molecules are involved.

O desenvolvimento de técnicas complementares a métodos experimentais clássicos, tais como a cristalografia de raios-X e a ressonância magnética nuclear (RMN), capazes de descrever e prever a diversidade estrutural e conformacional de carboidratos e glicoconjugados, consiste em um potencial impacto no entendimento dos processos biológicos em que estas moléculas estão envolvidas. Neste sentido, o presente trabalho tem por objetivo: 1) a validação de um conjunto de parâmetros, desenvolvidos no nosso grupo de pesquisas, na reprodução de dados de RMN descrevendo a conformação de uma série de glicoproteínas em solução aquosa, e 2) a avaliação do emprego de geometrias de dissacarídeos em solução como modelo para a construção de glicanas complexas, na ausência de dados experimentais. Através do emprego de técnicas de modelagem molecular como cálculos ab initio, construção de mapas de contorno para dissacarídeos e simulações de dinâmica molecular (DM) em escalas de tempo de até 0.1 ms, os resultados obtidos confirmam a adequação dos parâmetros gerados na descrição da conformação de carboidratos e glicoproteínas. Adicionalmente, sugerem que o emprego de populações de confôrmeros de dissacarídos em solução, obtidos através de simulações de DM, constitui-se em uma estratégia promissora na obtenção de modelos de glicanas condizentes com condições biológicas. Esperamos, a partir destas observações, que os resultados obtidos na presente dissertação possam contribuir no crescimento do número de trabalhos de DM abordando carboidratos e glicoproteínas biológicas e, assim, no crescimento do entendimento de processos biológicos nos quais estas biomoléculas estejam envolvidas. / The development of novel techniques, capable of describing and predicting the structural and conformational diversity of carbohydrates and glycoconjugates, in complement to experimental methods as X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance (NMR), might bring a potential impact in the comprehension of the biological processes in which such molecules are involved. In this context, this work aims to: 1) validate a set of parameters, developed by our research group, to reproduce NMR data describing the conformation of a series of glycoproteins in aqueous solutions; and 2) evaluate the use of solution geometries of disaccharides to assemble complex glycans, in the absence of experimental data. Employing molecular modelling techniques as ab initio calculations, construction of energy contour plots for disaccharides and molecular dynamics (MD) simulations with time scales up to 0.1 ms, the obtained results confirm the adequacy of the studied parameters to describe the conformation of carbohydrates and glycoproteins. Additionaly, such data suggest that the use of solution conformations of disaccharides, as obtained through MD simulations, consists in a promissing strategy to obtain glycans representation in accordance to biological conditions. We expect, with such observations, that the obtained results contribute to increase the number of works employing MD simulations of biological carbohydrates and glycoproteins and, thus, to raise the comprehension of the biological processes in which such molecules are involved.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2009. / Made available in DSpace on 2012-10-24T10:34:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 267109.pdf: 2512191 bytes, checksum: e295f900d947bb3205275b90dad59fb5 (MD5) / A proteína prion celular (PrPC) é uma glicoproteína ancorada aos neurônios que tem sido associada a diversas funções no sistema nervoso central (SNC) como: neuroplasticidade, formação de placas senis e controle de mecanismos de estresse oxidativo. O processo de envelhecimento é um estado frequentemente acompanhado por um declínio em diversos aspectos sensorimotores e cognitivos. No presente estudo, investigamos o envolvimento da PrPC em alterações comportamentais e neuroquímicas relacionadas ao envelhecimento em camundongos selvagens (wild-type) (Prnp+/+), nocautes para PrPC (Prnp0/0) e camundongos que apresentam expressão aumentada de PrPC (Tg-20). Os animais destas linhagens com 3 ou 11 meses de idade foram submetidos a uma bateria de testes comportamentais incluindo os testes do campo aberto, caixa de atividade, labirinto em cruz elevado, memória social e a esquiva inibitória do tipo step-down. Camundongos Prnp+/+ e Prnp0/0 de 11 meses de idade exibiram prejuízos na atividade locomotora e na capacidade de reconhecer um camundongo jovem após um curto período de tempo assim como aumento nas respostas relacionadas à ansiedade. De forma interessante, camundongos Tg-20 não apresentaram os mesmos prejuízos comportamentais relacionados à idade e a infusão intracerebroventricular do peptídeo 230-245 da STI1, que inclue a porção de ligação a PrPC, reverteu estes distúrbios de memória de curto prazo relacionados a idade em camundongos Prnp+/+. Camundongos Tg-20 também exibiram níveis reduzidos de acetilcolinesterase sérica em comparação com os outros dois genótipos. Análises de imunohistoquímica revelaram expressão aumentada de proteínas hipocampais associadas à morte celular apoptótica e de plasticidade neuronal, respectivamente, caspase-3 e sinaptofisina, em camundongos Tg-20. Os resultados do presente estudo reforçam a hipótese da PrPC apresentar papel neuroprotetor e sugerem o seu envolvimento em algumas alterações comportamentais e neuroquímicas relacionadas ao xvi envelhecimento via sistema colinérgico e modulação da sinaptogênese e morte celular apoptótica.

Antitrombina (AT), uma proteína membro da família dos inibidores de serino proteases, é uma glicoproteína que co-existe em duas isoformas, a e b, que se diferenciam pelo conteúdo de glicosilação e pela afinidade por glicosaminoglicanos (GAG), um grupo de polissacarídeos polisulfatados, dentre as quais se destaca a heparina. AT é ativada quando ligada a GAGs, tornando-se assim capaz de inibir, com alta eficiência, proteases da cascata de coagulação como trombina e fXa. Essas enzimas formam complexos ternários com heparina e AT, sendo cada uma subsequentemente inibidas preferencialmente por um mecanismo de ação distinto: [1] baseado em mudanças conformacionais (fXa), ou pelo [2] mecanismo de ponte (trombina). Adicionalmente, já foi observado que heparina isoladamente pode modular a atividade catalítica de fIIa e fXa. Considerando a falta de dados estruturais a respeito dos efeitos da glicosilação sobre a estrutura e flexibilidade de AT, bem como sobre o reconhecimento heparina-AT, e que as bases moleculares da inibição alostérica de fIIa e fXa por GAGs não é bem compreendida, o presente trabalho visa caracterizar o reconhecimento molecular de heparina por essas proteínas, através de dinâmica molecular (DM). Os resultados obtidos indicam que a heparina interage de forma diferente nas glicoformas de AT devido a uma interferência da glicana ligada à Asn135. Da mesma forma, diferentes arranjos do GAG na superfície de trombina e fXa podem estar relacionadas às suas diferentes susceptibilidades aos mecanismos de ação de heparina, uma vez que sua orientação na superfície de fIIa, mas não fXa, permite uma interação adequada com AT em complexos ternários. Nesse contexto, foi observado, durante as simulações, que heparina inibiu alostericamente trombina e fXa, promovendo mudanças na conformação da tríade catalítica das proteases, e ativou AT, promovendo rearranjos intramoleculares entre seus elementos de estrutura secundária. Em ambos os casos, as vias de transmissão de sinal associadas a essas mudanças de atividade foram traçadas pela primeira vez nesse trabalho. De forma geral, os resultados obtidos conferem novas evidências de que a glicosilação tem um papel crucial na ativação diferencial de a- e b-AT por heparina, e que a orientação de GAGs na superfície de trombina e fXa é o que determina o mecanismo de sua modulação por heparina. / Antithrombin (AT), a member of the serpin protease inhibitors family, is a glycoprotein that co-exists in two isoforms, a and b, which differ in their amount of glycosylation and affinity for glycosaminoglycans (GAG), a group of sulphated polysaccharides, as heparin. AT is activated when bound to GAGs, becoming capable to inhibit coagulation cascade serine proteases like thrombin and fXa. Such enzymes form ternary complexes with heparin and AT, being subsequently inhibited by two distinct mechanisms of action: [1] the conformational change-based mechanism or the [2] bridge mechanism. In addition, heparin binding itself was also observed to modulate the catalytic activity of both fIIa and fXa. Considering the lack of structural information regarding the effect of glycosylation over the structure and flexibility of AT, as well as in heparin-AT recognition, and that the molecular basis of the allosteric inhibition of fIIa and fXa, promoted by such GAG, is not fully understood, the current work intends to characterize the molecular recognition of heparin by such proteins through molecular dynamics (MD) simulations. The obtained results indicate that heparin binds differently on AT glycoforms due to an interference of Asn135-linked glycan. As well, distinct arrangements of the polysaccharide on the surface of thrombin and fXa may be related to their diverse susceptibilities to heparin mechanisms of action, as heparin orientation observed on the surface of fIIa, but not fXa, allows for an adequate long chain heparin binding to AT in ternary complexes. In this context, heparin was observed to allosterically inhibit thrombin and fXa by promoting changes in the proteases catalytic triad conformation, but to activate AT by promoting intramolecular rearrangements on its secondary structure elements. In both cases, the signal transmission pathways associated with such activity changes were traced by the present work for the first time. Altogether, the obtained results provide new evidences that glycosylation play a central role on the differential activation of a- and b-AT by heparin, and that GAGs orientation on the surface of thrombin and fXa determine the mechanism of their modulation by heparin.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-03-15T04:05:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337678.pdf: 8258436 bytes, checksum: 67a6ef5115efff20ad348e0c04dc547b (MD5) Previous issue date: 2015 / A chegada dos neutrófilos até o foco da inflamação desenvolve papelessencial na resposta inflamatória. Além de serem uma populaçãocelular fundamental para conter e eliminar o patógeno, seu acúmulo levaao dano tecidual uma vez que essas células não são capazes dediscriminar entre as células do hospedeiro e o agente causador dainflamação Neutrófilos se acumulam no local da inflamação através deuma série de eventos sequenciais, entre eles a quimiotaxia. Aquimiotaxia é responsável por guiar os neutrófilos até o foco exato dainflamação. Estudos experimentais demonstram que a proteína de faseaguda Alfa-1-glicoproteína ácida (AGP) é capaz de interferir nesseprocesso, pois inibe o rolamento, a adesão e a migração dos neutrófilosin vivo, assim como a quimiotaxia in vitro. Altamente glicosilada,aproximadamente 12% dos carboidratos da AGP são de ácido siálico.Dentre os receptores que reconhecem os ácidos siálicos estão as lectinasdo tipo Siglecs (Sialic acid binding Ig-like lectins). Siglecs apresentamem sua estrutura um domínio inibitório capaz de interferir na respostaintracelular ativada por outros receptores. Assim, a hipótese deste estudoé de que os resíduos de ácido siálico presentes na estrutura da AGPseriam responsáveis pela ativação de Siglec-5 e/ou 9, inibindo aquimiotaxia dos neutrófilos. Para investigar essa hipótese, foi geradauma AGP desialilada sem a presença desse carboidrato. Neutrófilostratados com essa proteína foram submetidos a um ensaio dequimiotaxia em câmara de Boyden. Esse ensaio revelou que a retiradado ácido siálico reverteu o perfil inibitório induzido pela proteínasialilada. Ainda mais, os resultados demonstram que o ácido siálico emsua forma livre também foi capaz de inibir a quimiotaxia de maneiraequivalente à AGP. Sabendo que a AGP é capaz de ligar-se à superfíciedos neutrófilos, procurou-se investigar se essa interação ocorre atravésda ligação do ácido siálico à Siglec-5 ou 9. Para isso foi feita umacitometria de fluxo e avaliada a intensidade de fluorescência emitidapela AGP ou por anticorpos fluorescentes anti-hSiglec-5 e 9, quando napresença de anticorpos neutralizantes hSiglec-5 e 9 ou da AGP nãomarcada, respectivamente. No entanto nenhuma diferença na média deintensidade de fluorescência foi observada. Em conjunto nossoresultados sugerem que o reconhecimento do ácido siálico é necessáriona inibição da quimiotaxia induzida pela AGP.<br> / Abstract : Neutrophil recruitment has a central role in host response and inresolution of inflammation, but if uncontrolled can lead to severe tissuedamage. Overwhelming activation of neutrophils result in aninappropriate infiltration of neutrophils known to elicit cell and tissuedamage that can lead to an organ dysfunction. The acute phase proteinAlpha-1-acid glycoprotein (AGP) was shown to inhibit neutrophilmigration, rolling and adhesion in vivo. AGP also inhibits neutrophilchemotaxis in vitro, and evidence suggests that AGP terminal sialic acidresidues interact with an inhibitory receptor known as Siglec (Sialicacid-binding immunoglobulin-like). However, how AGP affectsneutrophil-response is not completely understood. In this study, weexamine mechanisms related to the effect of AGP on neutrophilchemotaxis responses, and we hypothesized that Alpha-1-acidglycoprotein inhibits neutrophil chemotaxis in vitro by Siglec-5 e/or 9activation. AGP 6µM inhibits neutrophil migration in vitro, as does6µM of sialic acid, when compared with control neutrophils.Neuraminidase treatment of AGP reversed the suppressive effect of theprotein. To investigate how AGP interacts with neutrophils, flowcytometry analyses using AGP labeled with Alexa Fluor 488 andhSiglec-5 and 9 neutralizing antibodies, or AGP and hSiglec-5 and 9fluorescent antibodies were used. Although no difference in the MFIwas observed. Taken together these results suggest that sialic acidrecognition is required for its inhibitory function, and that the interactionof AGP with neutrophils depend on this carbohydrate. However, thisstudy was not able to determine if this interaction was due to the ligationof AGP sialic acid to the receptor Siglec-5 and/or -9.

Antitrombina (AT), uma proteína membro da família dos inibidores de serino proteases, é uma glicoproteína que co-existe em duas isoformas, a e b, que se diferenciam pelo conteúdo de glicosilação e pela afinidade por glicosaminoglicanos (GAG), um grupo de polissacarídeos polisulfatados, dentre as quais se destaca a heparina. AT é ativada quando ligada a GAGs, tornando-se assim capaz de inibir, com alta eficiência, proteases da cascata de coagulação como trombina e fXa. Essas enzimas formam complexos ternários com heparina e AT, sendo cada uma subsequentemente inibidas preferencialmente por um mecanismo de ação distinto: [1] baseado em mudanças conformacionais (fXa), ou pelo [2] mecanismo de ponte (trombina). Adicionalmente, já foi observado que heparina isoladamente pode modular a atividade catalítica de fIIa e fXa. Considerando a falta de dados estruturais a respeito dos efeitos da glicosilação sobre a estrutura e flexibilidade de AT, bem como sobre o reconhecimento heparina-AT, e que as bases moleculares da inibição alostérica de fIIa e fXa por GAGs não é bem compreendida, o presente trabalho visa caracterizar o reconhecimento molecular de heparina por essas proteínas, através de dinâmica molecular (DM). Os resultados obtidos indicam que a heparina interage de forma diferente nas glicoformas de AT devido a uma interferência da glicana ligada à Asn135. Da mesma forma, diferentes arranjos do GAG na superfície de trombina e fXa podem estar relacionadas às suas diferentes susceptibilidades aos mecanismos de ação de heparina, uma vez que sua orientação na superfície de fIIa, mas não fXa, permite uma interação adequada com AT em complexos ternários. Nesse contexto, foi observado, durante as simulações, que heparina inibiu alostericamente trombina e fXa, promovendo mudanças na conformação da tríade catalítica das proteases, e ativou AT, promovendo rearranjos intramoleculares entre seus elementos de estrutura secundária. Em ambos os casos, as vias de transmissão de sinal associadas a essas mudanças de atividade foram traçadas pela primeira vez nesse trabalho. De forma geral, os resultados obtidos conferem novas evidências de que a glicosilação tem um papel crucial na ativação diferencial de a- e b-AT por heparina, e que a orientação de GAGs na superfície de trombina e fXa é o que determina o mecanismo de sua modulação por heparina. / Antithrombin (AT), a member of the serpin protease inhibitors family, is a glycoprotein that co-exists in two isoforms, a and b, which differ in their amount of glycosylation and affinity for glycosaminoglycans (GAG), a group of sulphated polysaccharides, as heparin. AT is activated when bound to GAGs, becoming capable to inhibit coagulation cascade serine proteases like thrombin and fXa. Such enzymes form ternary complexes with heparin and AT, being subsequently inhibited by two distinct mechanisms of action: [1] the conformational change-based mechanism or the [2] bridge mechanism. In addition, heparin binding itself was also observed to modulate the catalytic activity of both fIIa and fXa. Considering the lack of structural information regarding the effect of glycosylation over the structure and flexibility of AT, as well as in heparin-AT recognition, and that the molecular basis of the allosteric inhibition of fIIa and fXa, promoted by such GAG, is not fully understood, the current work intends to characterize the molecular recognition of heparin by such proteins through molecular dynamics (MD) simulations. The obtained results indicate that heparin binds differently on AT glycoforms due to an interference of Asn135-linked glycan. As well, distinct arrangements of the polysaccharide on the surface of thrombin and fXa may be related to their diverse susceptibilities to heparin mechanisms of action, as heparin orientation observed on the surface of fIIa, but not fXa, allows for an adequate long chain heparin binding to AT in ternary complexes. In this context, heparin was observed to allosterically inhibit thrombin and fXa by promoting changes in the proteases catalytic triad conformation, but to activate AT by promoting intramolecular rearrangements on its secondary structure elements. In both cases, the signal transmission pathways associated with such activity changes were traced by the present work for the first time. Altogether, the obtained results provide new evidences that glycosylation play a central role on the differential activation of a- and b-AT by heparin, and that GAGs orientation on the surface of thrombin and fXa determine the mechanism of their modulation by heparin.

Antitrombina (AT), uma proteína membro da família dos inibidores de serino proteases, é uma glicoproteína que co-existe em duas isoformas, a e b, que se diferenciam pelo conteúdo de glicosilação e pela afinidade por glicosaminoglicanos (GAG), um grupo de polissacarídeos polisulfatados, dentre as quais se destaca a heparina. AT é ativada quando ligada a GAGs, tornando-se assim capaz de inibir, com alta eficiência, proteases da cascata de coagulação como trombina e fXa. Essas enzimas formam complexos ternários com heparina e AT, sendo cada uma subsequentemente inibidas preferencialmente por um mecanismo de ação distinto: [1] baseado em mudanças conformacionais (fXa), ou pelo [2] mecanismo de ponte (trombina). Adicionalmente, já foi observado que heparina isoladamente pode modular a atividade catalítica de fIIa e fXa. Considerando a falta de dados estruturais a respeito dos efeitos da glicosilação sobre a estrutura e flexibilidade de AT, bem como sobre o reconhecimento heparina-AT, e que as bases moleculares da inibição alostérica de fIIa e fXa por GAGs não é bem compreendida, o presente trabalho visa caracterizar o reconhecimento molecular de heparina por essas proteínas, através de dinâmica molecular (DM). Os resultados obtidos indicam que a heparina interage de forma diferente nas glicoformas de AT devido a uma interferência da glicana ligada à Asn135. Da mesma forma, diferentes arranjos do GAG na superfície de trombina e fXa podem estar relacionadas às suas diferentes susceptibilidades aos mecanismos de ação de heparina, uma vez que sua orientação na superfície de fIIa, mas não fXa, permite uma interação adequada com AT em complexos ternários. Nesse contexto, foi observado, durante as simulações, que heparina inibiu alostericamente trombina e fXa, promovendo mudanças na conformação da tríade catalítica das proteases, e ativou AT, promovendo rearranjos intramoleculares entre seus elementos de estrutura secundária. Em ambos os casos, as vias de transmissão de sinal associadas a essas mudanças de atividade foram traçadas pela primeira vez nesse trabalho. De forma geral, os resultados obtidos conferem novas evidências de que a glicosilação tem um papel crucial na ativação diferencial de a- e b-AT por heparina, e que a orientação de GAGs na superfície de trombina e fXa é o que determina o mecanismo de sua modulação por heparina. / Antithrombin (AT), a member of the serpin protease inhibitors family, is a glycoprotein that co-exists in two isoforms, a and b, which differ in their amount of glycosylation and affinity for glycosaminoglycans (GAG), a group of sulphated polysaccharides, as heparin. AT is activated when bound to GAGs, becoming capable to inhibit coagulation cascade serine proteases like thrombin and fXa. Such enzymes form ternary complexes with heparin and AT, being subsequently inhibited by two distinct mechanisms of action: [1] the conformational change-based mechanism or the [2] bridge mechanism. In addition, heparin binding itself was also observed to modulate the catalytic activity of both fIIa and fXa. Considering the lack of structural information regarding the effect of glycosylation over the structure and flexibility of AT, as well as in heparin-AT recognition, and that the molecular basis of the allosteric inhibition of fIIa and fXa, promoted by such GAG, is not fully understood, the current work intends to characterize the molecular recognition of heparin by such proteins through molecular dynamics (MD) simulations. The obtained results indicate that heparin binds differently on AT glycoforms due to an interference of Asn135-linked glycan. As well, distinct arrangements of the polysaccharide on the surface of thrombin and fXa may be related to their diverse susceptibilities to heparin mechanisms of action, as heparin orientation observed on the surface of fIIa, but not fXa, allows for an adequate long chain heparin binding to AT in ternary complexes. In this context, heparin was observed to allosterically inhibit thrombin and fXa by promoting changes in the proteases catalytic triad conformation, but to activate AT by promoting intramolecular rearrangements on its secondary structure elements. In both cases, the signal transmission pathways associated with such activity changes were traced by the present work for the first time. Altogether, the obtained results provide new evidences that glycosylation play a central role on the differential activation of a- and b-AT by heparin, and that GAGs orientation on the surface of thrombin and fXa determine the mechanism of their modulation by heparin.

Sabe-se há algum tempo que a expressão de glicanas muda de acordo com a condição celular. A alteração do processo de glicosilação de proteínas é um processo comum em vários estados fisiopatológicos, sendo observado como um evento frequente em processos alérgicos e em células tumorais. O principal alérgeno do gato, a proteína Fel d 1, é um dímero composto de duas subunidades, sendo cada subunidade composta por uma cadeia α e β. A proteína possui um sítio de N-glicosilação em cada uma de suas subunidades, sendo preenchidos por diferentes glicoformas. Além disso, estudos cristalográficos detectaram três possíveis sítios de ligação a Ca2+ em sua estrutura. Diversos tipos de tumores apresentam expressão aumentada de GTs, dentre estas a FUT8 e a C2GnT-L. A FUT8 é uma β-1,6-fucosiltransferase, que transfere uma Fuc do substrato doador (GDP-β-L-fucose) à primeira GlcNAc do núcleo pentassacarídico de uma N-glicana. Esta enzima apresenta expressão aumentada em câncer de pulmão, gástrico e de cólon, além de estar envolvida em outros processos patológicos. A C2GnT-L transfere um resíduo de GlcNAc, em ligação β-1,6, ao núcleo 2 (Core 2) de glicanas O-ligadas, sendo superexpressa em câncer de pulmão, próstata e colorretal e relacionada com progressão tumoral e metástase. Considerando o papel da glicosilação e dos sítios ligadores de Ca2+ nos processos alérgicos, assim como a presença das GTs mencionadas em alta quantidade em processos tumorais, bem como a inexistência de dados estruturais e conformacionais destas proteínas e das estruturas sacarídicas em solução, o trabalho tem como objetivo contribuir na caracterização da glicobiologia estrutural destas proteínas. Para tal, foram estudados diversos sistemas da proteína Fel d 1 (PDBID 2ejn) e das enzimas FUT8 (PDBID 2de0) e C2GnT-L (PDBIDs 2gak e 2gam) por DM em solução aquosa em diferentes condições. Após os experimentos, pode-se observar que, para Fel d 1, apenas o íon Ca2+ central está ligado à proteína, enquanto os laterais ficam livres. A Fel d 1 com glicosilação reduzida apresentou um aumento de flexibilidade em duas hélices em uma das subunidades da Fel d 1, devido a desenovelamento das mesmas. Já a proteína completamente glicosilada apresentou uma redução no tamanho da cavidade de uma das subunidades. No estudo da FUT8, observou-se que o domínio N-terminal é o principal componente da flexibilidade proteica desta proteína. Ainda, foi possível caracterizar, através de atracamento molecular, a região de interação da FUT8 com sua glicana-alvo e com uma de suas proteínas-alvo, a integrina α5β1. Os resultados para C2GnT-L demonstraram que o sítio caracterizado para o substrato aceptor pode na verdade estar ocupado pelo substrato doador desta enzima, já que este permanece no local durante a DM, ao contrário do substrato aceptor. Espera-se que este trabalho contribua na compreensão do funcionamento destas proteínas, possibilitando futuros estudos acerca de seus papéis em enfermidades e, consequentemente, para novas estratégias terapêuticas. / We know for a while that glycan expression varies according to the cellular condition. Alterations in protein glycosylation is a common process in several physical and pathological processes, and are frequently observed in allergy and tumorous cells. The major cat allergen, Fel d 1, is a dimer composed by two subunits, each subunit containing one α and β chain. This protein contains one N-glycosylation site in each subunit, which are filled by different glycoforms. In addition, crystallographic studies detected three possible Ca2+ binding sites in its structure. Several types of tumors have higher expression of GTs, like FUT8 and C2GnT-L. FUT8 is an β-1,6-fucosyltransferase, transferring one Fuc from GDP-b-L-fucose to the inner most GlcNAc in the pentassaccharidic core of an N-glycan. This enzyme is highly expressed in lung, gastric and colon cancer and is involved in other pathological processes. C2GnT-L transfers a GlcNAc residue, in a β-1,6 linkage, to the Core 2 of O-linked glycans and is overexpressed in lung, prostate and colon-rectal cancer, related to tumoral progression and metastasis. Considering the role of glycosylation and Ca2+ binding sites in allergy, and considering the presence of the GTs mentioned above in high amounts in tumoral processes, as well as the inexistence of structural data concerning these proteins in solution, this study intents to contribute in characterizing the structural glycobiology of these proteins. In this matter, we studied several systems containing Fel d 1 (PDBID 2ejn), FUT8 (PDBID 2de0) and C2GnT-L (PDBID 2gak and 2gam) by MD in aqueous solution, under different conditions. We were able to observe, after the experiments, that in Fel d 1, only the central Ca2+ ion is bound to the protein, while the lateral ions are free. Fel d 1 containing reduced glycosylation form presented larger flexibility in two helices, in one of the subunits, due to their unfolding. Fully glycosylated Fel d 1 presented reduced cavity size in one of the subunits. In FUT8 study, we observed that the N-terminal domain is the principal component of protein flexibility. We were also able to characterize, using molecular docking, the sites of interaction of FUT8 with its target glycan and one of its target protein, integrin α5β1. Results for C2GnT-L showed that the characterized acceptor substrate site might, in fact, be occupied by the donor substrate, since the donor substrate remains in the site during MD, and the acceptor substrate does not. We expect that the refinement of these crystallographic structures, by introducing the saccharidic information, will contribute in comprehending the proteins functioning, and will further possibilitate studies into its roles in infirmities and, in this matter, to new therapeutic strategies.

Sabe-se há algum tempo que a expressão de glicanas muda de acordo com a condição celular. A alteração do processo de glicosilação de proteínas é um processo comum em vários estados fisiopatológicos, sendo observado como um evento frequente em processos alérgicos e em células tumorais. O principal alérgeno do gato, a proteína Fel d 1, é um dímero composto de duas subunidades, sendo cada subunidade composta por uma cadeia α e β. A proteína possui um sítio de N-glicosilação em cada uma de suas subunidades, sendo preenchidos por diferentes glicoformas. Além disso, estudos cristalográficos detectaram três possíveis sítios de ligação a Ca2+ em sua estrutura. Diversos tipos de tumores apresentam expressão aumentada de GTs, dentre estas a FUT8 e a C2GnT-L. A FUT8 é uma β-1,6-fucosiltransferase, que transfere uma Fuc do substrato doador (GDP-β-L-fucose) à primeira GlcNAc do núcleo pentassacarídico de uma N-glicana. Esta enzima apresenta expressão aumentada em câncer de pulmão, gástrico e de cólon, além de estar envolvida em outros processos patológicos. A C2GnT-L transfere um resíduo de GlcNAc, em ligação β-1,6, ao núcleo 2 (Core 2) de glicanas O-ligadas, sendo superexpressa em câncer de pulmão, próstata e colorretal e relacionada com progressão tumoral e metástase. Considerando o papel da glicosilação e dos sítios ligadores de Ca2+ nos processos alérgicos, assim como a presença das GTs mencionadas em alta quantidade em processos tumorais, bem como a inexistência de dados estruturais e conformacionais destas proteínas e das estruturas sacarídicas em solução, o trabalho tem como objetivo contribuir na caracterização da glicobiologia estrutural destas proteínas. Para tal, foram estudados diversos sistemas da proteína Fel d 1 (PDBID 2ejn) e das enzimas FUT8 (PDBID 2de0) e C2GnT-L (PDBIDs 2gak e 2gam) por DM em solução aquosa em diferentes condições. Após os experimentos, pode-se observar que, para Fel d 1, apenas o íon Ca2+ central está ligado à proteína, enquanto os laterais ficam livres. A Fel d 1 com glicosilação reduzida apresentou um aumento de flexibilidade em duas hélices em uma das subunidades da Fel d 1, devido a desenovelamento das mesmas. Já a proteína completamente glicosilada apresentou uma redução no tamanho da cavidade de uma das subunidades. No estudo da FUT8, observou-se que o domínio N-terminal é o principal componente da flexibilidade proteica desta proteína. Ainda, foi possível caracterizar, através de atracamento molecular, a região de interação da FUT8 com sua glicana-alvo e com uma de suas proteínas-alvo, a integrina α5β1. Os resultados para C2GnT-L demonstraram que o sítio caracterizado para o substrato aceptor pode na verdade estar ocupado pelo substrato doador desta enzima, já que este permanece no local durante a DM, ao contrário do substrato aceptor. Espera-se que este trabalho contribua na compreensão do funcionamento destas proteínas, possibilitando futuros estudos acerca de seus papéis em enfermidades e, consequentemente, para novas estratégias terapêuticas. / We know for a while that glycan expression varies according to the cellular condition. Alterations in protein glycosylation is a common process in several physical and pathological processes, and are frequently observed in allergy and tumorous cells. The major cat allergen, Fel d 1, is a dimer composed by two subunits, each subunit containing one α and β chain. This protein contains one N-glycosylation site in each subunit, which are filled by different glycoforms. In addition, crystallographic studies detected three possible Ca2+ binding sites in its structure. Several types of tumors have higher expression of GTs, like FUT8 and C2GnT-L. FUT8 is an β-1,6-fucosyltransferase, transferring one Fuc from GDP-b-L-fucose to the inner most GlcNAc in the pentassaccharidic core of an N-glycan. This enzyme is highly expressed in lung, gastric and colon cancer and is involved in other pathological processes. C2GnT-L transfers a GlcNAc residue, in a β-1,6 linkage, to the Core 2 of O-linked glycans and is overexpressed in lung, prostate and colon-rectal cancer, related to tumoral progression and metastasis. Considering the role of glycosylation and Ca2+ binding sites in allergy, and considering the presence of the GTs mentioned above in high amounts in tumoral processes, as well as the inexistence of structural data concerning these proteins in solution, this study intents to contribute in characterizing the structural glycobiology of these proteins. In this matter, we studied several systems containing Fel d 1 (PDBID 2ejn), FUT8 (PDBID 2de0) and C2GnT-L (PDBID 2gak and 2gam) by MD in aqueous solution, under different conditions. We were able to observe, after the experiments, that in Fel d 1, only the central Ca2+ ion is bound to the protein, while the lateral ions are free. Fel d 1 containing reduced glycosylation form presented larger flexibility in two helices, in one of the subunits, due to their unfolding. Fully glycosylated Fel d 1 presented reduced cavity size in one of the subunits. In FUT8 study, we observed that the N-terminal domain is the principal component of protein flexibility. We were also able to characterize, using molecular docking, the sites of interaction of FUT8 with its target glycan and one of its target protein, integrin α5β1. Results for C2GnT-L showed that the characterized acceptor substrate site might, in fact, be occupied by the donor substrate, since the donor substrate remains in the site during MD, and the acceptor substrate does not. We expect that the refinement of these crystallographic structures, by introducing the saccharidic information, will contribute in comprehending the proteins functioning, and will further possibilitate studies into its roles in infirmities and, in this matter, to new therapeutic strategies.