Diss. (sammanfattning) Uppsala : Uppsala universitet, 2009.

Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε το ντοπαμινεργικό και γλουταμινεργικό σύστημα των βασικών γαγγλίων, χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά μοντέλα ζώων. Ο πρώτος στόχος ήταν να εξεταστεί εάν η μεταφορά του γονιδίου TrkA σε νευρώνες της μέλαινας ουσίας (SN) ενήλικων επίμυων επιδρά στις νευροχημικές τους ιδιότητες, απουσία ή παρουσία εξωγενούς νευροαυξητικού παράγοντα (NGF) στο ραβδωτό σώμα. Η εκτοπική έκφραση του TrkA στην SN οδήγησε σε σημαντική μείωση του mRNA της υδροξυλάσης της τυροσίνης (TH), της TH ανοσοδραστικότητας και του mRNA του DAT στη δεξιά SN σε σύγκριση με την ετερόπλευρη, ενώ δεν βρέθηκε καμία διαφορά στο mRNA των υποδοχέων ντοπαμίνης D2 και της ειδικής δέσμευσης του [3Η]raclopride στην SN. Δεν παρατηρήθηκαν μεταβολές στις θέσεις δέσμευσης του [3Η]WIN35428 και της ανοσοδραστικότητας του DAT στο ομόπλευρο ραβδωτό σώμα, καθώς και στις θέσεις δέσμευσης των μετασυναπτικών υποδοχέων ντοπαμίνης D1 και D2, όπως καθορίζεται από τους ιχνηθέτες [3H]SCH23390 και [3Η] raclopride, αντίστοιχα. Επιπλέον, δεν βρέθηκαν σημαντικές μεταβολές στους υποδοχείς NMDA και AMPA. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η εκτοπική έκφραση του TrkA στην SN ρυθμίζει αρνητικά την ΤΗ και οδηγεί σε ανεξάρτητες από τον NGF αποκρίσεις. O δεύτερος στόχος της διατριβής ήταν η μελέτη του ντοπαμινεργικού συστήματος σε ένα μοντέλο DYT1 δυστονίας μυός. Σε διαγονιδιακούς μυς με υπερκινητική και μη υπερκινητική συμπεριφορά παρατηρήθηκε μείωση των υποδοχέων ντοπαμίνης D2 στο ραβδωτό σώμα, όπως προσδιορίστηκε από τη δέσμευση του [3H]raclopride, και τoυ mRNA των D2 στην SNpc, σε σχέση με μη διαγονιδιακούς μυς. Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στη δέσμευση του [3H]SCH23390 ή του [3H]WIN35428 στο ραβδωτό σώμα διαγονιδιακών μυών. Τα δεδομένα προτείνουν μία πιθανή εμπλοκή της ντοπαμινεργικής νευροδιαβίβασης στην παθοφυσιολογία της DY1 δυστονίας. / In the present thesis we examined the dopaminergic and glutamatergic neurotransmission systems of basal ganglia, using two different animal models. The first goal was to investigate whether TrkA gene transfer into substantia nigra (SN) neurons of adult rats influence some of their neurochemical properties, in the absence or presence of exogenous nerve growth factor (NGF) delivery in the striatum. Ectopic expression of TrkA in SN resulted in a significant decrease of tyrosine hydroxylase (TH) immunoreactivity, TH mRNA and DAT mRNA expression in the right SN compared to the contralateral side, while no difference was found in the mRNA expression of D2 DA receptors and [3H]raclopride binding in SN. No significant changes were seen in the density of DAT by measuring [3H]WIN35428 binding sites and DAT immunoreactivity in the ipsilateral striatum, as well as in the number of postsynaptic striatal D1 and D2 receptor binding sites, as determined by [3H]SCH23390 and [3H]raclopride, respectively. Furthermore, no significant changes were found in NMDA and AMPA receptors. These data suggest that ectopic TrkA expression in SN downregulates TH in nigral dopaminergic neurons and elicits NGF-independent responses. The second goal of the present thesis was to examine the dopaminergic system of basal ganglia in a mouse model of DYT1 dystonia. A decrease in striatal D2 binding sites, measured by [3H]raclopride binding, and D2 mRNA expression in substantia nigra pars compacta (SNpc) was revealed in affected and unaffected transgenic mice when compared with non-transgenic. No difference in D1 receptor binding and DAT binding, measured by [3H]SCH23390 and [3H]WIN35428 binding, respectively, was found in striatum of transgenic animals. These data suggest a possible involvement of dopamine neurotransmission in the pathophysiology of DYT1 dystonia.

O ácido ƴ-poliglutâmico (ƴ-PGA) é uma homopoliamida aniônica, biodegradável, comestível e atóxica, sintetizada por bactérias do gênero Bacillus, podendo ser utilizado nas indústrias alimentícia e de cosméticos, na medicina e no tratamento de águas residuais. Este trabalho teve como objetivo caracterizar e identificar potenciais aplicações para o ƴ-PGA obtido através do cultivo submerso de Bacillus subtilis BL53, conduzido sob condições otimizadas em trabalhos anteriores. Além disso, foi avaliado o efeito de diferentes inóculos e da adição de precursores da rota metabólica na produção do biopolímero. A melhor condição obtida foi testada em biorreatores com adição de polidimetilsiloxano (PDMS) como carreador de oxigênio, com o objetivo de aumentar a produtividade do biopolímrero. A massa molar média (Mw), obtida através de espalhamento de luz estático, na ordem de 106 g mol-1 não apresentou diferenças significativas para o biopolímero obtido após 48 e 96 h de cultivo. As análises reológicas conduzidas em viscosímetro rotacional indicaram que os polímeros obtidos após 48 e 96 horas apresentaram comportamento Newtoniano, sendo que após 96 horas a viscosidade absoluta foi maior. As análises térmicas (calorimetria diferencial exploratória e análise termogravimétrica) indicaram a temperatura de fusão (Tm) de 134 ºC e 128 ºC e o intervalo de degradação (Td) entre 120 ºC - 190 ºC e 120 ºC - 215 ºC, para os biopolímeros obtidos após 48 e 96 horas de cultivo respectivamente. O caldo LB apresentou-se como o melhor inóculo para a produção de ƴ-PGA. A adição dos precursores L-glutamina e ácido -cetoglutárico aumentou em 20 % a produção do biopolímero. A adição de 10 % de PDMS nos cultivos em biorreatores aumentou o coeficiente volumétrico de transferência de massa (KLa) e a produção e produtividade do ƴ-PGA, sendo produzidos 23.5 g L-1 do biopolímero em 24 horas de cultivo, uma produtividade aproximadamente 40 % superior às obtidas por outros autores utilizando o mesmo microrganismo. / Poly-ƴ-glutamicacid (ƴ-PGA) is an anionic, biodegradable, non-toxic and edible homopolyamide, synthesized by bacteria of the genus Bacillus, being used in food, cosmetics, medicine and waste water treatment. The aim of this study is to characterize and indentify potencial applicatiions for the ƴ-PGA obtained by submerged cultivation of Bacillus subtilis BL53, conducted under optimized conditions in previous studies. We also evaluated the effect of different inoculants and addition of precursors in the metabolic pathway of production of the biopolymer. The best condition obtained yet been tested in bioreactors with addition of polydimethylsiloxane (PDMS) as a carrier of oxygen in order to further increase the productivity of biopolymer. The average molecular weight (Mw) obtained by static light scattering, on the order of 106 g mol-1, showed no significant differences for biopolymer obtained after 48 and 96 h of cultivation. Analyses conducted in rotational viscometer indicated that biopolymers after 48 and 96 h have a Newtonian behavior, and the 96 hours had higher absolute viscosity. The thermal analysis (differential scanning calorimetry and thermo gravimetric analysis) indicated the melting temperature (Tm) as 134 ºC and 128 ºC and degradation temperature range (Td) of 120 ºC - 190 ºC and 120 ºC - 215 ºC, after 48 and 96 hours respectively. It was found that the best inoculum medium for biopolymer production was the LB broth. The addition of the precursors L-glutamine and -ketoglutaric acid increased in 20% the ƴ-PGA production. The addition of 10% of PDMS in bioreactors cultures increased the mass transfer volumetric coefficient (KLa) and the production and productivity of ƴ-PGA, being produced 23.5 g l-1 of the biopolymer in 24 hours of cultivation, a productivity about 40 % higher than those obtained by other authors using the same microorganism.

O ácido y-poliglutâmico (y-PGA) é um biopolímero solúvel em água, aniônico, atóxico, biodegradável e biocompatível, produzido por Bacillus e que possui aplicações nas áreas química, médica, ambiental e de alimentos. Este trabalho tem como objetivo estudar o processo de produção do y-PGA a partir do cultivo de uma nova linhagem de Bacillus isolada de ambiente amazônico, o Bacillus subtilis BL53. Este estudo inclui a seleção de culturas, a otimização de condições de cultivo e a prospecção de substratos de produção alternativos. A habilidade de produção de y-PGA por linhagens de Bacillus isoladas na região amazônica foi investigada. A linhagem BL53 foi a linhagem selecionada, sendo identificada como Bacillus subtilis, através da análise da seqüência do gene 16S DNAr e de suas características bioquímicas. A avaliação das condições de cultivo submerso foi conduzida em agitador orbital mediante delineamento composto central rotacional (DCCR) que apontou como ponto ótimo de produção de y-PGA, a temperatura de 37 oC, o pH inicial de 6,9 e a concentração de 1,22 mM de Zn2+ suplementada ao Caldo E. Nas condições otimizadas, a produção de y-PGA foi igual a 10,4 g/L, cerca de três vezes maior que a obtida em condições convencionais de cultivo em Caldo E, utilizando a mesma linhagem. A influência da disponibilidade de oxigênio sobre a produção de y-PGA por B. subtilis BL53 foi avaliada em biorreator agitado de 5 L, com o emprego das velocidades de agitação de 500, 750 e 1000 rpm, sendo mantida fixa a taxa de aeração de 2 vvm. A produção de y-PGA mostrou-se altamente dependente da transferência de oxigênio, sendo que o teor de oxigênio dissolvido decaiu rapidamente nas primeiras 15 horas de cultivo, como resultado da elevada demanda de oxigênio pelas bactérias. O aumento na velocidade de agitação no biorreator possibilitou uma maior transferência de oxigênio e induziu o aumento na taxa de consumo de oxigênio pelas bactérias, conduzindo a maior produção e maior produtividade de y-PGA. A intensificação da agitação também influenciou os parâmetros cinéticos de crescimento do Bacillus subtilis BL53, provocando um aumento na velocidade específica de crescimento na fase logarítmica (max) sem provocar a perda da viabilidade celular. Com a utilização da velocidade de agitação de 1000 rpm em biorreator, o tempo de cultivo pode ser reduzido para menos de 48 h, cerca de 50% do tempo necessário para operação a 500 rpm. A investigação de substratos alternativos para produção de y-PGA mostrou o glicerol residual de biodiesel e o resíduo fibroso de soja como substratos promissores, apontando para a possibilidade de investigação em trabalhos futuros. / The poly-gamma-glutamic acid (y-PGA) is a water-soluble biopolymer, anionic, non toxic, biodegradable and biocompatible, it is produced by Bacillus and it has applications in chemical, medical, environmental and food industries. This work aims to study the process of production of y-PGA through cultivation of a new strain of Bacillus isolated from the Amazonian environment, Bacillus subtilis BL53. This study includes the screening of strains, the optimization of culture conditions and the investigation of alternative substrates. The ability of y-PGA production by Bacillus strains isolated from Amazonian environment was investigated. The BL53 strain was selected and identified as Bacillus subtilis, through analysis of 16S rDNA gene sequence and its biochemical characteristics. Evaluation of culture conditions in submerged cultivation was conducted in shaker using central composite design (CCD), which showed the temperature of 37 oC, the initial pH 6.9 and concentration of 1.22 mM Zn2+ in Medium E as the optimal conditions to y-PGA production. Under optimized conditions, the production of y-PGA was 10.4 g/L, about threefold what was obtained using this strain under conventional cultivation in Medium E. The influence of oxygen availability on the production of y-PGA by B. subitlis BL53 was evaluated in a 5 l stirred bioreactor with the use of stirring rates of 500, 750 and 1000 rpm, using a fixed aeration rate of 2 vvm. Production of y-PGA was highly dependent on oxygen transfer, and the dissolved oxygen content decreased rapidly in the first 15 hours of culture as a result of high oxygen demand by bacteria. The increase in stirring rate in the bioreactor allowed a better oxygen transfer and induced a rise in the oxygen uptake rate by bacteria, leading to higher production and higher productivity of y-PGA. The intensification of the stirring also influenced the kinetics growth parameters of Bacillus subtilis BL53, producing an increase in specific growth rate in the logarithmic phase (max) without causing reduction of cell viability. Using the stirring rate of 1000 rpm in a bioreactor, the cultivation time can be reduced to less than 48 h, about 50% of the time required for operation at 500 rpm. The investigation of alternative substrates for the production of y-PGA showed crude glycerol from biodiesel and soybean industrial fibrous residue as promising ones, pointing to research possibilities in future work.

A correta classificação do tipo de DM leva mais precocemente ao tratamento adequado e atualmente é dividida em 4 categorias: DM tipo 1, DM tipo 2, Outros tipos e Diabete Gestacional. O DM tipo 1 é geralmente auto-imune, surge em geral antes dos 20 anos de idade e é dependente de insulina para impedir a cetoacidose. O DM tipo 2 é responsável por mais de 90% dos casos, acontece em geral após os 45 anos, com história familiar e associado à síndrome metabólica. Na categoria “outros tipos”, o Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY) é um subtipo que inicia abaixo dos 25 anos, não-dependente de insulina e apresenta herança dominante. No entanto, apesar da classificação definir essas categorias através de características peculiares, pode existir uma sobreposição de quadros, principalmente no DM que inicia no adulto jovem. Assim, novos sistemas de classificação têm sido propostos, empregando a presença da auto-imunidade (anticorpos) e índices de função de célula β (peptídeo-C) para definir a patogênese e nomenclatura mais específicas. O objetivo desta revisão é descrever e analisar o desempenho destas ferramentas diagnósticas na classificação do DM. Os anticorpos evidenciam a auto-imunidade do DM 1. O IAA (insulin auto-antibody) está presente quando o início do DM se dá, principalmente, antes dos 5 anos de idade e o anti- GAD (glutamic acid decarboxylase) tem seu melhor desempenho nos indivíduos com início da doença acima dos 20 anos, sendo o teste que permanece positivo por mais tempo. A medida do peptídeo-C avalia a reserva pancreática de insulina e deve ser realizada com glicemia entre 70-200 mg/dl. A medida após estímulo é a mais estudada e <1,5 ng/ml define o paciente como DM 1. O estímulo com refeição mista é o recomendado pela ADA, mas o teste com 1 mg de glucagon é mais simples e igualmente acurado. Dados em relação à utilização da classificação baseada na medida de diferentes anticorpos dirigidos ao pâncreas classificação A (anticorpos) e β (peptídeo-C) pode ser adotada como um método acurado, relativamente simples e preciso de classificação de DM. / The correct classification of DM type leads to earlier appropriate treatment and is currently divided into 4 categories: type 1 DM, type 2 DM, Other types and Gestational DM. Type 1 DM is generally autoimmune, it usually appears before the age of 20 years, and depends on insulin to prevent ketoacidosis. Type 2 DM accounts for over 90% of the cases, it usually occurs after the age of 45, with a family history and metabolic syndrome. In the category “other types”, Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY) is a subtype that begins before the age of 25, is non-insulin dependent and presents a dominant heritage. However, although the classification defines these categories through peculiar characteristics, there may be superimposed pictures, especially in the case of DM which begins in the young adult. Thus, new classification systems have been proposed, using the presence of autoimmunity (antibodies) and β cell (C-peptide) indexes to define the pathogenesis and more specific nomenclatures. The purpose of this review is to describe and analyze the performance of these diagnostic tools in the classification of DM. The presence of antibodies show the autoimmunity of type 1 DM. IAA (insulin auto-antibody) is present mainly before the age of 5 years, and anti-GAD (glutamic acid decarboxylase) performs best in individuals who begin the disease above the age of 20, and its test remains positive longest. The C-peptide measure evaluates the pancreatic reserve of insulin and should be performed with a glycemia between 70-200 mg/dl. Post-stimulus measuring is more widely studied and <1.5 ng/ml defines the patient as DM1. Stimulation with a mixed meal is recommended by ADA, but the test with 1 mg of glucagon is simpler and just as effective. Data on classification A (antibodies), β (Cpeptide) suggest that it may be adopted as an effective, relatively simple and precise method for DM classification.

O ácido ƴ-poliglutâmico (ƴ-PGA) é uma homopoliamida aniônica, biodegradável, comestível e atóxica, sintetizada por bactérias do gênero Bacillus, podendo ser utilizado nas indústrias alimentícia e de cosméticos, na medicina e no tratamento de águas residuais. Este trabalho teve como objetivo caracterizar e identificar potenciais aplicações para o ƴ-PGA obtido através do cultivo submerso de Bacillus subtilis BL53, conduzido sob condições otimizadas em trabalhos anteriores. Além disso, foi avaliado o efeito de diferentes inóculos e da adição de precursores da rota metabólica na produção do biopolímero. A melhor condição obtida foi testada em biorreatores com adição de polidimetilsiloxano (PDMS) como carreador de oxigênio, com o objetivo de aumentar a produtividade do biopolímrero. A massa molar média (Mw), obtida através de espalhamento de luz estático, na ordem de 106 g mol-1 não apresentou diferenças significativas para o biopolímero obtido após 48 e 96 h de cultivo. As análises reológicas conduzidas em viscosímetro rotacional indicaram que os polímeros obtidos após 48 e 96 horas apresentaram comportamento Newtoniano, sendo que após 96 horas a viscosidade absoluta foi maior. As análises térmicas (calorimetria diferencial exploratória e análise termogravimétrica) indicaram a temperatura de fusão (Tm) de 134 ºC e 128 ºC e o intervalo de degradação (Td) entre 120 ºC - 190 ºC e 120 ºC - 215 ºC, para os biopolímeros obtidos após 48 e 96 horas de cultivo respectivamente. O caldo LB apresentou-se como o melhor inóculo para a produção de ƴ-PGA. A adição dos precursores L-glutamina e ácido -cetoglutárico aumentou em 20 % a produção do biopolímero. A adição de 10 % de PDMS nos cultivos em biorreatores aumentou o coeficiente volumétrico de transferência de massa (KLa) e a produção e produtividade do ƴ-PGA, sendo produzidos 23.5 g L-1 do biopolímero em 24 horas de cultivo, uma produtividade aproximadamente 40 % superior às obtidas por outros autores utilizando o mesmo microrganismo. / Poly-ƴ-glutamicacid (ƴ-PGA) is an anionic, biodegradable, non-toxic and edible homopolyamide, synthesized by bacteria of the genus Bacillus, being used in food, cosmetics, medicine and waste water treatment. The aim of this study is to characterize and indentify potencial applicatiions for the ƴ-PGA obtained by submerged cultivation of Bacillus subtilis BL53, conducted under optimized conditions in previous studies. We also evaluated the effect of different inoculants and addition of precursors in the metabolic pathway of production of the biopolymer. The best condition obtained yet been tested in bioreactors with addition of polydimethylsiloxane (PDMS) as a carrier of oxygen in order to further increase the productivity of biopolymer. The average molecular weight (Mw) obtained by static light scattering, on the order of 106 g mol-1, showed no significant differences for biopolymer obtained after 48 and 96 h of cultivation. Analyses conducted in rotational viscometer indicated that biopolymers after 48 and 96 h have a Newtonian behavior, and the 96 hours had higher absolute viscosity. The thermal analysis (differential scanning calorimetry and thermo gravimetric analysis) indicated the melting temperature (Tm) as 134 ºC and 128 ºC and degradation temperature range (Td) of 120 ºC - 190 ºC and 120 ºC - 215 ºC, after 48 and 96 hours respectively. It was found that the best inoculum medium for biopolymer production was the LB broth. The addition of the precursors L-glutamine and -ketoglutaric acid increased in 20% the ƴ-PGA production. The addition of 10% of PDMS in bioreactors cultures increased the mass transfer volumetric coefficient (KLa) and the production and productivity of ƴ-PGA, being produced 23.5 g l-1 of the biopolymer in 24 hours of cultivation, a productivity about 40 % higher than those obtained by other authors using the same microorganism.

A correta classificação do tipo de DM leva mais precocemente ao tratamento adequado e atualmente é dividida em 4 categorias: DM tipo 1, DM tipo 2, Outros tipos e Diabete Gestacional. O DM tipo 1 é geralmente auto-imune, surge em geral antes dos 20 anos de idade e é dependente de insulina para impedir a cetoacidose. O DM tipo 2 é responsável por mais de 90% dos casos, acontece em geral após os 45 anos, com história familiar e associado à síndrome metabólica. Na categoria “outros tipos”, o Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY) é um subtipo que inicia abaixo dos 25 anos, não-dependente de insulina e apresenta herança dominante. No entanto, apesar da classificação definir essas categorias através de características peculiares, pode existir uma sobreposição de quadros, principalmente no DM que inicia no adulto jovem. Assim, novos sistemas de classificação têm sido propostos, empregando a presença da auto-imunidade (anticorpos) e índices de função de célula β (peptídeo-C) para definir a patogênese e nomenclatura mais específicas. O objetivo desta revisão é descrever e analisar o desempenho destas ferramentas diagnósticas na classificação do DM. Os anticorpos evidenciam a auto-imunidade do DM 1. O IAA (insulin auto-antibody) está presente quando o início do DM se dá, principalmente, antes dos 5 anos de idade e o anti- GAD (glutamic acid decarboxylase) tem seu melhor desempenho nos indivíduos com início da doença acima dos 20 anos, sendo o teste que permanece positivo por mais tempo. A medida do peptídeo-C avalia a reserva pancreática de insulina e deve ser realizada com glicemia entre 70-200 mg/dl. A medida após estímulo é a mais estudada e <1,5 ng/ml define o paciente como DM 1. O estímulo com refeição mista é o recomendado pela ADA, mas o teste com 1 mg de glucagon é mais simples e igualmente acurado. Dados em relação à utilização da classificação baseada na medida de diferentes anticorpos dirigidos ao pâncreas classificação A (anticorpos) e β (peptídeo-C) pode ser adotada como um método acurado, relativamente simples e preciso de classificação de DM. / The correct classification of DM type leads to earlier appropriate treatment and is currently divided into 4 categories: type 1 DM, type 2 DM, Other types and Gestational DM. Type 1 DM is generally autoimmune, it usually appears before the age of 20 years, and depends on insulin to prevent ketoacidosis. Type 2 DM accounts for over 90% of the cases, it usually occurs after the age of 45, with a family history and metabolic syndrome. In the category “other types”, Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY) is a subtype that begins before the age of 25, is non-insulin dependent and presents a dominant heritage. However, although the classification defines these categories through peculiar characteristics, there may be superimposed pictures, especially in the case of DM which begins in the young adult. Thus, new classification systems have been proposed, using the presence of autoimmunity (antibodies) and β cell (C-peptide) indexes to define the pathogenesis and more specific nomenclatures. The purpose of this review is to describe and analyze the performance of these diagnostic tools in the classification of DM. The presence of antibodies show the autoimmunity of type 1 DM. IAA (insulin auto-antibody) is present mainly before the age of 5 years, and anti-GAD (glutamic acid decarboxylase) performs best in individuals who begin the disease above the age of 20, and its test remains positive longest. The C-peptide measure evaluates the pancreatic reserve of insulin and should be performed with a glycemia between 70-200 mg/dl. Post-stimulus measuring is more widely studied and <1.5 ng/ml defines the patient as DM1. Stimulation with a mixed meal is recommended by ADA, but the test with 1 mg of glucagon is simpler and just as effective. Data on classification A (antibodies), β (Cpeptide) suggest that it may be adopted as an effective, relatively simple and precise method for DM classification.

O ácido y-poliglutâmico (y-PGA) é um biopolímero solúvel em água, aniônico, atóxico, biodegradável e biocompatível, produzido por Bacillus e que possui aplicações nas áreas química, médica, ambiental e de alimentos. Este trabalho tem como objetivo estudar o processo de produção do y-PGA a partir do cultivo de uma nova linhagem de Bacillus isolada de ambiente amazônico, o Bacillus subtilis BL53. Este estudo inclui a seleção de culturas, a otimização de condições de cultivo e a prospecção de substratos de produção alternativos. A habilidade de produção de y-PGA por linhagens de Bacillus isoladas na região amazônica foi investigada. A linhagem BL53 foi a linhagem selecionada, sendo identificada como Bacillus subtilis, através da análise da seqüência do gene 16S DNAr e de suas características bioquímicas. A avaliação das condições de cultivo submerso foi conduzida em agitador orbital mediante delineamento composto central rotacional (DCCR) que apontou como ponto ótimo de produção de y-PGA, a temperatura de 37 oC, o pH inicial de 6,9 e a concentração de 1,22 mM de Zn2+ suplementada ao Caldo E. Nas condições otimizadas, a produção de y-PGA foi igual a 10,4 g/L, cerca de três vezes maior que a obtida em condições convencionais de cultivo em Caldo E, utilizando a mesma linhagem. A influência da disponibilidade de oxigênio sobre a produção de y-PGA por B. subtilis BL53 foi avaliada em biorreator agitado de 5 L, com o emprego das velocidades de agitação de 500, 750 e 1000 rpm, sendo mantida fixa a taxa de aeração de 2 vvm. A produção de y-PGA mostrou-se altamente dependente da transferência de oxigênio, sendo que o teor de oxigênio dissolvido decaiu rapidamente nas primeiras 15 horas de cultivo, como resultado da elevada demanda de oxigênio pelas bactérias. O aumento na velocidade de agitação no biorreator possibilitou uma maior transferência de oxigênio e induziu o aumento na taxa de consumo de oxigênio pelas bactérias, conduzindo a maior produção e maior produtividade de y-PGA. A intensificação da agitação também influenciou os parâmetros cinéticos de crescimento do Bacillus subtilis BL53, provocando um aumento na velocidade específica de crescimento na fase logarítmica (max) sem provocar a perda da viabilidade celular. Com a utilização da velocidade de agitação de 1000 rpm em biorreator, o tempo de cultivo pode ser reduzido para menos de 48 h, cerca de 50% do tempo necessário para operação a 500 rpm. A investigação de substratos alternativos para produção de y-PGA mostrou o glicerol residual de biodiesel e o resíduo fibroso de soja como substratos promissores, apontando para a possibilidade de investigação em trabalhos futuros. / The poly-gamma-glutamic acid (y-PGA) is a water-soluble biopolymer, anionic, non toxic, biodegradable and biocompatible, it is produced by Bacillus and it has applications in chemical, medical, environmental and food industries. This work aims to study the process of production of y-PGA through cultivation of a new strain of Bacillus isolated from the Amazonian environment, Bacillus subtilis BL53. This study includes the screening of strains, the optimization of culture conditions and the investigation of alternative substrates. The ability of y-PGA production by Bacillus strains isolated from Amazonian environment was investigated. The BL53 strain was selected and identified as Bacillus subtilis, through analysis of 16S rDNA gene sequence and its biochemical characteristics. Evaluation of culture conditions in submerged cultivation was conducted in shaker using central composite design (CCD), which showed the temperature of 37 oC, the initial pH 6.9 and concentration of 1.22 mM Zn2+ in Medium E as the optimal conditions to y-PGA production. Under optimized conditions, the production of y-PGA was 10.4 g/L, about threefold what was obtained using this strain under conventional cultivation in Medium E. The influence of oxygen availability on the production of y-PGA by B. subitlis BL53 was evaluated in a 5 l stirred bioreactor with the use of stirring rates of 500, 750 and 1000 rpm, using a fixed aeration rate of 2 vvm. Production of y-PGA was highly dependent on oxygen transfer, and the dissolved oxygen content decreased rapidly in the first 15 hours of culture as a result of high oxygen demand by bacteria. The increase in stirring rate in the bioreactor allowed a better oxygen transfer and induced a rise in the oxygen uptake rate by bacteria, leading to higher production and higher productivity of y-PGA. The intensification of the stirring also influenced the kinetics growth parameters of Bacillus subtilis BL53, producing an increase in specific growth rate in the logarithmic phase (max) without causing reduction of cell viability. Using the stirring rate of 1000 rpm in a bioreactor, the cultivation time can be reduced to less than 48 h, about 50% of the time required for operation at 500 rpm. The investigation of alternative substrates for the production of y-PGA showed crude glycerol from biodiesel and soybean industrial fibrous residue as promising ones, pointing to research possibilities in future work.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:55:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1014060 bytes, checksum: 693b9366b22260dacb3100b244427c53 (MD5) Previous issue date: 2014-02-17 / Four experiments were conducted to evaluate the effect of the use of four levels of L-glutamine (Gln) and four levels of Glutamic acid + L-glutamine in the diet of piglets after weaning, two performance tests and two tests of intestinal morphohistology. In each test diets were formulated based on corn, soybean meal, cooked corn, dairy products, blood plasma and industrial amino acids. In the performance trial (trial 1) forty-four (44) piglets were distributed in four treatments (T1 - 0.0%; T2 - 0.4%; T3 - 0.8% and T4 - 1.2% of Gln) on five replications, on 4 repetitions with 2 animals per experimental unit and one repetition with 3 animals per experimental unit. The experimental period was of 28 days, with the first period 18-32 days of life, the second instead of 32-46 days of life and overall period 18-46 days. The evaluated parameters were average daily feed intake (ADFI), average daily weight gain (ADG) and feed conversion (F:G). The addition of Gln in the diet did not affect (P> 0.05) performance parameters in periods. In the testing of morphohistology (trial 2) twenty-four (24) piglets of 18 days old were divided into four treatments (T1 - 0.0%, T2 - 0.4%, T3 - 0.8% and T4- 1, 2% of Gln) with six replicates and one animal per experimental unit. The animals were slaughtered at 7 days after weaning (25 days old) to collect samples of the three intestinal portions. The histologic evaluated parameters were villus height, crypt depth and villus height: crypt depth ratio of three segments. The addition of Gln in feed promoted linear and linear-quadratic reduction (P <0.05) in the villus height and crypt depth of the duodenum of piglets respectively. It is concluded that the addition of Gln in diets of piglets after weaning showed no beneficial effects on performance and in maintaining the integrity of the intestinal mucosa of piglets. In the performance test (Test 3) forty-four (44) piglets were distributed among four treatments (T1- 0.0%; T2 - 0.4%; T3-0.8% and T4 - 1.2% of Glutamic acid + Gln) on five replications, on 4 repetitions on 2 animals per experimental unit and one repetition with 3 animals per experimental unit. The experimental period was of 28 days, with the first period 18-32 days of life, the second instead of 32-46 days of life and total period 18-46 days. The evaluated parameters were daily feed intake (ADFI), daily weight gain (ADG) and feed conversion (F:G). Addition of Glutamic Acid + Gln in diets of piglets after weaning improved linearly (P <0.05) ADFI, ADG and F:G in the period 18-32 days of age, however significant effects were not observed (P> 0 , 05) the second instead of 32- 46 days old, since the total period showed a linear improvement (P <0.05) in the ADFI and F:G, and linear-quadratic improvement in ADG. In the testing of morphohistology (test 4) twenty-four (24) piglets of 18 days of age were divided into four treatments (T1 - 0.0%, T2 - 0.4%, T3 0,8% and T4-1 2% of glutamic Acid + Gln) with six replicates and one animal per experimental unit. The animals were slaughtered 7 days after weaning (25 days old) to collect samples of the three intestinal portions. The histologic parameters evaluated were villus height, crypt depth and villus height: crypt depth ratio of three segments. The addition of Glutamic Acid + Gln in the diet of piglets after weaning showed a linear effect (P <0.05) for the parameters of villus height and villus height: crypt depth ratio of duodenal villus height: crypt depth ratio of jejunum, villus height and villus height: crypt depth ratio of the ileum. As for the crypt depth duodenal parameter observed linear-quadratic effect. It is concluded that the addition of Glutamic Acid + Gln in diets of piglets after weaning showed beneficial effects on performance and in maintaining the integrity of the intestinal mucosa of piglets. / Quatro ensaios foram conduzidos para avaliar o efeito da utilização de quatro niveis de L-Glutamina (Gln) e quatro niveis de Ácido Glutâmico + L-Glutamina em dietas para leitões após o desmame, sendo dois ensaios de desempenho e dois ensaios de morfohistologia intestinal. Em cada ensaio as dietas formuladas foram baseadas em milho, farelo de soja, milho cozido, subprodutos lácteos, plasma sanguíneo e aminoácidos industriais. No ensaio de desempenho (ensaio 1) foram utilizados quarenta e quatro (44) leitões distribuidos em quatro tratamentos (T1 0,0%; T2 0,4%; T3- 0,8% e T4- 1,2 % de Gln) com cinco repetições, sendo 4 repetições com 2 animais por unidade experimental e 1 repetição com 3 animais por unidade experimental. O período experimental foi de 28 dias, sendo o período 1 de 18 a 32 dias de vida, período 2 de 32 a 46 dias de vida e no período geral de 18 a 46 dias de vida. Os parametros avaliados foram: consumo de ração diário (CRD), ganho de peso diário (GPD) e conversão alimentar (CA). A adição de Gln na ração não influenciou (P>0,05) os parâmetros de desepenho nos períodos. No ensaio de morfohistologia (ensaio 2) vinte e quatro (24) leitões de 18 dias de vida foram distribuidos em quatro tratamentos (T1 0,0%; T2 0,4%; T3- 0,8% e T4- 1,2 % de Gln) com seis repetições e um animal por cada unidade experimental. Os animais foram abatidos aos 7 dias após o desmame (25 dias de vida) para coleita de amostras das três porções intestinais. Os parâmetros histologicos avaliados foram altura de vilosidade, profundidade de cripta e relação altura de vilosidade:profundidade de cripta dos três segmentos intestinais. A adição de Gln na ração promoveu redução linear e linear-quadratico (P<0,05) na altura das vilosidades e profundidade das criptas do duodeno dos leitões respectivamente. Conclui-se que a adicão de Gln nas rações de leitões após o desmama não apresentou efeitos benéficos sobre o desempenho e na manutenção da integridade da mucosa intestinal dos leitões. No ensaio de desempenho (ensaio 3) foram utilizados quarenta e quatro (44) leitões distribuidos entre quatro tratamentos (T1 0,0%; T2 0,4%; T3- 0,8% e T4- 1,2 % de Ácido Glutâmico + Gln) com cinco repetições, sendo 4 repetições com 2 animais por unidade experimental e 1 repetição com 3 animais por unidade experimental. O período experimental foi de 28 dias, sendo o periodo 1 de 18 a 32 dias de vida, periodo 2 de 32 a 46 dias de vida e no período total de 18 a 46 dias de vida. Os parametros avaliados foram consumo de ração diário (CRD), ganho de peso diario (GPD) e conversão alimentar (CA). A adicão de Ácido Glutâmico + Gln nas dietas de leitões após o desmama melhorou de forma linear (P<0,05) CRD, GPD e CA no período de 18 a 32 dias de idade, entretanto não foram verificados efeitos significativos (P>0,05) no período 2 de 32 a 46 dias de idade, já no periodo total houve melhoría linear (P<0,05) no CRD e CA, e melhoria linear-quadratica no GPD. No ensaio de morfohistologia (ensaio 4) vinte e quatro (24) leitões de 18 dias de vida foram distribuidos em quatro tratamentos (T1 0,0%; T2 0,4%; T3- 0,8% e T4- 1,2 % de Ácido Glutâmico + Gln) com seis repetições e um animal por cada unidade experimental. Os animais foram abatidos aos 7 dias após o desmame (25 dias de vida) para coleta de amostras das três porções intestinais. Os parâmetros histologicos avaliados foram altura de vilosidade, profundidade de cripta e relação altura de vilosidade:profundidade de cripta dos três segmentos intestinais. A adição de Ácido Glutâmico + Gln nas dietas de leitões após o desmame apresentou efeito linear (P<0,05) para os parâmetros de altura de vilosidade e relação altura de vilosidade:profundidade de cripta do duodeno, relação altura de vilosidade:profundidade de cripta do jejuno, altura de vilosidade e relação altura de vilosidade:profundidade de cripta do íleo. Já para o parâmetro profundidade de cripta do duodeno observou-se efeito linear-quadratico. Conclui-se que a adicão de Ácido Glutâmico + Gln nas dietas de leitões após o desmama apresentou efeitos beneficos sobre o desempenho e na manutenção da integridade da mucosa intestinal dos leitões.

O ácido y-poliglutâmico (y-PGA) é um biopolímero solúvel em água, aniônico, atóxico, biodegradável e biocompatível, produzido por Bacillus e que possui aplicações nas áreas química, médica, ambiental e de alimentos. Este trabalho tem como objetivo estudar o processo de produção do y-PGA a partir do cultivo de uma nova linhagem de Bacillus isolada de ambiente amazônico, o Bacillus subtilis BL53. Este estudo inclui a seleção de culturas, a otimização de condições de cultivo e a prospecção de substratos de produção alternativos. A habilidade de produção de y-PGA por linhagens de Bacillus isoladas na região amazônica foi investigada. A linhagem BL53 foi a linhagem selecionada, sendo identificada como Bacillus subtilis, através da análise da seqüência do gene 16S DNAr e de suas características bioquímicas. A avaliação das condições de cultivo submerso foi conduzida em agitador orbital mediante delineamento composto central rotacional (DCCR) que apontou como ponto ótimo de produção de y-PGA, a temperatura de 37 oC, o pH inicial de 6,9 e a concentração de 1,22 mM de Zn2+ suplementada ao Caldo E. Nas condições otimizadas, a produção de y-PGA foi igual a 10,4 g/L, cerca de três vezes maior que a obtida em condições convencionais de cultivo em Caldo E, utilizando a mesma linhagem. A influência da disponibilidade de oxigênio sobre a produção de y-PGA por B. subtilis BL53 foi avaliada em biorreator agitado de 5 L, com o emprego das velocidades de agitação de 500, 750 e 1000 rpm, sendo mantida fixa a taxa de aeração de 2 vvm. A produção de y-PGA mostrou-se altamente dependente da transferência de oxigênio, sendo que o teor de oxigênio dissolvido decaiu rapidamente nas primeiras 15 horas de cultivo, como resultado da elevada demanda de oxigênio pelas bactérias. O aumento na velocidade de agitação no biorreator possibilitou uma maior transferência de oxigênio e induziu o aumento na taxa de consumo de oxigênio pelas bactérias, conduzindo a maior produção e maior produtividade de y-PGA. A intensificação da agitação também influenciou os parâmetros cinéticos de crescimento do Bacillus subtilis BL53, provocando um aumento na velocidade específica de crescimento na fase logarítmica (max) sem provocar a perda da viabilidade celular. Com a utilização da velocidade de agitação de 1000 rpm em biorreator, o tempo de cultivo pode ser reduzido para menos de 48 h, cerca de 50% do tempo necessário para operação a 500 rpm. A investigação de substratos alternativos para produção de y-PGA mostrou o glicerol residual de biodiesel e o resíduo fibroso de soja como substratos promissores, apontando para a possibilidade de investigação em trabalhos futuros. / The poly-gamma-glutamic acid (y-PGA) is a water-soluble biopolymer, anionic, non toxic, biodegradable and biocompatible, it is produced by Bacillus and it has applications in chemical, medical, environmental and food industries. This work aims to study the process of production of y-PGA through cultivation of a new strain of Bacillus isolated from the Amazonian environment, Bacillus subtilis BL53. This study includes the screening of strains, the optimization of culture conditions and the investigation of alternative substrates. The ability of y-PGA production by Bacillus strains isolated from Amazonian environment was investigated. The BL53 strain was selected and identified as Bacillus subtilis, through analysis of 16S rDNA gene sequence and its biochemical characteristics. Evaluation of culture conditions in submerged cultivation was conducted in shaker using central composite design (CCD), which showed the temperature of 37 oC, the initial pH 6.9 and concentration of 1.22 mM Zn2+ in Medium E as the optimal conditions to y-PGA production. Under optimized conditions, the production of y-PGA was 10.4 g/L, about threefold what was obtained using this strain under conventional cultivation in Medium E. The influence of oxygen availability on the production of y-PGA by B. subitlis BL53 was evaluated in a 5 l stirred bioreactor with the use of stirring rates of 500, 750 and 1000 rpm, using a fixed aeration rate of 2 vvm. Production of y-PGA was highly dependent on oxygen transfer, and the dissolved oxygen content decreased rapidly in the first 15 hours of culture as a result of high oxygen demand by bacteria. The increase in stirring rate in the bioreactor allowed a better oxygen transfer and induced a rise in the oxygen uptake rate by bacteria, leading to higher production and higher productivity of y-PGA. The intensification of the stirring also influenced the kinetics growth parameters of Bacillus subtilis BL53, producing an increase in specific growth rate in the logarithmic phase (max) without causing reduction of cell viability. Using the stirring rate of 1000 rpm in a bioreactor, the cultivation time can be reduced to less than 48 h, about 50% of the time required for operation at 500 rpm. The investigation of alternative substrates for the production of y-PGA showed crude glycerol from biodiesel and soybean industrial fibrous residue as promising ones, pointing to research possibilities in future work.