O proteassomo é o componente do sistema Ubiquitina-Proteassomo (UPS), responsável pela degradação de proteínas intracelulares marcadas com cauda de ubiquitina. No entanto, a unidade catalítica do proteassomo (20SPT), destituída de unidades regulatórias, é capaz de degradar proteínas de maneira ubiquitina-independente. Diversas modificações pós-traducionais já foram descritas para o 20SPT, incluindo a S-glutatiolação. De acordo com Demasi e col., (2003) o 20SPT da levedura Saccharomyces cerevisiae possui a atividade tipo-quimiotripsina modulada por glutationa e o mecanismo de glutatiolação implica na formação do intermediário ácido sulfênico. No presente trabalho, identificamos por espectrometria de massas (MS/MS) um total de sete resíduos diferentes de cisteína glutatiolados no 20SPT, sendo seis in vitro por incubação com GSH e três in vivo, extraído de células crescidas até atingir fase estacionária tardia em meio rico. Analisando a estrutura 3D do 20SPT, observou-se que os resíduos de cisteína glutatiolados não estão localizados na entrada da câmara catalítica nem próximos aos sítios-ativos, indicando um mecanismo alostérico da modulação da atividade proteassomal. O proteassomo glutatiolado extraído de leveduras é capaz de degradar proteínas oxidadas de maneira mais eficiente que o proteassomo reduzido por DTT, e ainda, esta degradação gera perfis peptídicos diferenciados por utilizar distintamente as atividades sítio-especificas, como visualizado por análises de HPLC e MS/MS. Por microscopia eletrônica verificamos a conformação aberta da câmara catalítica do proteassomo glutatiolado, sendo esta imediatamente fechada pela remoção da glutationa do 20SPT na presença de DTT. Caracterizamos ainda, enzimas reponsáveis pela desglutatiolação do 20SPT, capazes de recuperar as atividades proteassomais que haviam sido diminuídas pela glutatiolação: as oxidoredutases glutarredoxina 2 e as tiorredoxinas citosólicas. O mecanismo ainda inclui a hidrólise dessas oxidorredutases, fenômeno também verificado para diversas proteínas da suprafamília tiorredoxina, provavelmente devido a propriedades estruturais desta família. A glutatiolação do proteassomo apresenta-se como uma nova modificação pós-traducional de ocorrência fisiológica dependente do estado redox celular. Esta modificação promove aumento da atividade proteolítica, sugerindo uma função antioxidante atuante na remoção de proteínas oxidadas durante desafios oxidativos / The proteasome is the protease of the Ubiquitin-Proteasome System (UPS) responsible for the breakdown of intracellular ubiquitin-tagged proteins. However, the catalytic particle of the proteasome (20SPT) is capable of hydrolyzing some substrates in an ubiquitin-independent fashion. The S-glutathiolation of the 20SPT was described among several post-translational modifications and according to Demasi et. al. (2003), the chymotrypsin-like activity of proteasome from yeast Saccharomyces cerevisiae is regulated by glutathione. The mechanism of S-glutathiolation is dependent on the formation of the sulfenic acid intermediate in the cisteine residues of the 20SPT. In this present work, we identified in vitro and in vivo, a total of seven different S-glutathiolated proteasomal cysteine residues by mass spectrometry studies (MS/MS) and, by analyzing the 3D structure of the 20SPT, the modified cysteine residues are not located either on the entrance of the catalytic core or near to the active sites, indicating an allosteric mechanism of proteasomal modulation. During protein degradation, the natively S-glutathiolated 20SPT produces different patterns of peptide products when compared to the DTT-reduced particle through distinct site-specific cleavage of the protein substrates, as herein demonstrated by HPLC and MS/MS analyses. Furthermore, by electron microscopy, we showed that the entrance of the natively glutathiolated 20SPT is in the open conformation that immediately shifts to the closed conformation in the presence of DTT. We have also characterized the deglutathiolase role of the oxidoreductases Glutaredoxin 2 and Citosolic Thioredoxins 1 and 2 which recover the partially inhibited 20SPT activities. The deglutathiolation mechanism also includes the oxidoreductase degradation dependent on the 20SPT activation. The proteasome Sglutathiolation emerges as a new physiological post-translational modification correlated to the cellular redox state. Moreover, the S-glutathiolation of the 20SPT increases its proteolytic activity suggesting an antioxidant role by removing oxidized proteins generated during oxidative challenges.

O proteassomo é o componente do sistema Ubiquitina-Proteassomo (UPS), responsável pela degradação de proteínas intracelulares marcadas com cauda de ubiquitina. No entanto, a unidade catalítica do proteassomo (20SPT), destituída de unidades regulatórias, é capaz de degradar proteínas de maneira ubiquitina-independente. Diversas modificações pós-traducionais já foram descritas para o 20SPT, incluindo a S-glutatiolação. De acordo com Demasi e col., (2003) o 20SPT da levedura Saccharomyces cerevisiae possui a atividade tipo-quimiotripsina modulada por glutationa e o mecanismo de glutatiolação implica na formação do intermediário ácido sulfênico. No presente trabalho, identificamos por espectrometria de massas (MS/MS) um total de sete resíduos diferentes de cisteína glutatiolados no 20SPT, sendo seis in vitro por incubação com GSH e três in vivo, extraído de células crescidas até atingir fase estacionária tardia em meio rico. Analisando a estrutura 3D do 20SPT, observou-se que os resíduos de cisteína glutatiolados não estão localizados na entrada da câmara catalítica nem próximos aos sítios-ativos, indicando um mecanismo alostérico da modulação da atividade proteassomal. O proteassomo glutatiolado extraído de leveduras é capaz de degradar proteínas oxidadas de maneira mais eficiente que o proteassomo reduzido por DTT, e ainda, esta degradação gera perfis peptídicos diferenciados por utilizar distintamente as atividades sítio-especificas, como visualizado por análises de HPLC e MS/MS. Por microscopia eletrônica verificamos a conformação aberta da câmara catalítica do proteassomo glutatiolado, sendo esta imediatamente fechada pela remoção da glutationa do 20SPT na presença de DTT. Caracterizamos ainda, enzimas reponsáveis pela desglutatiolação do 20SPT, capazes de recuperar as atividades proteassomais que haviam sido diminuídas pela glutatiolação: as oxidoredutases glutarredoxina 2 e as tiorredoxinas citosólicas. O mecanismo ainda inclui a hidrólise dessas oxidorredutases, fenômeno também verificado para diversas proteínas da suprafamília tiorredoxina, provavelmente devido a propriedades estruturais desta família. A glutatiolação do proteassomo apresenta-se como uma nova modificação pós-traducional de ocorrência fisiológica dependente do estado redox celular. Esta modificação promove aumento da atividade proteolítica, sugerindo uma função antioxidante atuante na remoção de proteínas oxidadas durante desafios oxidativos / The proteasome is the protease of the Ubiquitin-Proteasome System (UPS) responsible for the breakdown of intracellular ubiquitin-tagged proteins. However, the catalytic particle of the proteasome (20SPT) is capable of hydrolyzing some substrates in an ubiquitin-independent fashion. The S-glutathiolation of the 20SPT was described among several post-translational modifications and according to Demasi et. al. (2003), the chymotrypsin-like activity of proteasome from yeast Saccharomyces cerevisiae is regulated by glutathione. The mechanism of S-glutathiolation is dependent on the formation of the sulfenic acid intermediate in the cisteine residues of the 20SPT. In this present work, we identified in vitro and in vivo, a total of seven different S-glutathiolated proteasomal cysteine residues by mass spectrometry studies (MS/MS) and, by analyzing the 3D structure of the 20SPT, the modified cysteine residues are not located either on the entrance of the catalytic core or near to the active sites, indicating an allosteric mechanism of proteasomal modulation. During protein degradation, the natively S-glutathiolated 20SPT produces different patterns of peptide products when compared to the DTT-reduced particle through distinct site-specific cleavage of the protein substrates, as herein demonstrated by HPLC and MS/MS analyses. Furthermore, by electron microscopy, we showed that the entrance of the natively glutathiolated 20SPT is in the open conformation that immediately shifts to the closed conformation in the presence of DTT. We have also characterized the deglutathiolase role of the oxidoreductases Glutaredoxin 2 and Citosolic Thioredoxins 1 and 2 which recover the partially inhibited 20SPT activities. The deglutathiolation mechanism also includes the oxidoreductase degradation dependent on the 20SPT activation. The proteasome Sglutathiolation emerges as a new physiological post-translational modification correlated to the cellular redox state. Moreover, the S-glutathiolation of the 20SPT increases its proteolytic activity suggesting an antioxidant role by removing oxidized proteins generated during oxidative challenges.

O proteassomo é um complexo proteico responsável pela degradação de proteínas poli-ubiquitinadas. É constituído por uma unidade catalítica denominada de proteassomo 20S (20SPT) e por unidades regulatórias (19S) acopladas em uma ou ambas as extremidades para formar o proteassomo 26S. O 20SPT é capaz de degradar proteínas por um processo independente de ATP e ubiquitina. Este mecanismo é considerado preventivo de agregação proteica, uma vez que o acúmulo de proteínas oxidadas está diretamente associado ao envelhecimento e doenças neurodegenerativas. Foi observado pelo grupo que o 20SPT da levedura S.cerevisiae sofre S-glutatiolação nos resíduos de Cys 76 e Cys 221 da subunidade 5. Dados obtidos por microscopia eletrônica de transmissão mostraram que a S-glutatiolação promove a abertura da câmara catalítica e consequentemente o aumento da degradação de proteínas. Recentemente, foram obtidas linhagens com mutações sítio-específicas pela substituição dos dois resíduos de Cys glutatioláveis pela Ser. Ensaios realizados com a linhagem C221 mostraram um aumento da longevidade e resistência ao estresse oxidativo quando comparada com a linhagem selvagem, enquanto que a linhagem C76 mostrou uma dificuldade no crescimento. Foi verificado também que a população de proteassomo isolada da linhagem C221 apresenta maior proporção da forma aberta da câmara catalítica. Resultados opostos foram observados na linhagem C76S. No entanto, constatamos um aumento de proteínas oxidadas e de agregados proteicos na linhagem C221 em comparação a selvagem. Esses dados não condizem com o aumento do tempo de vida cronológico desta linhagem, porém acreditamos que esses agregados estejam relacionados a um tipo de sequestro de proteínas potencialmente prejudiciais, como será discutido neste trabalho. / The proteasome is a protein complex responsible for the degradation of poly-ubiquitinated proteins. It comprises a catalytic unit called 20S proteasome (20SPT) and regulatory units (19S) coupled at one or both ends to form the 26S proteasome. The 20SPT is able to degrade proteins by an ATP and ubiquitin independent process. This mechanism is considered preventive of protein aggregation, since the accumulation of oxidized proteins is directly related to aging and neurodegenerative diseases. It was observed by our group that the yeast 20SPT (S. cerevisiae) is modified by S-glutathiolation in the residues Cys 76 and Cys 221 of the 5 subunit. Data obtained by transmission electron microscopy showed that the S-glutathiolation promotes the opening of the catalytic chamber and consequently increased degradation of oxidized proteins. Recently, strains were obtained by site-specific mutations by replacing the two glutathiolable Cys residues by Ser. Tests performed with the C221 strain showed an increased longevity and resistance to oxidative stress when compared to the wild type strain, whereas the C76 strain showed a slower growth. It was also found that the isolated population of the 5-C221S proteasome presents the highest frequency of open catalytic chamber conformation. Opposite results were observed in the C76S lineage. However, we noted an increased pool of oxidized proteins and protein aggregates in the C221 strain compared to the wild type. These data do not match with the increase of chronological life span observed in this lineage, but we believe that these aggregates are related to a kind of \"sequestration\" of potentially damaging proteins, as will be discussed in this work.

O proteassomo é um complexo proteico responsável pela degradação de proteínas poli-ubiquitinadas. É constituído por uma unidade catalítica denominada de proteassomo 20S (20SPT) e por unidades regulatórias (19S) acopladas em uma ou ambas as extremidades para formar o proteassomo 26S. O 20SPT é capaz de degradar proteínas por um processo independente de ATP e ubiquitina. Este mecanismo é considerado preventivo de agregação proteica, uma vez que o acúmulo de proteínas oxidadas está diretamente associado ao envelhecimento e doenças neurodegenerativas. Foi observado pelo grupo que o 20SPT da levedura S.cerevisiae sofre S-glutatiolação nos resíduos de Cys 76 e Cys 221 da subunidade 5. Dados obtidos por microscopia eletrônica de transmissão mostraram que a S-glutatiolação promove a abertura da câmara catalítica e consequentemente o aumento da degradação de proteínas. Recentemente, foram obtidas linhagens com mutações sítio-específicas pela substituição dos dois resíduos de Cys glutatioláveis pela Ser. Ensaios realizados com a linhagem C221 mostraram um aumento da longevidade e resistência ao estresse oxidativo quando comparada com a linhagem selvagem, enquanto que a linhagem C76 mostrou uma dificuldade no crescimento. Foi verificado também que a população de proteassomo isolada da linhagem C221 apresenta maior proporção da forma aberta da câmara catalítica. Resultados opostos foram observados na linhagem C76S. No entanto, constatamos um aumento de proteínas oxidadas e de agregados proteicos na linhagem C221 em comparação a selvagem. Esses dados não condizem com o aumento do tempo de vida cronológico desta linhagem, porém acreditamos que esses agregados estejam relacionados a um tipo de sequestro de proteínas potencialmente prejudiciais, como será discutido neste trabalho. / The proteasome is a protein complex responsible for the degradation of poly-ubiquitinated proteins. It comprises a catalytic unit called 20S proteasome (20SPT) and regulatory units (19S) coupled at one or both ends to form the 26S proteasome. The 20SPT is able to degrade proteins by an ATP and ubiquitin independent process. This mechanism is considered preventive of protein aggregation, since the accumulation of oxidized proteins is directly related to aging and neurodegenerative diseases. It was observed by our group that the yeast 20SPT (S. cerevisiae) is modified by S-glutathiolation in the residues Cys 76 and Cys 221 of the 5 subunit. Data obtained by transmission electron microscopy showed that the S-glutathiolation promotes the opening of the catalytic chamber and consequently increased degradation of oxidized proteins. Recently, strains were obtained by site-specific mutations by replacing the two glutathiolable Cys residues by Ser. Tests performed with the C221 strain showed an increased longevity and resistance to oxidative stress when compared to the wild type strain, whereas the C76 strain showed a slower growth. It was also found that the isolated population of the 5-C221S proteasome presents the highest frequency of open catalytic chamber conformation. Opposite results were observed in the C76S lineage. However, we noted an increased pool of oxidized proteins and protein aggregates in the C221 strain compared to the wild type. These data do not match with the increase of chronological life span observed in this lineage, but we believe that these aggregates are related to a kind of \"sequestration\" of potentially damaging proteins, as will be discussed in this work.