München, Techn. University, Diss., 2003.

This work developed during the first funding period of the subproject B05 in the framework of the interdisciplinary research consortium TRR 225 ‘From the Fundamentals of Biofabrication toward functional Tissue Models’ and was part of a cooperation between the Orthopedic Department represented by Prof. Dr. Regina Ebert and the Institute of Organic Chemistry represented by Prof. Dr. Jürgen Seibel. This project dealed with cellular behavior during the bioprinting process and how to influence it by modifying the cell glycocalyx with functional target molecules. The focus was on the impact of potential shear stress, that cells experience when they get processed in thermoresponsive bioinks, and a way to increase the cell stiffness via metabolic glycoengineering to attenuate shear forces. For the characterization of the metabolic glycoengineering, four different peracetylated and four non-acetylated modified monosaccharides (two mannose and two sialic acid sugars) were tested in primary human mesenchymal stromal cells (hMSC) and telomerase-immortalized hMSC (hMSC-TERT). Viability results demonstrated a dose-dependent correlation for all sugars, at which hMSC-TERT seemed to be more susceptible leading to lower viability rates. The assessment of the incorporation efficiencies was performed by click chemistry using fluorescent dyes and revealed also a dose-dependent correlation for all mannose and sialic acid sugars, while glucose and galactose variants were not detected in the glycocalyx. However, incorporation efficiencies were highest when using mannose sugars in the primary hMSC. A subsequent analysis of the temporal retention of the incorporated monosaccharides showed a constant declining fluorescence signal up to 6 d for azido mannose in hMSC-TERT, whereas no signal could be detected for alkyne mannose after 2 d. Investigation of the differentiation potential and expression of different target genes revealed no impairment after incubation with mannose sugars, indicating a normal phenotype for hMSC-TERT. Following the successful establishment of the method, either a coumarin derivative or an artificial galectin 1 ligand were incorporated into the cell glycocalyx of hMSC-TERT as functional target molecule. The biophysical analysis via shear flow deformation cytometry revealed a slightly increased cell stiffness and lowered fluidity for both molecules. A further part of this project aimed to control lectin-mediated cell adhesion by artificial galectin 1 ligands. As that hypothesis was settled in the work group of Prof. Dr. Jürgen Seibel, this work supported with an initial characterization of galectin 1 as part of the hMSC biology. A stable galectin 1 expression at gene and protein level in both hMSC and hMSC-TERT could be confirmed, at which immunocytochemical stainings could detect the protein only in the glycocalyx. The treatment of hMSC-TERT with a galectin 1 ligand in different concentrations did not show an altered gene expression of galectin 1. However, these first data in addition to the investigation of stiffness confirmed the applicability of specific and artificial IV galectin 1 ligands in biofabrication approaches to alter cell properties of hMSC. To conclude, metabolic glycoengineering has been successfully implemented in hMSC and hMSC-TERT to introduce glycocalyx modifications which reside there for several days. A proof of concept was carried out by the increase of cell stiffness and fluidity by the incorporation of a coumarin derivative or an artificial galectin 1 ligand. For the characterization of shear stress impact on cells after printing in thermoresponsive bioinks, the processing of hMSC-TERT (mixing or additionally printing) with Pluronic F127 or Polyoxazoline-Polyoxazine (POx-POzi) polymer solution was investigated. While there were no changes in viability when using POx-POzi bioink, processing with Pluronic F127 indicated slightly lower viability and increased apoptosis activity. Assessment of cellular responses to potential shear stress showed no reorganization of the cytoskeleton independent of the bioink, but highly increased expression of the mechanoresponsive proto-oncogene c Fos which was more pronounced when using Pluronic F127 and just mixed with the bioinks. Interestingly, processing of the mechanoresponsive reporter cell line hMSC-TERT-AP1 revealed slightly elevated mechanotransduction activity when using POx-POzi polymer and just mixed with the bioinks as well. In conclusion, hMSC-TERT embedded in thermoresponsive bioinks might shortly experience shear stress during the printing process, but that did not lead to remarkable cell damage likely due to the rheological properties of the bioinks. Furthermore, the printing experiments also suggested that cells do not sense more shear stress when additionally printed. / Diese Arbeit entstand aus dem Projekt B05 während der ersten Förderperiode im Rahmen des interdisziplinären Sonderforschungsbereiches TRR 225 „Von den Grundlagen der Biofabrikation zu funktionalen Gewebemodellen“ und beinhaltete eine Kooperation zwischen dem Lehrstuhl für Orthopädie repräsentiert durch Prof. Dr. Regina Ebert und dem Institut für Organische Chemie repräsentiert durch Prof. Dr. Jürgen Seibel. Das Projekt beschäftigte sich mit den Auswirkungen des 3D Drucks auf Zellen während und nach dem Druck mit thermoresponsiven Biotinten. Hierbei lag der Fokus auf Scherkräften, die Zellen während des Drucks erfahren, und der Möglichkeit, deren nachteilige Auswirkungen durch gezielte Erhöhung der Zellsteifigkeit via Metabolic Glycoengineering zu minimieren. Zur Etablierung dieser Methode wurden vier azetylierte sowie vier nicht-azetylierte modifizierte Einfachzucker (zwei Mannosen und zwei Sialinsäuren) hinsichtlich ihrer Zellkompatibilität und Einbaurate in primären humanen mesenchymalen Stromazellen (hMSC) und Telomerase-immortalisierten hMSC (hMSC-TERT) charakterisiert. Bei der Viabilität zeigte sich für alle untersuchten Zucker ein konzentrationsabhängiges Verhalten, wobei die hMSC-TERT generell empfindlicher reagierten. Eine Untersuchung von verschiedenen Zielgenen nach Zuckerinkubation gab keine Hinweise auf biologisch veränderte Expressionsmuster und auch das phänotypische Differenzierungspotenzial (adipogen und osteogen) blieb erhalten. Der Einbau der modifizierten Zucker in Proteoglykane sowie Glykoproteine der Glykokalyx wurde mikroskopisch mittels Fluoreszenzfarbstoffen charakterisiert. Dabei zeigte sich ebenfalls ein konzentrationsabhängiges Verhalten für alle Mannosen und Sialinsäuren, wohingegen die Glukose- und Galaktosevarianten nicht nachgewiesen werden konnten. Die Mannosezucker zeigten die höchsten Einbauraten, welche in primären hMSC noch stärker ausfielen als in hMSC-TERT. Ein Langzeitversuch zur Beurteilung der zeitlichen Stabilität der Glykokalyxmodifikation konnte für die azetylierte Azidomannose ein abnehmendes Fluoreszenzsignal bis zum sechsten Tag nach der Klickreaktion ermitteln. Im Gegensatz dazu konnte die azetylierte Alkinmannose bereits ab dem zweiten Tag nicht mehr nachgewiesen werden. Nach der erfolgreichen Optimierung der Methodik wurde der Effekt eines Kumarinderivates oder eines künstlichen Galektin 1 Liganden auf die Zellsteifigkeit sowie die -fluidität mit Hilfe der Deformationszytometrie untersucht. Die Modifikation der Glykokalyx mit beiden untersuchten Molekülen führte zu einer leichten Erhöhung der Steifigkeit in Kombination mit einer leicht erniedrigten Fluidität. In einem weiteren Teil des Projekts sollte die Lektin-vermittelte Adhäsion von Zellen an Polymerstränge initiiert werden, indem sie mit künstlichen Galektin 1 Liganden modifiziert werden. Da diese Hypothese in der Forschungsgruppe von Prof. Dr. Jürgen Seibel bearbeitet wurde, unterstützte diese Arbeit mit einer anfänglichen Charakterisierung von Galektin 1 als Teil der hMSC Zellbiologie. In hMSC und hMSC-TERT konnte eine VI stabile Expression auf Gen- und Proteinebene nachwiesen werden, wobei das Lektin in der Glykokalyx lokalisiert war. Ein Inkubationsversuch mit einem spezifischen Liganden zeigte in hMSC-TERT unabhängig von der Konzentration keine veränderte Galektin 1 Genexpression. In Verbindung mit den Steifigkeitsuntersuchungen bestätigt diese anfängliche Charakterisierung die Anwendbarkeit von künstlichen Galektin 1 Liganden in der Biofabrikation um hMSC zu modifizieren. Somit konnte gezeigt werden, dass Metabolic Glycoengineering sich für die gezielte Einbringung von Molekülen in die Zellglykokalyx von primären hMSC sowie der entsprechenden TERT-Zelllinie zur mittelfristigen Modifikation eignet. Dies wurde durch einen funktionellen Ansatz bestätigt, indem die Zellsteifigkeit und -fluidität durch den Einsatz zwei verschiedener Moleküle erwartungsgemäß beeinflusst wurden. Für die Charakterisierung der Scherstressauswirkungen auf Zellen nach 3D Druck in thermoresponsiven Biotinten wurden hMSC und hMSC-TERT in Pluronic F127 oder Polyoxazolin-Polyoxazin (POx-POzi) Polymerlösung prozessiert (gemischt oder zusätzlich verdruckt) und direkt danach analysiert. Während letztere die Viabilität nicht verschlechterte, zeigten hMSC-TERT nach Verarbeitung in Pluronic F127 eine leicht erniedrigte Viabilität sowie leicht erhöhte Apoptoseraten. Im Zuge von Analysen der Mechanotransduktion und deren Auswirkungen konnte unabhängig von der Biotinte sowie der Behandlung kein Umbau des Zytoskeletts immunzytochemisch nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu zeigten Genexpressionsanalysen eine starke Hochregulierung des mechanoresponsiven Proto-Onkogens c Fos unter allen Bedingungen, wobei diese stärker ausfiel bei Verwendung der Pluronic F127 Biotinte und nur nach Mischen (gilt für beide Biotinten). Um den Scherstress quantitativ zu beurteilen, wurde die Reporterzelllinie hMSC-TERT-AP1 verwendet, welche das Auslesen der Mechanotransduktion durch eine gekoppelte Luziferase-Proteinexpression ermöglicht. Interessanterweise zeigte sich eine leicht erhöhte Luziferaseaktivität nur nach Verarbeitung mit der POx-POzi Polymerlösung, welche stärker ausfiel wenn die Zellen mit der Biotinte lediglich gemischt wurden. Zusammengenommen bestätigten die Ergebnisse die zelluläre Wahrnehmung von Scherstress in thermoresponsiven Biotinten, allerdings scheint dieser nur schwache Auswirkungen auf die Zellen zu haben, was auf die rheologischen Eigenschaften beider untersuchten Biotinten zurückgeführt werden kann. Die Druckergebnisse legten außerdem nahe, dass die Zellen nicht mehr Scherstress erfahren, wenn sie zusätzlich verdruckt wurden.

Trotz enormer Fortschritte in der Therapie, bleibt der kardiogene Schock die führende Todesursache im akuten Myokardinfarkt. Die pathophysiologischen Veränderungen umfassen dabei unter anderem Störungen der Mikrozirkulation, endotheliale Dysfunktion mit vaskulärer Leckage, sowie vermehrte Thrombozyten- und Leukozytenadhäsion an die Gefäßwand. Die endotheliale Glykokalyx wurde als zentraler Regulator dieser Prozesse identifiziert. Das Glykosaminoglykan Heparansulfat repräsentiert dabei den Hauptbestandteil der Endothelzelloberfläche und Syndecan-1 das am weitesten verbreitete Proteoglykan. Diesbezüglich konnte in Studien eine Assoziation zwischen Schädigung der endothelialen Glykokalyx und den zirkulierenden Membranbestandteilen im Patientenblut beobachtet werden. Ziel der Arbeit war die Analyse der Glykokalyxmarker bei 184 Patienten mit Infarkt-assoziiertem kardiogenen Schock. In den Serumproben zum Zeitpunkt der Aufnahme und nach einem Tag wurde mittels ELISA die Konzentration von Heparansulfat und Syndecan-1 bestimmt. Dabei zeigte sich ein signifikanter Konzentrationsabfall von Syndecan-1 innerhalb des Analysezeitraums. Des Weiteren hatten die Überlebenden an beiden Tagen signifikant niedrigere Syndecan-1-Serumwerte. Durch eine schrittweise Multiregressionsanalyse wurde Syndecan-1 bei Patienten mit akutem Myokardinfarkt und assoziiertem kardiogenen Schock als unabhängiger Prädiktor der 30-Tage- Mortalität identifiziert.

Trotz enormer Fortschritte in der Therapie, bleibt der kardiogene Schock die führende Todesursache im akuten Myokardinfarkt. Die pathophysiologischen Veränderungen umfassen dabei unter anderem Störungen der Mikrozirkulation, endotheliale Dysfunktion mit vaskulärer Leckage, sowie vermehrte Thrombozyten- und Leukozytenadhäsion an die Gefäßwand. Die endotheliale Glykokalyx wurde als zentraler Regulator dieser Prozesse identifiziert. Das Glykosaminoglykan Heparansulfat repräsentiert dabei den Hauptbestandteil der Endothelzelloberfläche und Syndecan-1 das am weitesten verbreitete Proteoglykan. Diesbezüglich konnte in Studien eine Assoziation zwischen Schädigung der endothelialen Glykokalyx und den zirkulierenden Membranbestandteilen im Patientenblut beobachtet werden. Ziel der Arbeit war die Analyse der Glykokalyxmarker bei 184 Patienten mit Infarkt-assoziiertem kardiogenen Schock. In den Serumproben zum Zeitpunkt der Aufnahme und nach einem Tag wurde mittels ELISA die Konzentration von Heparansulfat und Syndecan-1 bestimmt. Dabei zeigte sich ein signifikanter Konzentrationsabfall von Syndecan-1 innerhalb des Analysezeitraums. Des Weiteren hatten die Überlebenden an beiden Tagen signifikant niedrigere Syndecan-1-Serumwerte. Durch eine schrittweise Multiregressionsanalyse wurde Syndecan-1 bei Patienten mit akutem Myokardinfarkt und assoziiertem kardiogenen Schock als unabhängiger Prädiktor der 30-Tage- Mortalität identifiziert.

Intravenöse Flüssigkeitsverabreichung gilt als Basismaßnahme für die perioperative Therapie chirurgischer Patienten. Damit lassen sich verschiedene Bestandteile der Homöosthase beeinflussen. Die Effekte und die Effektivität der Volumentherapie im perioperativen Setting sind aber von mehreren objektiven und subjektiven Faktoren abhängig. Insbesondere bei den herzchirurgischen Patienten ist dies durch den zusätzlichen Einsatz der Herz-Lung-Maschine, die starken Volumenverschiebungen und die beeinträchtigte Herz-Kreislauf-Kompetenz von großer Bedeutung. Die Bedeutung der endothelialen Innenschicht-Glykokalyx und seiner Eigenschaften in Unterstützung der Gefäßwandintegrität wird zunehmend verstanden. Da sowohl perioperative Hyper- als auch Hypovolämie Nachteile mit sich bringen, wird stetig versucht, „optimale“ Algorithmen für die Flüssigkeitstherapie bei diversen Kategorien der Patienten zu etablieren. Nach dem Konzept der zielgerichteten Therapie wird die Flüssigkeit entsprechend einer Volumenreagibilität des Patienten verabreicht. Nicht nur die Art der Volumensubstitution, sondern auch der Typ der Infusionslösung spielt eine entscheidende Rolle im Flüssigkeitsmanagement. Die Geschichte der Forschung, um eine ideale Lösung zu finden, reicht schon weit über 100 Jahre in die Vergangenheit. In der letzten Dekade erfolgte auf Grund der neuen wissenschaftlichen Daten ein Paradigmenwechsel in verschiedenen Aspekten der intravenösen Volumentherapie: Nach negativen Ergebnissen großer randomisierter Studien aus der Intensivmedizin kam es zu einer Einschränkung der Verwendung der Hydroxyethylstärke-Lösungen bei kritisch kranken Patienten durch die Empfehlung der Europäischen Arzneimittelagentur im Jahr 2013. Auch die balancierten kristalloiden Lösungen werden zunehmend als primäre Präparate statt isotonischer Kochsalzlösung für Flüssigkeitsmanagement eingesetzt. Ziel dieser Arbeit war es, einen Überblick über den aktuellen Stand in der perioperativen Volumentherapie in europäischen herzchirurgischen Kliniken zu schaffen. Als Methode wurde die elektronische Umfrage gewählt. Alle zu diesem Zeitpunkt bekannten Umfragen zum Thema Volumentherapie bei herzchirurgischen Patienten sind noch vor der HES-Einschränkung durchgeführt worden und das Ausmaß ihrer Auswirkung auf die medizinische Praxis war bisher nicht untersucht. Die Umfrage wurde durch European Association of Cardiothoracic Anesthesiology (EACTA) initiiert und mittels des Onlineservices SurveyMonkey durchgeführt, wobei die Teilnehmer mit Einladungsemails eine Verknüpfung zum Fragebogen auf der SurveyMonkey Seite erhielten. Es wurden zwei Versionen dieser Umfrage verschickt. Nachdem die Rücklaufquote hinsichtlich der ersten Version zu gering war, wurde entschieden, die Adressatenliste und den Fragebogen zu überarbeiten, mit dem Ziel, die Beantwortung zu vereinfachen und zu verkürzen. Die finale Version des Fragebogens bestand aus 26 Fragen in drei Gruppen: a) allgemeine Fragen und Tätigkeit, b) perioperative Flüssigkeitstherapie und Eigenschaften verschiedenen Präparaten, c) Wahrnehmungen und Überlegungen in der Wahl der Infusionslösung. Der Fragebogen wurde im Oktober 2016 zwischen 379 Anästhesisten, die aus unterschiedlichen Zentren 18 europäischer Länder stammten, verteilt. Die Rücklauffrist endete am 19. Dezember 2016. Insgesamt antworteten 106 Adressaten, was einer Rücklaufquote von 28 % entspricht. Die Ergebnisse der Umfrage zeigten, dass die Respondenten hauptsächlich in Lehrkrankenhäusern (66 %) tätig waren. Bei 73 % der Institutionen wurden Patienten postoperativ in herzchirurgischen Intensivmedizinabteilungen aufgenommen. Die Anästhesisten waren verantwortlich für das intraoperative Flüssigkeitsmanagement und die Kardiotechniker für Herz-Lungen-Maschine Priming. Balancierte Kristalloide wurden in 51,5 % der Zentren für das HLM-Priming gewählt und bei 36 % als Kombination mit Kolloiden (synthetischen oder Albumin). Für das primäre intraoperative Management wurden bei 74 % der Zentren balancierte Kristalloide genutzt, gefolgt von Kristalloid+Kolloid Kombination (15 %) und anderen (11 %). 32 % der Befragten nutzten die Kolloide überhaupt nicht. Gelatine mit 60 % war das bevorzugte Kolloid, wenn dies mit HES und Albumin verglichen wurde (24 % und 16 % entsprechend). 73 % der Teilnehmer, die auch in intensivmedizinischer postoperativer Betreuung involviert waren, änderten ihre intraoperative Flüssigkeitsstrategie auf ITS nicht. Als relevanteste Eigenschaften für perioperative Anwendung der Flüssigkeiten wurden das Risiko der renalen Schädigung und das Risiko der Blutung genannt. Im Vergleich zur intraoperativen Flüssigkeitstherapie und HLM-Priming hatte die ITS-Therapie mehr Einfluss auf das Outcome. Die Wahl der Flüssigkeiten wurde mehrheitlich von internationalen Leitlinien und klinischen Bedürfnissen beeinflusst. Die Hauptsorgen in der aktuellen Praxis der Befragten bezüglich Infusionstherapie sind koagulations- und renale Nebenwirkungen. Die Bindung und der Transport von endogenen und exogenen Verbindungen und die Bindung von proinflammatorischen und endogenen Molekülen wurden als die interessantesten Eigenschaften des Albumins angesehen, wenn Albumin für ein Management der Patienten am kardiopulmonalen Bypass verwendet wurde. Die Ergebnisse wurden auch mit entsprechenden Daten aus früheren europäischen Umfragen zu dieser Thematik verglichen, was auf eine Reduktion des HES-Einsatzes und steigende Anwendung der Kristalloide deutete. Zusammenfassend zeigte die Umfrage, dass die balancierten kristalloiden Lösungen die bevorzugten perioperativen Infusionsflüssigkeiten in europäischen herzchirurgischen Zentren waren. Die Verwendung von Kolloiden schien deutlich gesunken zu sein, offenbar durch eine Einschränkung der HES-Präparate. Gelatine ist die am häufigsten eingesetzte kolloidale Lösung.:1. Bibliographische Beschreibung 3 2. Einführung in die Thematik 4 2.1 Perioperatives Flüssigkeitsmanagement und Besonderheiten bei herzchirurgischen Patienten 4 2.1.1. Die Rolle der Glykokalyx 5 2.1.2. „Optimale“ Flüssigkeitstherapie bei chirurgischen Patienten 5 2.1.3. Infusionslösungen 7 2.1.4. Sicherheit von HES im Zweifel 9 2.1.5. Besonderheiten in der Kardioanästhesie, die Rolle des Primings 10 2.2. Online-Umfrage als Forschungsmethode der aktuellen Arbeit 11 2.2.1. Entwicklung des Fragebogens 12 2.2.2. Durchführung der Umfrage 16 2.2.3 Limitationen der Umfrage-Methode 17 3. Publikation 19 “Fluid management in cardiac surgery: results of a survey in European cardiac anesthesia departments”. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia 31 (2017) 1624–1629. 4. Zusammenfassung der Arbeit 25 5. Anlagen 28 5.1. Literaturverzeichnis 28 5.2. Abkürzungsverzeichnis 32 5.3. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 33 5.4. Lebenslauf 34 5.5. Erklärung des eigenen wissenschaftlichen Beitrags zu Publikationspromotion 36 5.6. Danksagung 37

UNIVERZITA KARLOVA Lékařská fakulta v Plzni Dizertační práce Endothelial glycocalyx - diagnostic approach and intervention assessment MUDr.Jiří Pouska ABSTRACT Endothelial glycocalyx (EG) is fine structure on the surface of endothelium. After extensive research in past years, revisited Starling principle was finally formulated. It describes fluid physiology in capillaries precisely. EG has pivotal role in keeping endothelium semipermeable and thus avoiding extensive filtration of fluids to interstitium. Assessment of EG is clinically difficult. Many pathological conditions lead to damage of EG (sepsis etc.). Intravenous fluid therapy is mainstay of treatment of such conditions. Our aim was to determine the changes of EG integrity depending on the choice of intravenous fluid and its infusion time in physiological and pathological conditions. Key words: Endothelial glycocalyx, infusion therapy, anaesthesia, sepsis, microcirculation.

Trichobilharzia spp. are avian schistosomes related to medically important human parasites of the genus Schistosoma. Penetrating cercariae are well known as causative agent of cercarial dermatitis in humans. Cercariae actively penetrate the skin of definitive hosts and transform into schistosomula. This process is preceded by cercarial tail detachment and includes emptying of penetration glands and extensive surface changes. One of these changes is the loss of highly immunogenic glycocalyx which represents a protective coat in the aquatic environment. The glycocalyx has specific composition of saccharide molecules which are bound to lipids or proteins on the membrane of cercarial tegument. There is only limited information about the mechanism of shedding. Hypotheses based on indirect evidences suggest that peptidases or (phospho)lipases from penetration glands could be involved. This work describes the changes in surface glycosylation during transformation of cercariae into schistosomula by fluorescently labelled lectins and monoclonal antibodies against Lewis X antigen. Lectins UEA-I, LTA and PNA have been chosen as markers of transformation of T. regenti. Further, our experiments have been focused on shedding of cercarial glycocalyx. During in vitro induction of penetration gland emptying and...

The class Trematoda includes many pathogenic representatives. Main subject of this thesis, avian schistosome Trichobilharzia regenti, is a close relative to the important human pathogen Schistosoma mansoni (family Schistosomatidae). In vitro cultivation of trematodes enables closer understanding of their biology and parasite- host interactions; however, no trematode species has been successfully kept in vitro from the egg stage to the adults producing eggs. Many studies are focused on the problematic of S. mansoni cultivation, but data concerning T. regenti cultivation remain scarce. Only the ability of T. regenti cercariae to transform into schistosomula in vitro was documented, with following survival in a culture medium for a few days. Comparison of eight transformation methods was performed with T. regenti cercariae. Based on the number of tailless cercarial bodies obtained, five transformation methods were selected for further evaluation of the early schistosomula characteristics (glycocalyx shedding, penetration glands emptying and survival in vitro). It was observed that the largest quantity of cercarial bodies can be obtained by using a syringe needle or the BeadBeater cell disrupter. The largest quantity of schistosomula meeting the criteria of early schistosomulum was recorded after...