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Les globules rouges (GR) jouent un rôle clé dans l’exercice de fonctions physiologiques du corps humain. Dans la microcirculation, par exemple, où ils s’écoulent dans des capillaires de diamètre comparable à leurs mêmes dimensions, les érythrocytes sont responsables de l’échange d’oxygène et nutriments avec les tissus. Il a été montré dans de nombreux articles scientifiques que des dysfonctionnements dans les propriétés des GRs et des dommages du tissu endothélial, en particulier au niveau de la couche de glycoprotéines qui le recouvre (glycocalyx), sont la cause principale des maladies vasculaires telles que la thrombose, le diabète et l’athérosclérose. En conséquence, la connaissance des propriétés mécaniques et rhéologiques qui permettent aux érythrocytes de se déformer et de s’organiser en agrégats dans les vaisseaux sanguins permettrait de mieux comprendre les mécanismes qui gouvernent la circulation du sang et, par conséquent, de faciliter le diagnostic des états pathologiques.Dans cette thèse l’attention s’est concentrée sur deux thèmes principaux : l’agrégation des GRs pendant l’écoulement dans les microcapillaires et la fonction du glycocalyx dans la microcirculation. Même si le sujet est à la fois essentiel et d’intérêt scientifique considérable, une analyse quantitative de la formation d’agrégats de GRs (cluster) n’avait pas encore été réalisée. Dans une première phase de ce projet de thèse des expériences in vitro ont été réalisées sur des suspensions de GRs avec un hématocrite d’environ 10%, afin d’observer leur tendance à s’agréger au cours du déplacement dans des tubes en verre de diamètre égal à 10 µm. Ce comportement a été évalué en fonction de la pression imposée et du temps de résidence dans de microcanaux, en mesurant la longueur des clusters et leur composition numérique. Le but principal a été comprendre le type d’interaction entre les cellules composantes un cluster : il s’agit d’une interaction purement hydrodynamique ou des autres forces sont également impliquées ? Les résultats expérimentaux présentés dans cette thèse clairement montrent que la véritable force motrice du phénomène est la pression imposée dans les capillaires. Cette approche microfluidique permet de jeter les bases pour le développement de dispositifs cliniques et diagnostiques.Dans la deuxième partie du projet, une campagne expérimentale a été réalisée sur microcapillaires en verre revêtus de brosses de polymères, afin de simuler les conditions in vivo dans la microcirculation. Il a été établi avec certitude que le lumen des vaisseaux sanguins est recouvert d’une couche de glyco-polymères (glycocalyx) liés à la membrane des cellules endothéliales qui tapissent leurs parois. La compréhension du rôle hydrodynamique du glycocalyx est essentielle pour expliquer le lien entre le dysfonctionnement cette couche et le maladies vasculaires et pour développer des tests basés sur la microfluidique, capable de représenter correctement les interactions entre les parois et le composants sanguins. Des couches nanométriques de poly-hydroxyéthylméthacrylate (pHEMA) ont été produites par ce qu’on appelle la technique grafting-from et, après une caractérisation approfondie, utilisées pour revêtir les surfaces internes de canaux en verre de 10 µm de diamètre. Dans cette thèse, nous présentons les profils de vitesse obtenus en étudiant la circulation dans des tubes recouverts avec brosses de différentes épaisseurs. On montre que il y a une augmentation de la résistance à l’écoulement dans les canaux recouverts et que la réduction de la vitesse est significativement plus grande par rapport à ce qui se produirait à la suite d’une simple réduction géométrique du lumen disponible. De plus, à partir de l’observation de l’écoulement de GRs à l’intérieur des microcapillaires recouverts par les brosses de polymère, il a été constaté que la vitesse et la déformabilité des GRs dépendent strictement de la présence de la bio-couche sur les parois des microtubes. / The investigation of red blood cells (RBCs) dynamics in blood circulation is one of the most innovative and intriguing challenge of science nowadays since erythrocytes are involved in fundamental physiological functions of human body. In particular, RBCs play a key role in microcirculation where narrow dimensions of vessels (comparable to cell size) promote a close contact between cells and capillary walls and, as a consequence, the exchange of oxygen between blood and tissues. It is well established in scientific literature that disorders in RBCs properties and damages of endothelium are the main causes of common vascular diseases, such as thrombosis, diabetes and atherosclerosis. Thus, the full understanding of mechanical and rheological properties of RBCs would allow not only to shed light on the mechanisms leading blood circulation, but also to develop increasingly reliable diagnostic devices. In this thesis, the attention is mainly focused on two topics: RBCs aggregation in microcapillaries and the role of glycocalyx in microcirculation. As regards the first theme, despite the considerable scientific importance, a quantitative analysis of RBCs aggregates formation (clustering) in microvessels is still lacking. In a first phase of the project, experimental investigations in vitro have been performed on RBCs suspensions with hematocrit almost equal to 10% to observe their tendency to aggregate during the flow in glass microtubes (diameter equal to 10 µm). RBCs aggregation has been evaluated as a function of the fixed pressure drop (Δp) and the residence time in microchannels by measuring clusters length and their statistical composition. The main aim of the experiments was to clarify the nature of the force acting on consecutive cells in a cluster: is it a pure hydrodynamic interaction or are other kinds of forces involved too? The experimental results presented in this thesis clearly show that the driving force of the phenomenon is the imposed Δp in the microtubes. The outcomes of these investigations suggest that microfluidics can represent an efficient means to develop clinical and diagnostic tests on healthy and pathological blood.In the second part of the thesis, an experimental campaign was performed on glass capillaries lined with polymer brushes to mimic in vivo conditions in microvascularity. Several scientific papers show that the lumen of vascular vessels is coated by a layer of glycopolymers linked to the endothelial cells. The full understanding of the hydrodynamic role of glycocalyx is essential to elucidate the link between its dysfunctions and vascular diseases. Moreover, it would be helpful to develop innovative clinical tests by microfluidics that could take in account the interactions between “hairy” walls and blood components. Nanometric brushes of poly-hydroxyethylmethacrylate (p-HEMA) have been produced by a grafting-from technique and, after characterization, they have been used to line internal surfaces of silica capillaries with 10 µm diameter. Here, we present the experimental results obtained by measuring velocity profiles in glass channels bearing polymer brushes of different thickness. An increasing flow resistance is observed in hairy channels as a function of brush thickness. The measured velocity decrease is significantly higher than expected from a simply geometrical reduction of the available capillary lumen. Furthermore, the observation of RBCs flow in such brush-coated channels reveals that cells velocity and deformation are closely depending on the presence of the bio-layer on the internal walls of the capillaries.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La microcirculation est rapidement altérée dans le sepsis et la persistance de ces altérations est associée à un mauvais pronostic. La microcirculation est composée de vaisseaux invisibles à l’œil (< 100 µm), de l’endothélium, du glycocalyx, des cellules musculaires lisses et des éléments sanguins dont les GR. De nombreuses études animales et humaines ont rapporté des altérations rhéologiques des GR dans le sepsis. Ces modifications comprennent une diminution de la déformabilité, une augmentation de l’agrégation et de l’adhérence globulaire. De plus, l’altération de la déformabilité peut induire des altérations du flux microcirculatoire dans des modèles expérimentaux animaux. Ces mêmes altérations rhéologiques sont rapportées dans le diabète. Dans cette pathologie, les GR présentent une diminution du contenu membranaire en AS, comme dans les processus de sénescence. La déformabilité des GR dépend des caractéristiques cellulaires incluant surtout les propriétés de la membrane, la géométrie cellulaire et dans une moindre mesure la viscosité cellulaire. Malgré la connaissance des altérations de la rhéologie dans le sepsis, peu de travaux, au contraire du diabète, s’interessent aux modifications de la membrane. Nous avons étudié, par analogie aux altérations globulaires rapportées dans le diabète, la membrane des GR de patients admis en soins intensifs pour un sepsis, et comparé à des GR de patients non septiques et de volontaires sains. Le contenu membranaire en AS était significativement diminué chez les patients septiques par rapport aux patients non-septiques et aux volontaires sains. De plus, les GR des patients septiques, analysés par une technique de cytométrie en flux indépendante de la température de l’échantillon, étaient rapidement plus sphériques (dans les 24 heures du sepsis) et incapables de modifier leurs formes en hypoosmolalité. Cette technique de cytométrie a par ailleurs aussi été utilisée pour l’analyse de GR de patients diabétiques et en insuffisance rénale terminale. La diminution du contenu en AS est aussi rapidement observée sur la transferrine, suggérant une augmentation de la concentration et/ou de l’activité de la neuraminidase, enzyme clivant l’AS. Dans un modèle de choc septique induit chez l’ovin, nous avons confirmé la rapidité de ce phénomène. En effet, la concentration en AS libre augmente dès la 15ième heure après induction du sepsis. In-vitro, nous avons pu reproduire les modifications de forme des GR observés chez les patients septiques par incubation de GR de volontaire avec de la neuraminidase, et ce en 10 heures, quelles que soient les concentrations utilisées. Ces modifications de forme et de membrane s’accompagnent d’une augmentation significative du contenu en lactate, suggérant une stimulation de la glycolyse érythrocytaire et en 2,3-DPG, facilitant la libération de l’O2 de l’Hb vers les tissus. Toutes ces modifications touchant la membrane des GR des patients de soins intensifs, surtout septiques, peuvent être responsables des altérations de rhéologie que nous avons observé grâce au LORCA sur une large population admis aux soins intensifs. Une meilleure compréhension des mécanismes conduisant aux altérations rhéologiques des GR dans le sepsis, et ses effets potentiellement déletères sur la microcirculation, sont nécessaires avant d’envisager les GR comme cible thérapeutique.

La capacité des globules rouges à modifier leur forme en fonction de conditions externes spécifiques représente une propriété fondamentale permettant aux cellules de traverser des capillaires de diamètres plus petits que leur propre diamètre. L’ektacytométrie est une technique utilisée pour mesurer la déformabilité des globules rouges en exposant un échantillon très dilué de sang à des contraintes de cisaillement et en mesurant l’élongation resultante des globules par l'analyse de la figure de diffraction laser. Ce travail contribue à la conception et l’évaluation d’un nouveau dispositif de diagnostic basé sur la méthode microfluidique d'ektacytométrie à gradient osmolaire. Elle permet de mesurer la déformabilité d'une population de globules rouges (RBC), en fonction de l'osmolalité de milieu. Cette mesure permet un diagnostic différentiel d'un certain nombre de troubles de globules rouges présentant des symptômes similaires. Elle permet également de suivre les effets de certains traitements. Des aspects théoriques qui s’appuient sur les équations des écoulements et une preuve de principe sont discutés. Cette nouvelle technique ouvre la possibilité de construire un instrument simple et peu encombrant, décrit dans ce travail, ne nécessitant qu'un prélèvement de sang au bout du doigt / The ability of red blood cells (RBC) to change their shape under varying conditions is a crucial property allowing these cells to go through capillaries narrower than their own diameter. Ektacytometry is a technique for measuring deformability by exposing a highly diluted blood sample to shear stress and evaluating the resulting elongation in RBC shape using a laser diffraction pattern. This work contributes to the design and evaluation of a new diagnostic technique based on osmotic scan ektacytometry, using a microfluidic method. It allows the measurement of deformability of an RBC population, as a function of varying medium osmolality. This measurement makes possible a differential diagnosis for any one of a number of RBC disorders presenting similar symptoms. It also permits the physician to follow the effects of treatments. Both theoretical aspects based on flow equations and a proof of principle are discussed. This new technique opens up the possibility of building a simple, small footprint instrument described in this work that can be used with finger prick amounts of blood

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Bovine milk fat globules naturally vary from less than 0.2 µm to 15 µm in diameter. Milk has at least two distinct distributions of fat globules. While the majority (~90%) of globules in milk are of the smaller distribution (average diameter of 0.4 µm), virtually all the fat is carried in the larger globules (average diameter 3.5 µm). This distribution suggests some compositional and/or functional significance might exist between the two populations of fat globules, which may be related to origin of these globules in the lactating cell. Milk fat globules have a unique structure, composed of a core droplet of non polar lipids (triacylglycerol) surrounded by a lipid bilayer membrane known as milk fat globule membrane (MFGM). Other than MFGM, there is another source of membrane that has been identified in skim milk. It has been hypothesized that this skim milk membrane (SMM) is derived from MFGM, but little data are available to support this idea, and the membrane may also have alternate origins. In this study, different aggregates of lipids (small and large fat globules, SMM, skim milk) from milk were isolated and characterized for their lipid contents. Isolation of small and large fat globules fractions was verified by laser diffraction particle size analysis. The lipids were extracted from isolated different lipid aggregates and individual classes were separated using thin layer chromatography. Lipids were transesterified to fatty acid methyl esters and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry. The results indicate that there are some compositional differences between native milk fat globule membranes of different sizes. For example, the total phospholipid fraction of small fat globules (SFG) contained significantly more unsaturated C18:1n9 and C18:2n6 than large fat globules (LFG). Conversely, sphingomyelin composition of SFG contained less C18:1n9 and C18:2n6cc, but more long chain fatty acids C22:0, C23:0, and C24:0. Phosphatidylethanolamine composition of SMM contained more C17:1 than SFG and LFG. The composition of C18:1n9 in triacylglycerol increased with fat globule size. Clear differences were also found in lipid profile of SMM and small and large fat globules from milk. Composition differences between SMM and native milk fat globules of different sizes suggest that origin of this membrane material in skim milk might have some different source than that of MFGM.

Cette thèse vise à évaluer deux techniques différentes pour la distinction d'échantillons biologiques mécaniquement altérés. Les deux approches ont été mises au point et étudiées avec un objectif à long terme qui est l'application de ces méthodes au diagnostic basé sur le phénotype mécanique. Bien que, nous avons élaboré ces approches dans le cas de globules rouges (GR), comme leurs propriétés mécaniques peuvent être affectées par des pathologies importantes, tous les concepts développés dans ce travail peuvent être adaptés à d'autres types de cellules.Nous avons caractérisé les propriétés mécaniques de GR à l'aide d'une technique microfluidique passive. L'accent a été mis sur la relaxation de globules rouges sains (GRs) à la sortie d'un canal à largeur variante et la dépendance de la réponse mécanique aux conditions expérimentales a été démontrée. Nous avons rapporté deux modes de relaxation du GR en fonction des paramètres de l'écoulement, et nous avons utilisé l'interface entre ces deux modes pour remonter aux propriétés mécaniques du GR. Lors de la seconde approche, nous avons présenté les résultats obtenus au cours de l'étude du comportement mécanique des GRs à l'aide de l'électrodeformation. Nous avons étudié l'influence des paramètres expérimentaux sur la réponse cellulaire et conclu sur des conditions optimisées pour la sollicitation des cellules sans les altérer. Pour finir, nous avons fait le point sur l'évaluation de ces deux techniques dans la discrimination des échantillons mécaniquement défaillants des sujets sains. Les avantages et inconvénients des deux approches ont été discutés / This thesis aims at evaluating two different techniques for the distinction of mechanically impaired biological samples. Both approaches were developed and investigated keeping in mind the long term objective which is the application of these approaches to diagnosis based on cell mechanical phenotype. Although, we developed these approaches on Red Blood Cells as as their mechanical properties can be affected by important pathologies, all the concepts developed in this work can be adapted to other cell types.We characterized mechanically RBCs using a passive microfluidic technique. We focused on the shape relaxation of healthy Red Blood Cells (hRBCs) flowing out of an oscillating width channel and demonstrated the dependency of their mechanical response upon the experimental conditions. We reported the existence of two relaxation modes for RBCs depending on the flow parameters, we used the interface between the two modes to extract the mechanical properties of RBC.Using a second approach, we presented the results obtained during the study of the mechanical behavior of hRBCs using electrodeformation assays. We investigated the influence of the solicitation parameters on the cell response and concluded on optimized conditions for cell solicitation without altering them. Finally, we evaluated both techniques in the discrimination of rigidified samples from healthy couterparts. Advantages and drawbacks of both techniques were discussed

Les techniques de diffusion incohérente élastique et quasiélastique de neutrons ont été utilisées pour mesurer la dynamique de la protéine et de l'eau cellulaire sur les échelles de quelques picosecondes et de quelques Ångstroms. La dynamique de l'hémoglobine a été mesurée dans les globules rouges, in vivo. La dynamique interne de la protéine montre un changement de régime à 36.9°C, la température physiologique. À des températures plus élevées que la température physiologique, les chaînes latérales des amino acides occupent des volumes plus grands que prévu par la dépendance normale sur la température. La diffusion globale de l'hémoglobine a été interprétée avec la théorie pour la diffusion des particules colloïdales à temps de courte durée. L'influence de l'hydratation sur la dynamique de l'hémoglobine a été étudiée avec la diffusion de neutrons. Les temps de résidence entre les sauts locaux dans l'ordre de quelques picosecondes sont réduits en solution concentrée et augmentés en poudre d'hémoglobine hydratée. La transition dans la géométrie des mouvements internes à la température du corps a été trouvée dans la solution concentrée, mais pas dans la poudre hydratée. Il a été conclu que les poudres hydratées ne représentent pas un bon modèle pour la dynamique de la protéine dans l'ordre de quelques picosecondes, qui est corrélée à la fonction biologique. La dynamique de l'eau cellulaire dans les globules rouges a été mesurée avec la technique de diffusion incohérente quasiélastique de neutrons. Une fraction de l'eau cellulaire d'environ 90% est caractérisée par un coefficient de diffusion translationnel similaire à celui de l'eau volumique. Les 10% restant présentent une dynamique ralentie de façon significative. La fraction ralentie a été attribuée à l'eau en interaction avec l'hémoglobine. Elle correspond à environ la moitié de l'eau dans la première couche d'hydratation de la protéine.

Dynamique de suspensions de vésicules et de globules rouges en écoulement de cisaillement simple et en microfluidique.