Lee Kai Woo. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2006. / Includes bibliographical references (leaves 90-104). / Abstracts in English and Chinese. / Acknowledgements --- p.ii / Thesis Committee --- p.iii / Abstracts --- p.v / 論文槪要 --- p.vii / List of figures --- p.viii / List of abbreviations --- p.ix / Chapter Chapter one --- Introduction --- p.1 / Chapter 1.1 --- Drug metabolism and UGTs --- p.1 / Chapter 1.2 --- Natural substrates of UGTs --- p.4 / Chapter 1.3 --- Functions of UGT isoforms: roles of UGT polymorphisms --- p.6 / Chapter 1.4 --- Evolution of the UGT1 gene locus in vertebrates --- p.8 / Chapter 1.5 --- Multiple Variable First Exons: A Mechanism for Cell- and Tissue-Specific Gene regulation --- p.13 / Chapter 1.6 --- Evolutionary Origin of the Variable and Constant Genomic Organization --- p.14 / Chapter 1.7 --- Variable and Constant Genomic Organizations Exist in Mammalian UGTs --- p.20 / Chapter 1.8 --- The history of recombinant UGT expression --- p.20 / Chapter 1.9 --- UGT1A8 --- p.21 / Chapter 1.10 --- Licorice and its active component --- p.24 / Chapter 1.11 --- Enzyme induction in the liver --- p.25 / Chapter 1 12 --- Objectives --- p.28 / Chapter Chapter two --- Methods and Materials --- p.29 / Chapter 2.1 --- UGT1A8 induction studies --- p.30 / Chapter 2.1.1 --- Drug preparation --- p.30 / Chapter 2.1.2 --- Cell viability study with Neutral Red Assay Rat treatment --- p.30 / Chapter 2.1.3 --- Cell treatment --- p.31 / Chapter 2.1.4 --- Rat treatment --- p.31 / Chapter 2.1.5 --- RNA extraction from rat liver and cell culture --- p.31 / Chapter 2.1.6 --- Quantization of RNA --- p.32 / Chapter 2.1.7 --- Denaturing gel electrophoresis for RNA --- p.33 / Chapter 2.1.8 --- Northern hybridization --- p.33 / Chapter 2.1.9 --- Probe for Northern Blotting --- p.34 / Chapter 2.1.10 --- Agarose Gel analysis and Northern Blot analysis --- p.34 / Chapter 2.2 --- Recombinant expression of UGT1A8 in E.coli JM109 --- p.35 / Chapter 2.2.1 --- cDNA synthesis --- p.35 / Chapter 2.2.2 --- Polymerase chain reaction --- p.35 / Chapter 2.2.3 --- Agarose gel electrophoresis for DNA --- p.35 / Chapter 2.2.4 --- "Amplification of target gene, UGT1A8" --- p.36 / Chapter 2.2.5 --- Restriction enzyme digestion of plasmid and insert --- p.36 / Chapter 2.2.6 --- Ligation of plasmid and insert DNA --- p.37 / Chapter 2.2.7 --- Amplification of target plasmid --- p.37 / Chapter 2.2.8 --- Screening of target plasmid --- p.37 / Chapter 2.2.9 --- DNA sequencing --- p.38 / Chapter 2.2.10 --- Transformation of protein expression host --- p.38 / Chapter 2.2.11 --- Confirmation of transformation of protein expression host --- p.38 / Chapter 2.2.12 --- Protein expression --- p.39 / Chapter 2.2.13 --- Protein purification --- p.39 / Chapter 2.2.14 --- Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis --- p.40 / Chapter 2.2.15 --- Confirmation of the protein --- p.40 / Chapter 2.3 --- Characterization of recombinant UGT1A8 --- p.41 / Chapter 2.3.1 --- UGT assay --- p.41 / Chapter 2.4 --- Routine experiment methods --- p.41 / Chapter 2.4.1 --- Determination of protein --- p.41 / Chapter 2.4.2 --- Nucleic acid purification --- p.42 / Chapter 2.4.3 --- Preparation of chemically competent bacterial cells --- p.42 / Chapter 2.4.4 --- Colony PCR --- p.43 / Chapter 2.4.5 --- Plasmid rescue by alkaline lysis --- p.44 / Chapter 2.4.6 --- Charging of His-tagged column --- p.44 / Chapter 2.4.7 --- Washing of His-tagged column --- p.45 / Chapter Chapter three --- Results --- p.46 / Chapter 3.1 --- UGT1A8 Expression in clone9 and H4IIE after treatment with licorice and 18 β glycyrrhentinic acid --- p.46 / Chapter 3.2 --- UGT1A8 induction in wistar and j/j rats after treatment --- p.63 / Chapter 3.3 --- Construction of pRset-UGT 1A8 Vector --- p.70 / Chapter 3.4 --- Purification of recombinant UGT1A8 --- p.75 / Chapter 3.5 --- Screening of substrate of the purified enzyme --- p.77 / Chapter Chapter four --- Discussion --- p.78 / Chapter 4.1 --- Effects of licorice and 18βglycyrrhetinic acid in the induction of UGT1A8 in different cell lines --- p.78 / Chapter 4.2 --- Comparison of wistar and j/j rats in the induction of UGT1A8 --- p.79 / Chapter 4.3 --- Comparison of licorice and 18(3 glycyrrhetinic acid in the induction of UGT1A8 in rats --- p.81 / Chapter 4.4 --- Comparison of in vivo and in vitro of drug treatment --- p.81 / Chapter 4.5 --- Expression of UGT1A7 after drug treatment in vitro --- p.82 / Chapter 4.6 --- Protein expression and purification --- p.83 / Chapter 4.7 --- Substrates of UGT1A8 --- p.83 / Chapter Chapter Five --- Conclusions --- p.86 / References --- p.90 / Appendix --- p.105

La plupart des molécules utilisées en chimiothérapie conventionnelle, bien qu’ayant des cibles moléculaires différentes, induisent dans la majorité des cas une mort cellulaire par apoptose. Or, de plus en plus de chimiorésistances se rencontrent au niveau des cellules cancéreuses vis-à-vis de ce type de molécules. Face à cette situation il devient urgent de trouver des molécules ayant des mécanismes d’action différents et capables de court-circuiter spécifiquement les mécanismes de résistance des cellules cancéreuses. <p>La stratégie mise en place lors de ce travail a été de partir d’une molécule naturelle issue d’un extrait de la racine de Glycyrrhiza glabra qui présentait déjà une activité anti tumorale marquée. L’intérêt du travail a été de dériver l’acide 18β-glycyrrhétinique de manière originale afin de potentialiser son effet anticancéreux, notamment vis-à-vis de huit lignées cellulaires présentant des résistances plus ou moins marquées aux stimuli pro-apoptotiques. Ainsi après avoir caractérisé la pureté et la stabilité de cette série de nouvelles molécules, nous avons retenu les dérivés les plus intéressants en termes d’inhibition in vitro de la prolifération cellulaire. Sur base de ce premier choix, nous avons investigué des cibles spécifiques décrites dans la littérature pour les hémidérivés de l’acide 18β-glycyrrhétinique :le protéasome 26S et le récepteur nucléaire PPARγ. Cette étude nous a permis de retenir un dérivé en particulier capable d’inhiber à 50% les trois sites catalytiques du protéasome sans toutefois inhiber PPARγ :le N-(2-{3-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]ureido}ethyl)-glycyrrhetinamide (6b). Nous avons ensuite évalué ce composé sur un ensemble de 333 kinases afin de déterminer un profil antitumoral plus large pour ce type de molécule. <p>Le profil pharmacologique in vitro de ce dérivé de l’acide 18β-glycyrrhétinique nous a amenés à étudier son comportement in vivo chez la souris saine. A cette fin, une étude de préformulation nous a permis de définir une formulation galénique optimale pour ce composé, la nanoémulsion qui a servi à déterminer une dose maximale tolérée (indice DMT) par la souris saine. Nous avons ensuite travaillé à une dose non toxique pour déterminer le profil pharmacocinétique plasmatique chez la souris saine, par voie d’administration intraveineuse et par voie orale. <p>Les conclusions de cette étude nous montrent que le dérivé de l’acide 18β-glycyrrhétinique que nous avons mis au point présente de remarquables caractéristiques pharmacologiques in vitro et un comportement in vivo proche de la molécule naturelle. Des études d’activité in vivo devraient débuter prochainement.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished