Les glioblastomes (GBs) sont les tumeurs primitives du SNC les plus agressives de l’adulte. Les causes d’échec thérapeutiques sont multiples, comme une résistance des cellules tumorales à l’apoptose, l’existence de cellules souches cancéreuses ou un microenvironnement pro-tumoral. La découverte de molécules thérapeutiques qui pourraient avoir une action pléiotrope est particulièrement attractive. Dans ce contexte nous nous sommes intéressés aux mimétiques de Smac (MS), antagonistes des inhibiteurs de l’apoptose (IAP), qui inhibent le plus souvent cIAP1, cIAP2, XIAP et ML-IAP. Nous avons recherché si les IAP pouvaient être des cibles thérapeutiques dans les GBs humains en étudiant leur expression et leurs valeurs pronostiques éventuelles : les IAP sont exprimés dans les GBs et ML-IAP est associé à un plus mauvais pronostic. Nous avons choisi d’utiliser pour la suite de nos expériences, un MS qui avait une action sur les IAP et en particulier ML-IAP : le GDC-0152. Le GDC-0152 induit l’apoptose in vitro, augmente la survie des souris porteuses de GB et ralentit la croissance tumorale in vivo. Ensuite nous avons recherché si l’effet du GDC-0152 pouvait être différent en fonction du taux d'oxygène. En effet, les GBs sont des tumeurs hypoxiques. Nous avons cultivé en normoxie et en hypoxie, quatre lignées de cellules souches de GBs. En normoxie, le GDC-0152 induit la différenciation des cellules souches (voie NF-κB) et en hypoxie il induit l’apoptose et diminue la prolifération cellulaire (voie ATR).Ces travaux soulignent l’importance du modèle préclinique utilisé dans la caractérisation de l'effet de nouvelles molécules et le potentiel thérapeutique des MS dans les GBs. / Glioblastomas (GBs) are the most aggressive primary brain tumors in adults. The causes of therapeutic failure are unknown and are multiples, such as tumor cell resistance to apoptosis, the presence of cancer stem cells or a pro-tumor microenvironment. Thus, the discovery of therapeutic molecules with pleiotropic action is particularly interesting. In this context, we are interested in smac mimetics (SM), antagonists of inhibitor of apoptosis proteins (IAPs) and most often antagonize cIAP1, cIAP2, XIAP and ML-IAP.We investigated whether IAPs could be attractive therapeutic targets in human GBs by studying their expression and their possible prognostic values. All IAPs were expressed in various degrees in GBs and ML-IAP was associated with a worse prognosis. Therefore, we chose GDC-0152 for the rest of our experiments because it antagonizes the different IAPs and in particular ML-IAP. We showed that GDC-0152 induces apoptosis in vitro, increases the survival of GB-bearing mice and slows tumor growth in vivo.We investigated whether the effect of GDC-0152 could be different depending on the oxygen level. Indeed, GBs are part of the most hypoxic tumors. For this purpose, four GB stem cell lines were grown in normoxia and hypoxia. We found that GDC-0152 has an anti-tumor effect regardless of oxygen level, but the signaling pathways involved were different. In normoxia, GDC-0152 induces differentiation of GB stem cells (NF-κB pathway) and in hypoxia it induces apoptosis and decreases cell proliferation (ATR pathway).This work highlights the importance of the preclinical model used in the characterization of a new molecule effects and the therapeutic potential of SM in GBs.

Les glioblastomes (GBMs) sont des tumeurs cérébrales au pronostic défavorable. La résistance aux thérapies actuelles et la rechute des GBMs pourraient être due à l'existence de cellules aux propriétés souches. L'objectif de ma thèse a été la caractérisation des cellules souches de GBMs (CSGs) isolées à partir de tumeurs. L'analyse du profil souche et de pluripotence des CSGs a montré qu'elles sont maintenues dans un état souche par SOX2 et que COL1A1 et IFITM1 peuvent être des cibles thérapeutiques potentielles. L'étude de la radiosensibilité des CSGs à travers l'analyse des courbes de clonogénicité a mis en évidence deux groupes dont un «atypique» pouvant être composé de sous-populations de cellules aux radiosensibilités différentes qu'il conviendra de caractériser. L'étude de la réparation a mis en évidence deux autres groupes dont un ayant un fort potentiel de réparation qui exprime plus fortement le gène RAD51 après irradiations. Le traitement par un inhibiteur spécifique de RAD51 ralentirait la capacité de réparation de ces cellules. Malgré cette hétérogénéité, l'inhibition de la voie Hedgehog (HH) par un vecteur glucuronylé de la cyclopamine, activé par le microenvironnement tumoral, inhibe la prolifération et l'auto-renouvellement des CSGs in vitro et ralentit la croissance tumorale in vivo. La voie HH semble être une cible thérapeutique intéressante commune à toutes les CSGs. Néanmoins, il est nécessaire de prendre en compte l'hétérogénéité dans les populations tumorales pour le développement de la médecine personnalisée. / Glioblastomas (GBMs) are brain tumors with a poor prognosis. Their resistance to current therapies and the occurrence of tumor relapse may be related to the existence of cells bearing stem cell characteristics. The aim of this PhD research was to characterize glioblastoma stem cells (GSCs) having been isolated from tumors. Analysis of the stemness and pluripotency profiles of GSCs indicated that their stemness states are maintained by SOX2 and that COL1A1 and IFITM1 may be potential therapeutic targets. Clonogenic studies of GSC radiosensitivity underscored the presence of two groups, one of them composed of sub-populations of cells with different degrees of radiosensitivity that have yet to be fully characterized. Study of DNA repair capacity highlighted two additional groups including one with high repair potential overexpressing the RAD51 gene after 4Gy. However, treatment with RAD51 inhibitor is likely to slow down repair of GSC lesions. Notwithstanding GSC heterogeneity, in our study inhibition of the Hedgehog pathway (HH) by a cyclopamine glucuronid prodrug, activated by the tumor microenvironment, inhibited in vitro proliferation and self-renewal in all the GSCs tested and slowed down tumor growth in vivo. Hence, HH pathway appears to be conserved among GSCs and constitutes an interesting potential therapeutic target. With regard to the development of personalized medicine, it is nevertheless highly advisable to take into account the pronounded heterogeneity of tumor populations.

Les capillaires cérébraux sont caractérisés par une structure et une organisation particulière au sein de l’unité neurovasculaire. Au travers de jonctions endothéliales particulièrement sélectives, la barrière hémato-encéphalique (BHE) orchestre les échanges de cellules, fluides, protéines et métabolites plasmatiques entre le sang et le compartiment cérébral. La VE-cadhérine, protéine transmembranaire des jonctions endothéliales, est particulièrement importante dans l’intégrité vasculaire puisque sa déstabilisation entraine un affaiblissement de la BHE et conduit à sa rupture dans certaines pathologies. Le glioblastome est une tumeur cérébrale extrêmement agressive et associée à un haut degré de vascularisation dont la perméabilité est anormalement élevée. Ceci contribue à la formation d’œdèmes vasculaires péri-tumoraux préjudiciables pour la santé du patient. Depuis la dernière décennie, un grand nombre d’études ont relié la présence d’une sous-population de cellules souches gliomateuses (CSG) à l’initiation, la récurrence et l’agressivité du glioblastome. De façon importante, ces CSG sont localisées dans un microenvironnement particulier, appelé niche vasculaire, dans lequel elles communiquent étroitement et échangent de manière bidirectionnelle avec l’endothélium cérébral. Sur la base d’un modèle de coculture entre CSG issues de patients, et cellules endothéliales cérébrales récapitulant les propriétés de la BHE, notre laboratoire a porté son attention sur la Sémaphorine 3A (Séma3A). Cette protéine est en effet sécrétée par les CSG et exerce, via son corécepteur Neuropiline-1 (Nrp-1), une action positive sur la perméabilité vasculaire par déstabilisation de la VE-cadhérine. Durant mes travaux de thèse, nous avons identifié et caractérisé la présence de la Séma3A à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) produites par les CSG. Un nombre grandissant d’études met en exergue l’implication de ces vésicules dans la biologie tumorale. Dans ce sens, nous avons démontré que les EV des CSG peuvent pénétrer dans les cellules endothéliales, et moduler leurs propriétés intrinsèques. Au travers de modèles in vivo originaux et de la combinaison de stratégies génétiques (ARN interférent) et pharmacologiques (anticorps bloquant humanisés), nous avons d’une part montré que la Séma3A, portée par les EV, agit spécifiquement via la Nrp-1 exprimée par les cellules endothéliales afin d’augmenter leur perméabilité. D’autre part, dans un modèle de xénogreffe orthotopique de CSG, nous avons identifié une augmentation significative du taux de Séma3A dans la fraction de EV circulantes. De manière intéressante, des résultats similaires ont été obtenus à partir de prélèvements de patients glioblastome nouvellement diagnostiqués. La Séma3A de ces vésicules, apte à augmenter la perméabilité vasculaire à distance, in vitro et in vivo au travers de la Nrp-1, représenterait donc un bon candidat en tant que futur marqueur théranostique du glioblastome. / Brain microvessels are characterized by specific structure and organization within the neurovascular unit. Through highly selective endothelial junctions, the blood-brain barrier (BBB) controls exchanges of cells, fluids, plasmatic proteins and metabolites between blood and the cerebral compartment. VE-cadherin, a transmembrane protein of endothelial junctions, is of most importance in the vascular integrity. Indeed, its destabilization leads to BBB weakening and also breaking in some pathology. Glioblastoma is a highly aggressive brain tumour characterized by a high vascularization rate and abnormal vascular permeability. These properties promote in turn perivascular œdema, harmful for the patient. Since the last decade, a growing number of studies link glioblastoma stem-like cell (GSC) population to the initiation, recurrence and aggressiveness of such cancer. Interestingly, GSCs are located within the vascular niche, a specific microenvironment where they survive, communicate and exchange factors with the microvascular endothelium. On the base of a coculture model between patient-derived GSCs and brain microvascular endothelial cells which recapitulate BBB properties, our laboratory has focused on Semaphorin 3A (Sema3A). Sema3A is a GSC secreted protein and acts through its coreceptor Neuropilin-1 (Nrp-1) which in turn destabilizes VE-cadherin and promotes vascular permeability. During my thesis, we have identified and characterized Sema3A at the membrane of GSC secreted extracellular vesicles (EVs). A growing number of studies highlight EVs as important actors of tumour biology, in this way we have demonstrated that GSC-derived EVs can be uptake by endothelial cells and modulate their intrinsic properties. Through original in vivo models in combination with genetic (RNA interference) and pharmacologic strategies (humanised blocking antibodies), we have demonstrated that EV-carried Sema3A acts specifically through endothelial cells Nrp-1 to promote permeability. Furthermore, in orthotopic GSC xenograft we have identified a significant increase in the Sema3A EV-fraction collected from peripheral blood. Interestingly, similar results were obtained from newly diagnosed glioblastoma blood samples. Moreover, Sema3A from this fraction is a potent propermeability factor that can act at distance through Nrp-1 both in vitro and in vivo. Altogether, our results suggest that EV-carried Sema3A orchestrates loss of barrier integrity in glioblastoma and may be of interest for prognostic purposes.

Les capillaires cérébraux sont caractérisés par une structure et une organisation particulière au sein de l’unité neurovasculaire. Au travers de jonctions endothéliales particulièrement sélectives, la barrière hémato-encéphalique (BHE) orchestre les échanges de cellules, fluides, protéines et métabolites plasmatiques entre le sang et le compartiment cérébral. La VE-cadhérine, protéine transmembranaire des jonctions endothéliales, est particulièrement importante dans l’intégrité vasculaire puisque sa déstabilisation entraine un affaiblissement de la BHE et conduit à sa rupture dans certaines pathologies. Le glioblastome est une tumeur cérébrale extrêmement agressive et associée à un haut degré de vascularisation dont la perméabilité est anormalement élevée. Ceci contribue à la formation d’œdèmes vasculaires péri-tumoraux préjudiciables pour la santé du patient. Depuis la dernière décennie, un grand nombre d’études ont relié la présence d’une sous-population de cellules souches gliomateuses (CSG) à l’initiation, la récurrence et l’agressivité du glioblastome. De façon importante, ces CSG sont localisées dans un microenvironnement particulier, appelé niche vasculaire, dans lequel elles communiquent étroitement et échangent de manière bidirectionnelle avec l’endothélium cérébral. Sur la base d’un modèle de coculture entre CSG issues de patients, et cellules endothéliales cérébrales récapitulant les propriétés de la BHE, notre laboratoire a porté son attention sur la Sémaphorine 3A (Séma3A). Cette protéine est en effet sécrétée par les CSG et exerce, via son corécepteur Neuropiline-1 (Nrp-1), une action positive sur la perméabilité vasculaire par déstabilisation de la VE-cadhérine. Durant mes travaux de thèse, nous avons identifié et caractérisé la présence de la Séma3A à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) produites par les CSG. Un nombre grandissant d’études met en exergue l’implication de ces vésicules dans la biologie tumorale. Dans ce sens, nous avons démontré que les EV des CSG peuvent pénétrer dans les cellules endothéliales, et moduler leurs propriétés intrinsèques. Au travers de modèles in vivo originaux et de la combinaison de stratégies génétiques (ARN interférent) et pharmacologiques (anticorps bloquant humanisés), nous avons d’une part montré que la Séma3A, portée par les EV, agit spécifiquement via la Nrp-1 exprimée par les cellules endothéliales afin d’augmenter leur perméabilité. D’autre part, dans un modèle de xénogreffe orthotopique de CSG, nous avons identifié une augmentation significative du taux de Séma3A dans la fraction de EV circulantes. De manière intéressante, des résultats similaires ont été obtenus à partir de prélèvements de patients glioblastome nouvellement diagnostiqués. La Séma3A de ces vésicules, apte à augmenter la perméabilité vasculaire à distance, in vitro et in vivo au travers de la Nrp-1, représenterait donc un bon candidat en tant que futur marqueur théranostique du glioblastome. / Brain microvessels are characterized by specific structure and organization within the neurovascular unit. Through highly selective endothelial junctions, the blood-brain barrier (BBB) controls exchanges of cells, fluids, plasmatic proteins and metabolites between blood and the cerebral compartment. VE-cadherin, a transmembrane protein of endothelial junctions, is of most importance in the vascular integrity. Indeed, its destabilization leads to BBB weakening and also breaking in some pathology. Glioblastoma is a highly aggressive brain tumour characterized by a high vascularization rate and abnormal vascular permeability. These properties promote in turn perivascular œdema, harmful for the patient. Since the last decade, a growing number of studies link glioblastoma stem-like cell (GSC) population to the initiation, recurrence and aggressiveness of such cancer. Interestingly, GSCs are located within the vascular niche, a specific microenvironment where they survive, communicate and exchange factors with the microvascular endothelium. On the base of a coculture model between patient-derived GSCs and brain microvascular endothelial cells which recapitulate BBB properties, our laboratory has focused on Semaphorin 3A (Sema3A). Sema3A is a GSC secreted protein and acts through its coreceptor Neuropilin-1 (Nrp-1) which in turn destabilizes VE-cadherin and promotes vascular permeability. During my thesis, we have identified and characterized Sema3A at the membrane of GSC secreted extracellular vesicles (EVs). A growing number of studies highlight EVs as important actors of tumour biology, in this way we have demonstrated that GSC-derived EVs can be uptake by endothelial cells and modulate their intrinsic properties. Through original in vivo models in combination with genetic (RNA interference) and pharmacologic strategies (humanised blocking antibodies), we have demonstrated that EV-carried Sema3A acts specifically through endothelial cells Nrp-1 to promote permeability. Furthermore, in orthotopic GSC xenograft we have identified a significant increase in the Sema3A EV-fraction collected from peripheral blood. Interestingly, similar results were obtained from newly diagnosed glioblastoma blood samples. Moreover, Sema3A from this fraction is a potent propermeability factor that can act at distance through Nrp-1 both in vitro and in vivo. Altogether, our results suggest that EV-carried Sema3A orchestrates loss of barrier integrity in glioblastoma and may be of interest for prognostic purposes.

Les capillaires cérébraux sont caractérisés par une structure et une organisation particulière au sein de l’unité neurovasculaire. Au travers de jonctions endothéliales particulièrement sélectives, la barrière hémato-encéphalique (BHE) orchestre les échanges de cellules, fluides, protéines et métabolites plasmatiques entre le sang et le compartiment cérébral. La VE-cadhérine, protéine transmembranaire des jonctions endothéliales, est particulièrement importante dans l’intégrité vasculaire puisque sa déstabilisation entraine un affaiblissement de la BHE et conduit à sa rupture dans certaines pathologies. Le glioblastome est une tumeur cérébrale extrêmement agressive et associée à un haut degré de vascularisation dont la perméabilité est anormalement élevée. Ceci contribue à la formation d’œdèmes vasculaires péri-tumoraux préjudiciables pour la santé du patient. Depuis la dernière décennie, un grand nombre d’études ont relié la présence d’une sous-population de cellules souches gliomateuses (CSG) à l’initiation, la récurrence et l’agressivité du glioblastome. De façon importante, ces CSG sont localisées dans un microenvironnement particulier, appelé niche vasculaire, dans lequel elles communiquent étroitement et échangent de manière bidirectionnelle avec l’endothélium cérébral. Sur la base d’un modèle de coculture entre CSG issues de patients, et cellules endothéliales cérébrales récapitulant les propriétés de la BHE, notre laboratoire a porté son attention sur la Sémaphorine 3A (Séma3A). Cette protéine est en effet sécrétée par les CSG et exerce, via son corécepteur Neuropiline-1 (Nrp-1), une action positive sur la perméabilité vasculaire par déstabilisation de la VE-cadhérine. Durant mes travaux de thèse, nous avons identifié et caractérisé la présence de la Séma3A à la membrane de vésicules extracellulaires (EV) produites par les CSG. Un nombre grandissant d’études met en exergue l’implication de ces vésicules dans la biologie tumorale. Dans ce sens, nous avons démontré que les EV des CSG peuvent pénétrer dans les cellules endothéliales, et moduler leurs propriétés intrinsèques. Au travers de modèles in vivo originaux et de la combinaison de stratégies génétiques (ARN interférent) et pharmacologiques (anticorps bloquant humanisés), nous avons d’une part montré que la Séma3A, portée par les EV, agit spécifiquement via la Nrp-1 exprimée par les cellules endothéliales afin d’augmenter leur perméabilité. D’autre part, dans un modèle de xénogreffe orthotopique de CSG, nous avons identifié une augmentation significative du taux de Séma3A dans la fraction de EV circulantes. De manière intéressante, des résultats similaires ont été obtenus à partir de prélèvements de patients glioblastome nouvellement diagnostiqués. La Séma3A de ces vésicules, apte à augmenter la perméabilité vasculaire à distance, in vitro et in vivo au travers de la Nrp-1, représenterait donc un bon candidat en tant que futur marqueur théranostique du glioblastome. / Brain microvessels are characterized by specific structure and organization within the neurovascular unit. Through highly selective endothelial junctions, the blood-brain barrier (BBB) controls exchanges of cells, fluids, plasmatic proteins and metabolites between blood and the cerebral compartment. VE-cadherin, a transmembrane protein of endothelial junctions, is of most importance in the vascular integrity. Indeed, its destabilization leads to BBB weakening and also breaking in some pathology. Glioblastoma is a highly aggressive brain tumour characterized by a high vascularization rate and abnormal vascular permeability. These properties promote in turn perivascular œdema, harmful for the patient. Since the last decade, a growing number of studies link glioblastoma stem-like cell (GSC) population to the initiation, recurrence and aggressiveness of such cancer. Interestingly, GSCs are located within the vascular niche, a specific microenvironment where they survive, communicate and exchange factors with the microvascular endothelium. On the base of a coculture model between patient-derived GSCs and brain microvascular endothelial cells which recapitulate BBB properties, our laboratory has focused on Semaphorin 3A (Sema3A). Sema3A is a GSC secreted protein and acts through its coreceptor Neuropilin-1 (Nrp-1) which in turn destabilizes VE-cadherin and promotes vascular permeability. During my thesis, we have identified and characterized Sema3A at the membrane of GSC secreted extracellular vesicles (EVs). A growing number of studies highlight EVs as important actors of tumour biology, in this way we have demonstrated that GSC-derived EVs can be uptake by endothelial cells and modulate their intrinsic properties. Through original in vivo models in combination with genetic (RNA interference) and pharmacologic strategies (humanised blocking antibodies), we have demonstrated that EV-carried Sema3A acts specifically through endothelial cells Nrp-1 to promote permeability. Furthermore, in orthotopic GSC xenograft we have identified a significant increase in the Sema3A EV-fraction collected from peripheral blood. Interestingly, similar results were obtained from newly diagnosed glioblastoma blood samples. Moreover, Sema3A from this fraction is a potent propermeability factor that can act at distance through Nrp-1 both in vitro and in vivo. Altogether, our results suggest that EV-carried Sema3A orchestrates loss of barrier integrity in glioblastoma and may be of interest for prognostic purposes.