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Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2004. / Härtill 4 uppsatser.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-02-19T13:49:54Z No. of bitstreams: 1 Gabrielle Viana Martins Gonçalves Geração...2015.pdf: 6199357 bytes, checksum: 605427028fc638e77cf5015ba759917c (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-02-19T13:50:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Gabrielle Viana Martins Gonçalves Geração...2015.pdf: 6199357 bytes, checksum: 605427028fc638e77cf5015ba759917c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-19T13:50:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gabrielle Viana Martins Gonçalves Geração...2015.pdf: 6199357 bytes, checksum: 605427028fc638e77cf5015ba759917c (MD5) Previous issue date: 2015-01 / Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / As células-tronco mesenquimais (CTM) constituem uma ferramenta promissora para o campo de terapia celular. Além de seu potencial de diferenciação em diferentes tipos celulares, as CTM apresentam a habilidade de secretar moléculas bioativas e, assim, exercer múltiplos efeitos biológicos, tais como indução da regeneração de tecidos lesionados, redução de fibrose e modulação do sistema imune. A superexpressão dos fatores de crescimento G-CSF e IGF-1, conhecidos por seus efeitos sobre os processos de imunomodulação, sobrevivência celular e reparo tecidual, pode ampliar as ações terapêuticas das CTM. O objetivo deste trabalho consiste em gerar e caracterizar linhagens de CTM de camundongo superexpressando hGCSF ou hIGF-1. Um sistema lentiviral de segunda geração foi utilizado para modificação de CTM para expressão ectópica dos genes de interesse. As sequências codificantes de hG-CSF e hIGF-1 foram amplificadas por PCR e subclonadas em um vetor lentiviral de transferência, contendo um promotor constitutivo. As partículas lentivirais foram produzidas a partir da cotransfecção de células da linhagem HEK293FT com os vetores constituintes do sistema lentiviral. Em seguida, as CTM obtidas da medula óssea de camundongos transgênicos para proteína fluorescente verde (GFP) foram transduzidas com partículas lentivirais infectantes contendo hG-CSF ou hIGF-1. A expressão gênica de hG-CSF ou hIGF-1 pelas linhagens geradas foi quantificada por qRTPCR, e a produção da proteína por ELISA. As linhagens foram caracterizadas por imunofenotipagem e avaliadas quanto ao seu potencial de diferenciação celular. Foram geradas duas linhagens de CTM superexpressando hG-CSF e três linhagens superexpressando hIGF-1. Todas demonstraram por qRTPCR, estar efetivamente expressando os genes de interesse. Foi possível detectar e quantificar a síntese proteica de G-CSF e IGF-1. Todas as linhagens geradas foram capazes de se diferenciar em osteócitos, condrócitos e adipócitos, demonstrando a manutenção de seu fenótipo estromal. Neste contexto, este trabalho resultou em ferramentas funcionais para a avaliação dos efeitos terapêuticos de IGF-1 e G-CSF combinados à CTM, em modelos de lesões animais, em comparação com CTM não-modificadas geneticamente. Além disso, estas ferramentas poderão ser empregadas em estudos de pesquisa básica, para melhor compreensão dos efeitos de hIGF-1 e hG-CSF sobre a biologia das CTM. / Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising tool for the cell therapy field. In addition to their potential for differentiation into different cell types, MSCs have the ability to secrete bioactive molecules and thus exert multiple biological effects such as induction of the injured tissue regeneration, fibrosis reduction and modulation of the immune system. The overexpression of the growth factors G-CSF and IGF-1, known for their effects on immune modulation processes, cell survival and tissue repair, can result in a magnification of MSCs' therapeutic actions. The objective of this work is to generate and characterize mouse MSCs lines overexpressing hG-CSF or hIGF-1. A second generation lentiviral system was used to modify MSCs derived from mice for the ectopic expression of the genes of interest. The coding sequences of hG-CSF and hIGF-1 were amplified by PCR and subcloned into a lentiviral transfer vector containing a constitutive promoter. The lentiviral particles were produced from the co-transfection of HEK293FT lineage cells with the lentiviral vectors. Subsequently, MSCs obtained from the bone marrow of transgenic mice for green fluorescent protein (GFP) were transduced with infectious lentiviral particles containing hG-CSF or hIGF-1. The gene expression of hG-CSF or hIGF-1 by the generated cell lines was quantified by qRTPCR, and the protein production by ELISA. The lineages were characterized by immunophenotyping and evaluated for their potential of cellular differentiation. Two lines of MSCs overexpressing hG-CSF and three lines overexpressing hIGF-1 were generated. All the cell lines demonstrated to be effectively expressing the genes of interest by qRTPCR. It was possible to detect and quantify the protein synthesis of G-CSF and IGF-1. Moreover, all the generated lines were capable of differentiating into osteocytes, chondrocytes and adipocytes, indicating the conservation of their stromal phenotype even after genetic modification. In this context, this study resulted in functional tools for evaluating the IGF-1 and G-CSF therapeutic effects when combined with MSCs, to be tested in experimental animal models in comparison to non-genetically modified MSCs. Furthermore, these tools may be employed for basic research studies, for a better understanding of the effects of hIGF-1 and hG-CSF on MSCs' biology

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T17:19:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simoes_GustavoFerreira_D.pdf: 65115196 bytes, checksum: 18f51cababf3e248cceb806b8faef631 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Atualmente, muito se sabe sobre o acometimento muscular na DMD, mas poucos estudos estão voltados para os efeitos no Sistema Nervoso Central (SNC), mais especificamente no microambiente do motoneurônio medular. Sabe-se que durante a evolução da doença, o terminal axonal, na junção neuromuscular, entra em um ciclo de denervação (retração) e reinervação (brotamento). A possibilidade de modulação do MHC I se apresenta como uma nova estratégia de influenciar positivamente o processo de plasticidade sináptica após lesões do Sistema Nervoso Periférico (SNP) e SNC. Tal modulação pode ser realizada através da utilização ou desenvolvimento de drogas específicas. O fator estimulador de colônias glanulocitárias (G-CSF) é uma glicoproteína que foi descrita há mais de vinte anos, possui aprovação do ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) e é comumente utilizada para tratar neutropenia, ou para transplantes de medula óssea. O GCSF possui um efeito neuroprotetor aparentemente multimodal, incluindo-se a atividade anti-apoptóptica em neurônios, regeneração da vascularização, efeito antiinflamatório e estimulação de neurogênese endógena, sendo capaz de atuar efetivamente no processo de regeneração do sistema nervoso. No presente trabalho, foram utilizados camundongos MDX. Os camundongos foram distribuídos em 4 grupos (axotomia + G-CSF; Axotomia; Controle + G-CSF e Controle), com n=10. Incluiu-se para imunoistoquímica o grupo placebo, onde os animais receberam uma dose diária de 200?m, via subcutânea, de glicose a 25%. Nossos resultados indicam que redução de sinapses nos motoneurônios alfamedulares e aumento da astrogliose circunjacente aos neurônios alfa-medulares, seja decorrente da desconexão parcial entre o orgão alvo e o corpo neuronal durante o período de ciclos de degeneração/regeneração muscular que ocorrem a partir das primeiras semanas de vida nos camundongos MDX. Estes ciclos podem repercutir retrogradamente nos corpos celulares dos motoneurônios alfa-medulares, provocando uma série de alterações denominadas cromatólise. A axotomia do nervo isquiático resulta num aumento significativo da expressão de MHC I nas duas linhagens estudadas. Contudo, nos animais MDX, este aumento é menor, comparativamente à linhagem C57BL/10. Quando tratados com G-CSF a expressão de MCH I ficou maior em relação aos grupos não tratados e, isso pode indicar um papel ativo da droga no potencial regenerativo após a lesão. Também podemos sugerir que, apesar dos animais MDX apresentarem uma menor função motora em relação aos animais controle, os resultados indicam que o tratamento com G-CSF é capaz de reduzir os efeitos inflamatórios e atuar positivamente no processo de regeneração nervosa periférica após esmagamento do nervo isquiático / Abstract: Currently, much is known about the muscular involvement in DMD, but few studies have focused on the effects on the central nervous system (CNS), specifically in the microenvironment of spinal motor neurons. It is known that during the course of the disease, the axon terminal at the neuromuscular junction, enters a cycle of denervation (retraction) and reinnervation (sprouting). The possibility of modulation of MHC I presents itself as a new strategy to positively influence the process of synaptic plasticity after injury Peripheral Nervous System (PNS) and CNS. Such modulation may be accomplished through the use or development of special drugs. The granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) is a glycoprotein which was first described more than twenty years, has approval from ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) and is commonly used to treat neutropenia, or bone marrow transplants. The G-CSF has a multimodal neuroprotective effect l, including the anti-apoptotic activity in neurons, regeneration of vascularization, anti-inflammatory effect and stimulation of endogenous neurogenesis, being able to act effectively in the process of regeneration of the nervous system. In this study, we used MDX mice. The mice were divided into 4 groups (axotomy + G-CSF; axotomy, Control + G-CSF and Control), with n = 10. Included immunohistochemistry to the placebo group, where the animals received a daily dose of 200?m, subcutaneously, glucose 25%. Our results indicate that reduction of synapses in the alpha motoneurosn and increased astrogliosis , either due to partial disconnection between the target organ and the neuronal body during the cycles of degeneration /regeneration muscle that occur from first weeks of life in MDX mice. These cycles can pass retrogradely in alpha motoneurons cell bodies, causing a series of changes called chromatolysis. The sciatic nerve axotomy results in a significant increase of MHC I expression in both strains studied. However, in MDX strain, this increase is smaller, compared to C57BL/10. After treatment with G-CSF the expression of MCH I got bigger compared to untreated groups, and this may indicate an active role in the regenerative potential of the drug after injury. Also we suggest that while the animals present MDX a smaller motor function compared to control animals, the results indicate that treatment with G-CSF is capable of reducing the inflammatory effects and act positively on peripheral nerve regeneration process after nerve crush sciatic. Also our results indicate that treatment with G-CSF is able to reduce the inflammatory effects and act positively on peripheral nerve regeneration process after nerve crush sciatic / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador : Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T00:27:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Freria_CamilaMarques_D.pdf: 9799936 bytes, checksum: 9a9057c6ab5ca87ea1bc6767c4f71490 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Lesões nervosas periféricas e centrais levam à inflamação local e retrógrada, resultando em alterações axonais, perdas neuronais e sinápticas significativas. Juntamente a tais alterações, as células gliais tornam-se reativas, influenciando na remodelação do SNC após lesão. Os mecanismos que desencadeiam tais mudanças não são completamente compreendidos, mas é evidente que as moléculas classicamente relacionadas com o sistema imune estão envolvidas em tais eventos diretamente ou através da modulação da reatividade glial. Assim, nossa hipótese é que o controle da sinalização inflamatória após a lesão central ou periférica possa afetar indiretamente nos mecanismos endógenos de reparação no SNC, resultando em maior preservação das conexões neurais e melhor recuperação funcional. Para isso, realizamos lesões periféricas e centrais expondo os animais a diferentes microambientes de lesão a fim de investigar o papel das células gliais na sobrevivência, capacidade regenerativa axonal e estabilidade sináptica de motoneurônios medulares. Os resultados mostraram que, após lesão, a modulação da sinalização inflamatória através da administração de citocinas ou deleção de moléculas expressas na superfície das células gliais podem influenciar direta ou indiretamente na estabilidade dos circuitos neuronais, na regeneração axonal e sobrevivência neuronal. Desse modo, conclui-se que o controle da inflamação e da reatividade glial são, provavelmente, críticos para a plasticidade no Sistema Nervoso viabilizando, assim, novas estratégicas de tratamentos / Abstract: Central or peripheral lesions result in local and retrograde inflammation, leading to axonal degeneration, synaptic and/or neuronal loss. Additionally, after injury, reactive glial cells are recruited to the lesion site, influencing the plasticity of the nervous system. The mechanisms which trigger such changes are not completely understood, but evidences have shown that molecules classically related to the immune system are involved in such events directly or indirectly by glial modulation. Based on this, our hypotheses is that the control of inflammatory signaling after central or peripheral injury may indirectly affect the endogenous repair mechanisms, resulting in a greater synaptic preservation and better functional recovery. In this sense, animals were submitted to both central and peripheral lesions in order to investigate the effects of glial cells on neuron survival, axonal regeneration and synaptic plasticity. The results showed that, after lesion, the modulation of inflammatory signaling by cytokines or knocking down molecules on glial surface, directly or indirectly influence the stability of neural circuits, neuronal survival and axonal regeneration. Thus, we believe that this is important findings that may be critical to the development of new therapeutic strategies following nervous system injury / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Ciências

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) is a hematopoietic cytokine that stimulates and regulates the proliferation and differentiation of neutrophils precursors cells of the bone marrow. The recombinant hormone (rhG-CSF) non-glycosylated, filgrastim, is used to treat the neutropenia induced by chemotherapy and bone marrow transplantation. The hydrophobic protein is a 175 aminoacids chain which contains an extra methionine at its N-terminus, and molecular weight of 18.8 kDa. In the present study, a capillary zone electrophoresis (CZE) method was developed and validated for the analysis of filgrastim in pharmaceuticals. The analyses were performed on a fused-silica capillary (75 μm i.d.; effective length, 72 cm) and background electrolyte consisted of 50 mM sodium tetraborate solution at pH 9.0. The capillary temperature was maintained at 15 °C and the applied voltage was 15 kV. The injection was performed using the hydrodynamic mode at 50 mbar for 6 s, with detection at 195 nm using a PDA detector. The electrophoretic separation was obtained with migration time of 21.8 and 15.8 minutes for the filgrastim and leuprorrelin acetate (internal standard), respectively, and with run time of 30 minutes. The procedure was validated by the parameters of specificity, linearity, precision, accuracy, robustness, limit of quantitation and limit of detection. The method was linear in the concentration range of 1 200 μg/mL (r2 = 0.9978) and the limit of quantitation (LOQ) was 1 μg/mL, with acceptable validation parameters. The method was applied for the analysis of pharmaceutical formulations, and the results were correlated to the reversed-phase HPLC method (RP-HPLC), size-exclusion HPLC method (SE-HPLC) and in vitro bioassay method. Therefore, the procedures represent valid alternatives which can improve the quality control, assuring the safety and therapeutic efficacy of the biological product. / O fator estimulador da colônia de granulócitos humanos é uma citocina hematopoiética que estimula e regula a proliferação e diferenciação de células precursoras de neutrófilos da medula óssea. O hormônio recombinante (rhG-CSF) sob a forma não-glicosilada, filgrastima, é usado para o tratamento de neutropenia induzida por quimioterapia e transplante de medula óssea. A proteína hidrofóbica é constituída por uma cadeia de 175 aminoácidos com uma metionina N-terminal, e massa molecular de 18,8 kDa. No presente estudo, foi desenvolvido e validado método por eletroforese capilar de zona (CZE) para determinação de filgrastima em formulações farmacêuticas. As análises foram realizadas em capilar de sílica fundida (comprimento efetivo de 72 cm e diâmetro interno de 75 μm) e solução eletrolítica composta de tetraborato de sódio 50 mM, pH 9,0. O capilar foi mantido a temperatura de 15 °C, e a tensão aplicada foi de 15 kV. O tempo de injeção foi de 6 s, com pressão de 50 mbar, e detecção por arranjo de diodos (DAD) a 195 nm. A separação eletroforética foi obtida com tempo de migração de 21,8 e 15,8 minutos para filgrastima e acetato de leuprorrelina (padrão interno), respectivamente, e tempo total de corrida de 30 minutos. O procedimento foi validado, avaliando-se os parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez, limite de quantificação e limite de detecção. Demonstrou-se linearidade na faixa de concentração de 1 200 μg/mL (r2 = 0,9978) e limite de quantificação (LQ) de 1 μg/mL, com os demais parâmetros de validação aceitáveis. O método foi aplicado para análise de formulações farmacêuticas, e os resultados foram correlacionados com os obtidos por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) e por exclusão molecular (CLEM), e pelo bioensaio in vitro. Deste modo, os procedimentos pesquisados contribuem para o estabelecimento de alternativas que aprimoram o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biológico.