O proteassomo é o componente do sistema Ubiquitina-Proteassomo (UPS), responsável pela degradação de proteínas intracelulares marcadas com cauda de ubiquitina. No entanto, a unidade catalítica do proteassomo (20SPT), destituída de unidades regulatórias, é capaz de degradar proteínas de maneira ubiquitina-independente. Diversas modificações pós-traducionais já foram descritas para o 20SPT, incluindo a S-glutatiolação. De acordo com Demasi e col., (2003) o 20SPT da levedura Saccharomyces cerevisiae possui a atividade tipo-quimiotripsina modulada por glutationa e o mecanismo de glutatiolação implica na formação do intermediário ácido sulfênico. No presente trabalho, identificamos por espectrometria de massas (MS/MS) um total de sete resíduos diferentes de cisteína glutatiolados no 20SPT, sendo seis in vitro por incubação com GSH e três in vivo, extraído de células crescidas até atingir fase estacionária tardia em meio rico. Analisando a estrutura 3D do 20SPT, observou-se que os resíduos de cisteína glutatiolados não estão localizados na entrada da câmara catalítica nem próximos aos sítios-ativos, indicando um mecanismo alostérico da modulação da atividade proteassomal. O proteassomo glutatiolado extraído de leveduras é capaz de degradar proteínas oxidadas de maneira mais eficiente que o proteassomo reduzido por DTT, e ainda, esta degradação gera perfis peptídicos diferenciados por utilizar distintamente as atividades sítio-especificas, como visualizado por análises de HPLC e MS/MS. Por microscopia eletrônica verificamos a conformação aberta da câmara catalítica do proteassomo glutatiolado, sendo esta imediatamente fechada pela remoção da glutationa do 20SPT na presença de DTT. Caracterizamos ainda, enzimas reponsáveis pela desglutatiolação do 20SPT, capazes de recuperar as atividades proteassomais que haviam sido diminuídas pela glutatiolação: as oxidoredutases glutarredoxina 2 e as tiorredoxinas citosólicas. O mecanismo ainda inclui a hidrólise dessas oxidorredutases, fenômeno também verificado para diversas proteínas da suprafamília tiorredoxina, provavelmente devido a propriedades estruturais desta família. A glutatiolação do proteassomo apresenta-se como uma nova modificação pós-traducional de ocorrência fisiológica dependente do estado redox celular. Esta modificação promove aumento da atividade proteolítica, sugerindo uma função antioxidante atuante na remoção de proteínas oxidadas durante desafios oxidativos / The proteasome is the protease of the Ubiquitin-Proteasome System (UPS) responsible for the breakdown of intracellular ubiquitin-tagged proteins. However, the catalytic particle of the proteasome (20SPT) is capable of hydrolyzing some substrates in an ubiquitin-independent fashion. The S-glutathiolation of the 20SPT was described among several post-translational modifications and according to Demasi et. al. (2003), the chymotrypsin-like activity of proteasome from yeast Saccharomyces cerevisiae is regulated by glutathione. The mechanism of S-glutathiolation is dependent on the formation of the sulfenic acid intermediate in the cisteine residues of the 20SPT. In this present work, we identified in vitro and in vivo, a total of seven different S-glutathiolated proteasomal cysteine residues by mass spectrometry studies (MS/MS) and, by analyzing the 3D structure of the 20SPT, the modified cysteine residues are not located either on the entrance of the catalytic core or near to the active sites, indicating an allosteric mechanism of proteasomal modulation. During protein degradation, the natively S-glutathiolated 20SPT produces different patterns of peptide products when compared to the DTT-reduced particle through distinct site-specific cleavage of the protein substrates, as herein demonstrated by HPLC and MS/MS analyses. Furthermore, by electron microscopy, we showed that the entrance of the natively glutathiolated 20SPT is in the open conformation that immediately shifts to the closed conformation in the presence of DTT. We have also characterized the deglutathiolase role of the oxidoreductases Glutaredoxin 2 and Citosolic Thioredoxins 1 and 2 which recover the partially inhibited 20SPT activities. The deglutathiolation mechanism also includes the oxidoreductase degradation dependent on the 20SPT activation. The proteasome Sglutathiolation emerges as a new physiological post-translational modification correlated to the cellular redox state. Moreover, the S-glutathiolation of the 20SPT increases its proteolytic activity suggesting an antioxidant role by removing oxidized proteins generated during oxidative challenges.

SILVA, Fredy Davi Albuquerque. Homeostase redox, genes associados e a resistência do feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.] ao fungo hemibiotrófico Colletotrichum gloeosporioides [(Penz) Penz & Sacc.]. 2015. 145 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-28T15:47:22Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_fdasilva.pdf: 13172308 bytes, checksum: eec041dd293481a11b32a2b64584598a (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T14:43:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_fdasilva.pdf: 13172308 bytes, checksum: eec041dd293481a11b32a2b64584598a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T14:43:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_fdasilva.pdf: 13172308 bytes, checksum: eec041dd293481a11b32a2b64584598a (MD5) Previous issue date: 2015 / Colletotrichum gloeosporioides is an important hemibiotrophic pathogen with a broad host range that causes substantial crop losses. Recent data have shown that the hypersensitive response (HR) is one event involved in the resistance of cowpea (V.unguiculata) genotype BR-3 against C.gloeosporioides (LPVD-1 isolate). Several studies have been undertaken on the defense mechanism of plant to hemibiotrophic pathogen, but overall they remain poorly understood. Previously, we have compared changes in protein expression induced in resistant cowpea genotype after infection with C.gloeosporioides using a proteomic approach. Based on these results, in the present study, we evaluated the defense responses induced by C.gloeosporioides in V.unguiculata associated with oxidative burst, accumulation of reactive oxygen species (ROS) such as superoxide anion (O2•-), hydrogen peroxide (H2O2) as well expression of antioxidant genes using RT-qPCR analysis. At the same time, we analyzed the C.gloeosporioides infection kinetics by optical microscopy (OM) and scanning electron microscopy (SEM). Increased O2•- and H2O2 was detected in cowpea 2 hours after inoculation (hai) using NBT and DAB staining, respectively. Spectrophotometric measurements showed two peaks H2O2 production, 2 and 12 hai, showing a biphasic kinetics. The increase of H2O2 was accompanied by lipid peroxidation 2 and 48 hai. OM and SEM analyzes showed that C.gloeosporioides was able to generate germ tubes and structures such as apressoria and develop under the surface of the leaves. However, despite of the development and attempt to infection, ultra-structural changes were observed on the surface of conidia and hyphae, 8 hai led to no infection of host cells. Analysis by RT-qPCR demonstrated that the genes VuFeSODI and VuCuZnSODII are up- regulated in chloroplasts at 4 hai, while the gene VuCuZnSODI was well up-regulated 12 hai. In relation to genes associated to scavenging of H2O2, VuPrxIIBCD showed a strong up-regulated of transcript at 2 hai while that VuAPXI showed up-regulated only 12 hai. VuCATI and VuCATII showed that the quantitative level of transcript expression was up- regulated 12 hai, indicating that they are important in the maintenance of H2O2 in peroxisomes. Contrarily, VuPrxIIE transcript was down-regulated in the early hours after inoculation, but showed increased expression levels at 48 hai suggesting participate in the regulation of H2O2 in chloroplasts. The present study indicates that H2O2 has an important role in the initial defense strategies of cowpea acting against C.gloeosporioides and functioning as a signaling molecule. Furthermore, genes associated with antioxidant defenses studied here seem to be involved, in combination with other molecules, in the regulation of H2O2 levels toward preventing cell death and regulating the cell redox homeostasis, important events in the resistance mechanisms of plants to pathogens. / Colletotrichum gloeosporioides é um importante patógeno hemibiotrófico com uma ampla gama de hospedeiros que causa perdas substanciais de colheitas. Dados recentes mostraram que a resposta hipersensitiva (HR) é um evento envolvido na resistência do feijão-de-corda (V.unguiculata) genótipo BR-3 contra C.gloeosporioides (isolado LPVD-1). Vários estudos têm sido realizados sobre os mecanismos de defesa de plantas a patógenos hemibiotróficos, mas em geral eles continuam a ser mal compreendidos. Anteriormente, comparamos mudanças na expressão de proteínas induzidas em genótipos resistentes de feijão-de-corda após a infecção com C. gloeosporioides utilizando uma abordagem proteômica. Com base nesses resultados, no presente estudo, avaliamos as respostas de defesa induzidas por C.gloeosporioides em V.unguiculata associadas com a explosão oxidativa, o acúmulo de espécies reativas de oxigênio (EROs), como o ânion superóxido (O2•-), e o peróxido de hidrogênio (H2O2), bem como a expressão de genes antioxidantes, utilizando análise por RT-qPCR. Ao mesmo tempo foi analisada a cinética de infecção de C.gloeosporioides por microscopia óptica (MO) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). O aumento de O2•- e H2O2 foi detectado em feijão-de-corda, 2 horas após a inoculação (hai) utilizando coloração por NBT e DAB, respectivamente. A quantificação espectrofotométrica demonstrou dois picos de produção de H2O2, 2 e 12 hai, mostrando uma cinética bifásica. O aumento de H2O2 foi acompanhado por peroxidação lipídica 2 e 48 hai. As análises de MO e MEV mostraram que C.gloeosporioides foi capaz de gerar estruturas tais como tubos germinativos e apressórios e se desenvolver sob a superfície das folhas. No entanto, apesar do desenvolvimento e tentativa de infecção, alterações ultra-estruturais foram observadas na superfície de conídios e hifas 8 hai levando a não infecção de células hospedeiras. Análise por RT-qPCR demonstrou que os genes VuFeSODI e VuCuZnSODII apresentaram aumento de expressão 4 hai, enquanto que o gene VuCuZnSODI foi bem expresso 12 hai. Em relação aos genes associados à regulação de H2O2, VuPrxIIBCD mostrou uma forte aumento de transcristos em 2 hai enquanto que, VuAPXI mostrou aumento de expressão apenas 12 hai. VuCATI e VuCATII mostram aumento de expressão quantitativa dos transcritos 12 hai, indicando que eles são associados a manutenção de H2O2 em peroxissomos. Contrariamente, a expressão dos transcritos de VuPrxIIE foi reprimida nas primeiras horas após a inoculação, contudo, apresentaram níveis aumentados de expressão em 48 hai, sugerindo participar na regulação de H2O2 nos cloroplastos. O presente estudo indica que H2O2 tem um papel importante nas estratégias de defesa iniciais de feijão-de-corda, agindo contra C.gloeosporioides e funcionando como uma molécula sinalizadora. Além disso, os genes associados com defesas antioxidantes estudados parecem estar envolvidos, em combinação com outras moléculas, na regulação dos níveis de H2O2 para prevenir a morte celular e regular a homeostase redox, eventos importantes nos mecanismos de resistência de plantas a patógenos.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:05:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6217_1.pdf: 2483193 bytes, checksum: f2860b2d4524260bff6f057c6580ff7d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Uma das alternativas para suprir o aumento pela demanda por etanol combustível é a engenharia metabólica de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae visando o aumento do rendimento em etanol. Portanto, a deleção ou superexpressão de algumas desidrogenases pode contribuir para se alcançar este objetivo. Nesse contexto, a expressão epissomal do gene que codifica para a alanina desidrogenase bacteriana em linhagem laboratorial de S. cerevisiae resultou na diminuição da produção de glicerol e de biomassa, e aumento de 9% na produção de etanol, quando cultivada anaerobicamente em quimiostato (dados não publicados). Neste trabalho, investigamos essa alteração fisiológica mediante a clonagem do gene em diferentes linhagens industriais e de laboratório, usando tanto vetores para integração cromossomal em cópia única como para a expressão epissomal em cópias múltiplas. Em cultivos descontínuos em anaerobiose, não foi possível evidenciar diferenças estatisticamente significativas entre as linhagens recombinantes e suas parentais nos rendimentos em glicerol ou etanol. A análise da variância dos resultados mostrou que nestes ensaios descontínuos a diferença mínima significativa entre os rendimentos em glicerol e em etanol das linhagens recombinantes e parentais foi da ordem de 9-10% e 10-11% respectivamente, valores superiores às diferenças de rendimento observadas anteriormente em ensaios contínuos. A fim de detectar eventuais diferenças nos rendimentos em glicerol e etanol das linhagens modificadas será necessário compará-las em cultivos contínuos em anaerobiose, condições em que a variância dos dados experimentais será menor

O proteassomo é o componente do sistema Ubiquitina-Proteassomo (UPS), responsável pela degradação de proteínas intracelulares marcadas com cauda de ubiquitina. No entanto, a unidade catalítica do proteassomo (20SPT), destituída de unidades regulatórias, é capaz de degradar proteínas de maneira ubiquitina-independente. Diversas modificações pós-traducionais já foram descritas para o 20SPT, incluindo a S-glutatiolação. De acordo com Demasi e col., (2003) o 20SPT da levedura Saccharomyces cerevisiae possui a atividade tipo-quimiotripsina modulada por glutationa e o mecanismo de glutatiolação implica na formação do intermediário ácido sulfênico. No presente trabalho, identificamos por espectrometria de massas (MS/MS) um total de sete resíduos diferentes de cisteína glutatiolados no 20SPT, sendo seis in vitro por incubação com GSH e três in vivo, extraído de células crescidas até atingir fase estacionária tardia em meio rico. Analisando a estrutura 3D do 20SPT, observou-se que os resíduos de cisteína glutatiolados não estão localizados na entrada da câmara catalítica nem próximos aos sítios-ativos, indicando um mecanismo alostérico da modulação da atividade proteassomal. O proteassomo glutatiolado extraído de leveduras é capaz de degradar proteínas oxidadas de maneira mais eficiente que o proteassomo reduzido por DTT, e ainda, esta degradação gera perfis peptídicos diferenciados por utilizar distintamente as atividades sítio-especificas, como visualizado por análises de HPLC e MS/MS. Por microscopia eletrônica verificamos a conformação aberta da câmara catalítica do proteassomo glutatiolado, sendo esta imediatamente fechada pela remoção da glutationa do 20SPT na presença de DTT. Caracterizamos ainda, enzimas reponsáveis pela desglutatiolação do 20SPT, capazes de recuperar as atividades proteassomais que haviam sido diminuídas pela glutatiolação: as oxidoredutases glutarredoxina 2 e as tiorredoxinas citosólicas. O mecanismo ainda inclui a hidrólise dessas oxidorredutases, fenômeno também verificado para diversas proteínas da suprafamília tiorredoxina, provavelmente devido a propriedades estruturais desta família. A glutatiolação do proteassomo apresenta-se como uma nova modificação pós-traducional de ocorrência fisiológica dependente do estado redox celular. Esta modificação promove aumento da atividade proteolítica, sugerindo uma função antioxidante atuante na remoção de proteínas oxidadas durante desafios oxidativos / The proteasome is the protease of the Ubiquitin-Proteasome System (UPS) responsible for the breakdown of intracellular ubiquitin-tagged proteins. However, the catalytic particle of the proteasome (20SPT) is capable of hydrolyzing some substrates in an ubiquitin-independent fashion. The S-glutathiolation of the 20SPT was described among several post-translational modifications and according to Demasi et. al. (2003), the chymotrypsin-like activity of proteasome from yeast Saccharomyces cerevisiae is regulated by glutathione. The mechanism of S-glutathiolation is dependent on the formation of the sulfenic acid intermediate in the cisteine residues of the 20SPT. In this present work, we identified in vitro and in vivo, a total of seven different S-glutathiolated proteasomal cysteine residues by mass spectrometry studies (MS/MS) and, by analyzing the 3D structure of the 20SPT, the modified cysteine residues are not located either on the entrance of the catalytic core or near to the active sites, indicating an allosteric mechanism of proteasomal modulation. During protein degradation, the natively S-glutathiolated 20SPT produces different patterns of peptide products when compared to the DTT-reduced particle through distinct site-specific cleavage of the protein substrates, as herein demonstrated by HPLC and MS/MS analyses. Furthermore, by electron microscopy, we showed that the entrance of the natively glutathiolated 20SPT is in the open conformation that immediately shifts to the closed conformation in the presence of DTT. We have also characterized the deglutathiolase role of the oxidoreductases Glutaredoxin 2 and Citosolic Thioredoxins 1 and 2 which recover the partially inhibited 20SPT activities. The deglutathiolation mechanism also includes the oxidoreductase degradation dependent on the 20SPT activation. The proteasome Sglutathiolation emerges as a new physiological post-translational modification correlated to the cellular redox state. Moreover, the S-glutathiolation of the 20SPT increases its proteolytic activity suggesting an antioxidant role by removing oxidized proteins generated during oxidative challenges.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / In tropical regions, where there is a high incidence of light, electrons can accumulate in the transport chain (PET) producing large quantities of H 2 O 2 and other ROS, which might generate photodamage and photoinhibition. To survive to these challenges, plants have developed several mechanisms to mitigate the excess energy in photosystems, besides having an efficient machinery for removal of excess H 2 O 2 , which includes cytosolic APX (cAPX). However, double - silenced rice plants for cAPX (OsAPX1/2) do not show large differences in morpho - phenotype when compared to non - transformed (NT), although OsAPX1/2 presents induction of expression on several proteins re lated to photosynthesis. The physiological implications of this induction, as well as its consequences for OsAPX1/2 resistance against stresses of high light (HL), are still poorly known. Aiming to clarify the role of cAPx in pho tosynthesis, OsAPX1/2 plant s were produced, subjected to 24 hours of HL (2 , 000 μ mol m - 2 s - 1 ) and studied for the expression and activity of proteins related to photosynthesis , ph otorespira tion and redox homeostasis . The amount of several PET proteins (Lhcb1, PsbO, Psb P, PsbQ, PSAC, P C, FNR and FDX) and Chl and Pheo were increased in OsAPX1/2 in normal growth conditions, however without causing changes in the in vivo photochemistry activity parameters (Fv /Fm and ΔFm/Fm'). In contrast, expression of proteins associated with Calvin - Benso n cycle (Rls, ativase RBC) and rubisco carboxylation activity ( in vivo and in vitro ) were not altered in mutants under normal growth conditions . In HL, the expression of proteins related to photosynthesis was strongly repressed in all genotypes , as well as gas exchange parameters and Fv/Fm, the latter being strong indication of photoinhibition. Moreover, proteins related to photorespiration showed increased expression/activity in response to HL in NT and maintenance of already high levels in OsAPX1/2. In OsAPX1/2 t h e expression and activity of chloroplastic Cu/Zn - SOD showed a similar response exhibited by photorespiration - related proteins, although the activity of thylakoid APX has been greatly reduced, meaning deficiency in water - water cycle. Taken togeth er, these data demonstrate that induction of expression of proteins related PET in OsAPX1/2 plants may represent a compensatory mechanism for maintaining the photosynthetic activity levels similar to NT. Moreover, in HL, it is possible that the increased e xpression of photorespiration - related proteins in OsAPX1/2 acts as alternative electron sink, compensating the deficiency in the water - water cycle from these plants / Em regiÃes tropicais, onde existe alta incidÃncia luminosa, os elÃtrons podem se acumular na cadeia transportadora (PET) produzindo grandes quantidades de H 2 O 2 e outras ROS, que podem gerar fotodano e fotoinibiÃÃo. Para sobreviver a esse desafio, plantas desenvolveram vÃrios mecanismos de atenuaÃÃo do excesso de energia nos fotossistemas, alÃm de contar com uma eficiente ma quinaria de remoÃÃo do excesso de H 2 O 2 , da qual fazem parte as APX citosÃlicas (cAPX). Entretanto, plantas duplamente silenciadas para as cAPX (OsAPX1/2) nÃo apresentam grandes diferenÃas morfo - fenotÃpicas quando comparadas Ãs nÃo transformadas (NT), embor a OsAPX1/2 apresente induÃÃo de expressÃo de diversas proteÃnas relacionadas com a fotossÃntese, comparadas com as NT. As implicaÃÃes fisiolÃgicas dessa induÃÃo, assim como suas consequÃncias para a resistÃncia de OsAPX1/2 contra estresses de alta luz (HL) , ainda sÃo pouco conhecidas. Objetivando clarificar o papel das cAPx na fotossÃntese, plantas de arroz OsAPX1/2 foram produzidas, submetidas a 24 horas de HL (2000 μ mol m - 2 s - 1 ) e estudadas quanto à expressÃo e atividade de proteÃnas relacionadas com a fotossÃntese, fotorespiraÃÃo e homeostase redox. A quantidade de diversas proteÃnas da PET (Lhcb1, PsbO, PsbP, PsbQ, PSAC, PC, e FDX FNR), bem como teores de Chl e Pheo foram aum entadas em OsAPX1/2 em condiÃÃes normais de crescimento sem causar alteraÃÃes nos parÃmetros de atividade fotoquÃmica in vivo (Fv/Fm e Δ Fm/Fm'). Em contraste, as proteÃnas relacionadas com expressÃo ciclo de Calvin - Benson (Rls, ativase de Rbc) e a ativida de de carboxilaÃÃo da rubisco ( in vivo e in vitro ) nÃo foram alterados nos mutantes em condiÃÃes normais de crescimento. Em HL, a expressÃo de proteÃnas relacionadas com fotossÃntese foi fortemente reprimida em ambos os genÃtipos, assim como os parÃmetros de trocas gasosas e Fv/Fm, sendo esse Ãltimo forte indÃcio de fotoinibiÃÃo. Por outro lado, as proteÃnas relacionadas com a fotorespiraÃÃo, ou mostraram aumento na expressÃo/atividade em resposta à luz elevada (NT) ou manutenÃÃo de nÃveis jà elevados (OsAP X1/2) . A expressÃo e atividade de Cu/Zn - SOD de cloroplastos mostrou resposta similar a exibida pelas proteÃnas da fotorespiraÃÃo, embora a atividade de APX de tilacÃides tenha sido fortemente reduzida em OsAPX1/2, evidenciando deficiÃncia no ciclo Ãgua - Ãgu a. Tomados em conjunto, estes dados demonstram que a induÃÃo da expressÃo de proteÃnas relacionadas com o PET em OsAPX1/2 pode representar um mecanismo compensatÃrio para a manutenÃÃo da atividade fotossintÃtica aos nÃveis da NT. Por outro lado, sob HL, à possÃvel que o aumento da expressÃo de proteÃnas associadas com fotorespira ÃÃo em OsAPX1/2 atue como dissipador alternativo de elÃtrons, compensando a deficiÃncia no ciclo da Ãgua - Ãgua dessas plantas

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Colletotrichum gloeosporioides à um importante patÃgeno hemibiotrÃfico com uma ampla gama de hospedeiros que causa perdas substanciais de colheitas. Dados recentes mostraram que a resposta hipersensitiva (HR) à um evento envolvido na resistÃncia do feijÃo-de-corda (V.unguiculata) genÃtipo BR-3 contra C.gloeosporioides (isolado LPVD-1). VÃrios estudos tÃm sido realizados sobre os mecanismos de defesa de plantas a patÃgenos hemibiotrÃficos, mas em geral eles continuam a ser mal compreendidos. Anteriormente, comparamos mudanÃas na expressÃo de proteÃnas induzidas em genÃtipos resistentes de feijÃo-de-corda apÃs a infecÃÃo com C. gloeosporioides utilizando uma abordagem proteÃmica. Com base nesses resultados, no presente estudo, avaliamos as respostas de defesa induzidas por C.gloeosporioides em V.unguiculata associadas com a explosÃo oxidativa, o acÃmulo de espÃcies reativas de oxigÃnio (EROs), como o Ãnion superÃxido (O2â-), e o perÃxido de hidrogÃnio (H2O2), bem como a expressÃo de genes antioxidantes, utilizando anÃlise por RT-qPCR. Ao mesmo tempo foi analisada a cinÃtica de infecÃÃo de C.gloeosporioides por microscopia Ãptica (MO) e microscopia eletrÃnica de varredura (MEV). O aumento de O2â- e H2O2 foi detectado em feijÃo-de-corda, 2 horas apÃs a inoculaÃÃo (hai) utilizando coloraÃÃo por NBT e DAB, respectivamente. A quantificaÃÃo espectrofotomÃtrica demonstrou dois picos de produÃÃo de H2O2, 2 e 12 hai, mostrando uma cinÃtica bifÃsica. O aumento de H2O2 foi acompanhado por peroxidaÃÃo lipÃdica 2 e 48 hai. As anÃlises de MO e MEV mostraram que C.gloeosporioides foi capaz de gerar estruturas tais como tubos germinativos e apressÃrios e se desenvolver sob a superfÃcie das folhas. No entanto, apesar do desenvolvimento e tentativa de infecÃÃo, alteraÃÃes ultra-estruturais foram observadas na superfÃcie de conÃdios e hifas 8 hai levando a nÃo infecÃÃo de cÃlulas hospedeiras. AnÃlise por RT-qPCR demonstrou que os genes VuFeSODI e VuCuZnSODII apresentaram aumento de expressÃo 4 hai, enquanto que o gene VuCuZnSODI foi bem expresso 12 hai. Em relaÃÃo aos genes associados à regulaÃÃo de H2O2, VuPrxIIBCD mostrou uma forte aumento de transcristos em 2 hai enquanto que, VuAPXI mostrou aumento de expressÃo apenas 12 hai. VuCATI e VuCATII mostram aumento de expressÃo quantitativa dos transcritos 12 hai, indicando que eles sÃo associados a manutenÃÃo de H2O2 em peroxissomos. Contrariamente, a expressÃo dos transcritos de VuPrxIIE foi reprimida nas primeiras horas apÃs a inoculaÃÃo, contudo, apresentaram nÃveis aumentados de expressÃo em 48 hai, sugerindo participar na regulaÃÃo de H2O2 nos cloroplastos. O presente estudo indica que H2O2 tem um papel importante nas estratÃgias de defesa iniciais de feijÃo-de-corda, agindo contra C.gloeosporioides e funcionando como uma molÃcula sinalizadora. AlÃm disso, os genes associados com defesas antioxidantes estudados parecem estar envolvidos, em combinaÃÃo com outras molÃculas, na regulaÃÃo dos nÃveis de H2O2 para prevenir a morte celular e regular a homeostase redox, eventos importantes nos mecanismos de resistÃncia de plantas a patÃgenos. / Colletotrichum gloeosporioides is an important hemibiotrophic pathogen with a broad host range that causes substantial crop losses. Recent data have shown that the hypersensitive response (HR) is one event involved in the resistance of cowpea (V.unguiculata) genotype BR-3 against C.gloeosporioides (LPVD-1 isolate). Several studies have been undertaken on the defense mechanism of plant to hemibiotrophic pathogen, but overall they remain poorly understood. Previously, we have compared changes in protein expression induced in resistant cowpea genotype after infection with C.gloeosporioides using a proteomic approach. Based on these results, in the present study, we evaluated the defense responses induced by C.gloeosporioides in V.unguiculata associated with oxidative burst, accumulation of reactive oxygen species (ROS) such as superoxide anion (O2â-), hydrogen peroxide (H2O2) as well expression of antioxidant genes using RT-qPCR analysis. At the same time, we analyzed the C.gloeosporioides infection kinetics by optical microscopy (OM) and scanning electron microscopy (SEM). Increased O2â- and H2O2 was detected in cowpea 2 hours after inoculation (hai) using NBT and DAB staining, respectively. Spectrophotometric measurements showed two peaks H2O2 production, 2 and 12 hai, showing a biphasic kinetics. The increase of H2O2 was accompanied by lipid peroxidation 2 and 48 hai. OM and SEM analyzes showed that C.gloeosporioides was able to generate germ tubes and structures such as apressoria and develop under the surface of the leaves. However, despite of the development and attempt to infection, ultra-structural changes were observed on the surface of conidia and hyphae, 8 hai led to no infection of host cells. Analysis by RT-qPCR demonstrated that the genes VuFeSODI and VuCuZnSODII are up- regulated in chloroplasts at 4 hai, while the gene VuCuZnSODI was well up-regulated 12 hai. In relation to genes associated to scavenging of H2O2, VuPrxIIBCD showed a strong up-regulated of transcript at 2 hai while that VuAPXI showed up-regulated only 12 hai. VuCATI and VuCATII showed that the quantitative level of transcript expression was up- regulated 12 hai, indicating that they are important in the maintenance of H2O2 in peroxisomes. Contrarily, VuPrxIIE transcript was down-regulated in the early hours after inoculation, but showed increased expression levels at 48 hai suggesting participate in the regulation of H2O2 in chloroplasts. The present study indicates that H2O2 has an important role in the initial defense strategies of cowpea acting against C.gloeosporioides and functioning as a signaling molecule. Furthermore, genes associated with antioxidant defenses studied here seem to be involved, in combination with other molecules, in the regulation of H2O2 levels toward preventing cell death and regulating the cell redox homeostasis, important events in the resistance mechanisms of plants to pathogens.