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<p>Normally, neutrophil pools are maintained by "steady-state" granulopoiesis. Infections and inflammation, however, trigger neutrophilias that are supported by a hematopoietic program of accelerated granulopoiesis known as "emergency" granulopoiesis. Steady-state and emergency granulopoiesis are thought to depend on distinct members of the CCAAT enhancer binding protein (C/EBP) family of transcription factors, yet the extracellular cues that determine these developmental pathways are unclear. I hypothesize that inflammation elicits IL-1 which acts directly on hematopoietic progenitor cells for the induction of emergency granulopoiesis. Indeed, IL-1RI<super>-/-</super> mice fail to mount reactive neutrophilias in response to adjuvant-induced inflammation. Analysis of this specific impairment revealed an unanticipated role for IL-1RI in supporting increased proliferation by granulocyte/macrophage progenitors (GMP) and, surprisingly, more primitive multipotent progenitors (MPP) and hematopoietic stem cells (HSC). Whereas IL-1 drives HSC proliferation directly <italic>in vitro</italic>, inflammation induces comparable rates of proliferation in IL-1RI deficient and -sufficient HSC, MPP, and GMP in mixed chimeric mice. Thus, IL-1RI signals play a necessary, but indirect role in the support of alum-induced neutrophilias by expanding both pluripotent and myeloid progenitor compartments to accelerate granulopoiesis.</p><p>The lack of alum-induced neutrophilia in IL-1RI<super>-/-</super> mice is due to defective mobilization of bone marrow (BM) neutrophils and impaired proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC). Coincident defects in neutrophil mobilization and HSPC proliferation suggest that the trigger for emergency granulopoiesis might be the exhaustion of neutrophil compartments rather than inflammatory inductions of growth factors. Consistent with this hypothesis, non-inflammatory reductions in BM neutrophil numbers elicit granulopoietic responses similar to those induced by adjuvant. Alum mobilizes BM neutrophils via G-CSF, but increased HSPC proliferation results from a density-dependent mechanism that is only partially dependent on G-CSF. Notably, C/EBP&beta;, thought to be necessary for enhanced generative capacity of BM, is dispensable for increased proliferation of HSPC, but plays a role in the terminal differentiation of neutrophils. These observations indicate that the draining of BM neutrophil pools is sufficient to activate a latent, homeostatic mechanism of accelerated granulopoiesis. I propose a common model for the regulation of neutrophil production that explains both steady-state and emergency granulopoiesis through negative feedback.</p> / Dissertation

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L’hématopoïèse regroupe l'ensemble des mécanismes qui assurent le renouvellement continu et régulé des cellules sanguines, à partir des cellules souches hématopoïétiques. La différenciation des cellules souches en cellules matures est un phénomène finement orchestré par divers signaux (facteurs de croissance, hormones, cytokines et microenvironnement médullaire) capables de stimuler la prolifération de cellules quiescentes ainsi que leur engagement dans diverses voies de la maturation hématopoïétique. Ces processus sont généralement régulés via l’activation de facteurs de transcription, mais également par des mécanismes épigénétiques. Le gène RINF/CXXC5 a initialement été décrit comme essentiel pour les processus de différenciation granulocytaire normale. Toutefois, son implication dans d’autres voies de l’hématopoïèse n’avait pas été étudiée. Afin de définir son rôle dans la différenciation et l’engagement vers des lignages hématopoïétiques autres que la voie granulocytaire, notamment érythroïde et monocytaire, sa contribution fonctionnelle dans des lignées hématopoïétiques et dans des cellules primaires CD34+ de moelle osseuse (donneurs sains) a été étudiée par une approche de perte ou gain de fonction. Ces expériences, dans des modèles de la voie granulocytaire (lignée NB4 et HL60 traitées par les rétinoïdes) et de la voie érythroïde (lignées K562 et UT7/GM traitées par l’hémine ou l’EPO) démontrent l’implication de RINF dans la maturation terminale de ces deux lignages. Ces données ont ensuite été validées dans des progéniteurs hématopoïétiques (tests clonogéniques) où l’expression de RINF favorise la différenciation granuleuse et interfère négativement avec la différenciation érythroïde, sans impacter la voie monocytaire. En effet, l’extinction de son expression diminue le nombre des colonies granuleuses et augmente le nombre de colonies érythroïdes. Des dérégulations au niveau de l’expression des facteurs ou co-facteurs de trancription qui régulent l’hématopoïèse peuvent aboutir à des hémopathies, telles que les Leucémies Aiguës Myéloïdes. Ces pathologies sont la résultante de l’association d’une augmentation de la prolifération cellulaire et d’un blocage des processus de différenciation. Au vu de son rôle important au cours de la granulopoïèse et de l’érythropoïèse, l’hypothèse que des dérégulations de RINF pourraient intervenir dans les processus de leucémogenèse a été testée par l’étude de son niveau d’expression dans les différentes Leucémies Aiguës Myéloïdes. Ainsi, il a été démontré que parmi les patients dont le niveau d’expression de RINF est le plus élevé, le pronostic vital est mauvais, associé à une résistance aux traitements chimiothérapeutiques. L’ensemble de ces données a permis d’aboutir à la conclusion que des dérégulations de l’expression de RINF pourraient contribuer au processus de leucémogenèse, et qu’ainsi RINF pourrait être une potentielle cible thérapeutique dans le cadre des LAM. D’un point de vue moléculaire, le mode d’action de la protéine RINF reste à ce jour du domaine de l’hypothèse, mais la présence d’un doigt de zinc de type CXXC lui permettrait d’intervenir dans des mécanismes des régulations épigénétiques, tels que la méthylation de l’ADN. Une meilleure compréhension des mécanismes régulés par la protéine pourrait permettre à terme une meilleure compréhension des régulations de l’hématopoïèse, voire des processus de leucémogenèse. / During hematopoiesis, hematopoietic stem cells (HSC) differentiation is orchestred by different signals, able to stimulate cell proliferation of quiescent cells, and their commitment in the different hematopoietic lineages. These process are regulated by transcription factors activation, as well by epigenetic mecanisms. By a microarray approach, we have identified a novel retinoid-responsive gene (CXXC5) encoding a Retinoid-Inducible Nuclear Factor (RINF) that plays an essential role during in vitro human hematopoiesis. Indeed, expression studies and gene silencing experiments both demonstrate RINF requirement during in vitro terminal differentiation of myeloid leukemia cells (NB4, HL60), but also during normal myelopoiesis of bone marrow progenitors (CD34+ HSPC cells in presence of cytokines). In the present study, we demonstrate that in cell lines, RINF overexpression provokes an earlier myeloid differentiation under retinoids treatement and slow-downs erythroid maturation induced by hemin whereas its down-regulation accelerates erythroid terminal differentiation. In normal CD34+ HSCP, we demonstrated that RINF down regulation (1) promotes differentiation in erythroid lineage at the expense of granulocyte lineage, and (2) accelerates terminal erythroid differentiation. Overexpression, contribute to promote myeloid pathway even though cells are in erythroid conditions. Because of its role during hematopoiesis regulation and its gene localization in 5q31.2, we investigated CXXC5/RINF expression in primary human acute myeloid leukemia (AML) cells derived from 594 patients. A wide variation in CXXC5/RINF mRNA levels was observed in the immature leukemic myeloblasts. Furthermore, patients with low-risk cytogenetic abnormalities showed significantly lower levels compared to patients with high-risk abnormalities, and high RINF/CXXC5/ mRNA levels were associated with decreased overall survival for patients receiving intensive chemotherapy for newly diagnosed AML. CXXC5/RINF knockdown in AML cell lines caused increased susceptibility to chemotherapy-induced apoptosis, and regulation of apoptosis also seemed to differ between primary human AML cells with high and low RINF expression. The association with adverse prognosis together with the antiapoptotic effect of CXXC5/RINF suggests that targeting of CXXC5/RINF should be considered as a possible therapeutic strategy, especially in high-risk patients who show increased expression in AML cells compared with normal hematopoietic cells.

Neutrophils, known primarily as key players in defense against invading pathogens, represent an essential component of both the innate and adaptive immunity. Continuous production of large quantities of neutrophils is ensured by a complex process termed granulopoiesis. In order to maintain a stable neutrophilic population, granulopoiesis requires to be tightly regulated. Moreover, impaired granulopoiesis may lead to aberrant bone marrow function and, ultimately, give rise to acute myeloid leukemia (AML). Despite decades of research, the mechanisms regulating granulopoiesis are still unclear. In particular, the CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) family of transcription factors plays a critical role in this process. C/EBPα acts as a master regulator of granulopoiesis mainly by orchestrating expression of its target genes, which will mediate granulocytic differentiation. Thus, characterization of novel C/EBPα target genes is critical for a better understanding of the molecular mechanisms that regulate granulopoiesis. Previously, we showed that another C/EBP member, CEBPG, is a direct target of C/EBPα. In the first part of the present work, we addressed the unknown role of C/EBPγ in granulopoiesis. We observed that Cebpg conditional knockout (KO) mice, which have the Cebpg gene ablated specifically...

Se realizó el estudio histológico del timo de lubina, con el fin de conocer la arquitectura del microambiente tímico y las relaciones estructurales de sus diferentes componentes. Las células linfoides sufren procesos de muerte celular programada por apoptosis, no descrita previamente en timo de peces; indicando la existencia de procesos de selección negativa durante su diferenciación intratímica. Existen células interdigitadas, no descritas previamente en peces. Hay áreas mielopoyéticas, con actividad eritropoyética y granulopoyética heterófila. La fragilidad de la barrera epitelial, que separa la cavidad branquial del parénquima tímico, puede verse incrementada por la presencia de macrófagos intraepiteliales y macrófagos con inmunoglobulinas de superficie. El transito de células sanguíneas a través de la capa de células epitelio-reticulares limitantes y de capilares sanguíneos indican la carencia de barrera hematotímica. Estos datos sugieren la existencia de procesos antígen o dependiente y la persistencia de funciones propias de órgano linfoide secundario en timo de lubina. / The histological study of the sea bass thymus was performed to know the architecture of the thymic microenvironment and the structural relationships of its different components. The lymphoid cells suffer processes of programmed cell death by apoptosis, not described previously in fish thymus, indicating the existence of negative selection processes during its intrathymic differentiation. There are interdigitating cells, which has not described before in fish. Exist myelopoiesis areas, with erythropoietic and heterophilic granulopoietic activity. The fragility of the epithelial barrier, that separates the branchial cavity from the thymic parenchyma, is increased by the presence of intraepithelial macrophages and macrophages with surface immunoglobulins. The traffic of blood cells across the layer of limiting reticular epithelial cells and blood capillaries indicate the lack of hemato-thymic barrier. This information suggests the existence of antigen dependent process and the p ersistence of own functions of secondary lymphoid organ in thymus of sea bass.

Granulocytes represent the first line of defense against bacteria and fungi. Daily production of granulocytes is sustained by steady state granulopoiesis but under stress (e.g., bacterial infection) this program switches to emergency granulopoiesis (EG) which ensures the production of granulocytes at enhanced and accelerated rates. Very little is known about the regulation of EG. In this thesis, we showed that disruption of the β-catenin-TCF/LEF mediated transcription impairs EG in vivo. Further, we demonstrated that lipopolysaccharide (LPS) administration in mice induces accumulation of active β-catenin in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) as early as 4 hours (H) after stimulation, with highest increase at 24H. This effect was at least partially mediated in a niche independent manner, since LPS stimulation in vitro induced β-catenin accumulation in c-Kit+ cells after 2H, with a peak activation at 4H. Using single cell RNA sequencing, we determined the cell cluster dynamics of HSPCs following 4H LPS stimulation. Interestingly, we identified a possible upstream activator of β- catenin in one of the clusters - Wnt10b. Indeed, Wnt10b showed a similar expression pattern as EG master regulator Cebpb and β-catenin activation, following in vitro treatment with LPS. Altogether, our data point...

La diminution des doses administrées ou même la cessation complète d'un traitement chimiothérapeutique est souvent la conséquence de la réduction du nombre de neutrophiles, qui sont les globules blancs les plus fréquents dans le sang. Cette réduction dans le nombre absolu des neutrophiles, aussi connue sous le nom de myélosuppression, est précipitée par les effets létaux non spécifiques des médicaments anti-cancéreux, qui, parallèlement à leur effet thérapeutique, produisent aussi des effets toxiques sur les cellules saines. Dans le but d'atténuer cet impact myélosuppresseur, on administre aux patients un facteur de stimulation des colonies de granulocytes recombinant humain (rhG-CSF), une forme exogène du G-CSF, l'hormone responsable de la stimulation de la production des neutrophiles et de leurs libération dans la circulation sanguine. Bien que les bienfaits d'un traitement prophylactique avec le G-CSF pendant la chimiothérapie soient bien établis, les protocoles d'administration demeurent mal définis et sont fréquemment déterminés ad libitum par les cliniciens. Avec l'optique d'améliorer le dosage thérapeutique et rationaliser l'utilisation du rhG-CSF pendant le traitement chimiothérapeutique, nous avons développé un modèle physiologique du processus de granulopoïèse, qui incorpore les connaissances actuelles de pointe relatives à la production des neutrophiles des cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse. À ce modèle physiologique, nous avons intégré des modèles pharmacocinétiques/pharmacodynamiques (PK/PD) de deux médicaments: le PM00104 (Zalypsis®), un médicament anti-cancéreux, et le rhG-CSF (filgrastim). En se servant des principes fondamentaux sous-jacents à la physiologie, nous avons estimé les paramètres de manière exhaustive sans devoir recourir à l'ajustement des données, ce qui nous a permis de prédire des données cliniques provenant de 172 patients soumis au protocol CHOP14 (6 cycles de chimiothérapie avec une période de 14 jours où l'administration du rhG-CSF se fait du jour 4 au jour 13 post-chimiothérapie). En utilisant ce modèle physio-PK/PD, nous avons démontré que le nombre d'administrations du rhG-CSF pourrait être réduit de dix (pratique actuelle) à quatre ou même trois administrations, à condition de retarder le début du traitement prophylactique par le rhG-CSF. Dans un souci d'applicabilité clinique de notre approche de modélisation, nous avons investigué l'impact de la variabilité PK présente dans une population de patients, sur les prédictions du modèle, en intégrant des modèles PK de population (Pop-PK) des deux médicaments. En considérant des cohortes de 500 patients in silico pour chacun des cinq scénarios de variabilité plausibles et en utilisant trois marqueurs cliniques, soient le temps au nadir des neutrophiles, la valeur du nadir, ainsi que l'aire sous la courbe concentration-effet, nous avons établi qu'il n'y avait aucune différence significative dans les prédictions du modèle entre le patient-type et la population. Ceci démontre la robustesse de l'approche que nous avons développée et qui s'apparente à une approche de pharmacologie quantitative des systèmes (QSP). Motivés par l'utilisation du rhG-CSF dans le traitement d'autres maladies, comme des pathologies périodiques telles que la neutropénie cyclique, nous avons ensuite soumis l'étude du modèle au contexte des maladies dynamiques. En mettant en évidence la non validité du paradigme de la rétroaction des cytokines pour l'administration exogène des mimétiques du G-CSF, nous avons développé un modèle physiologique PK/PD novateur comprenant les concentrations libres et liées du G-CSF. Ce nouveau modèle PK a aussi nécessité des changements dans le modèle PD puisqu’il nous a permis de retracer les concentrations du G-CSF lié aux neutrophiles. Nous avons démontré que l'hypothèse sous-jacente de l'équilibre entre la concentration libre et liée, selon la loi d'action de masse, n'est plus valide pour le G-CSF aux concentrations endogènes et mènerait en fait à la surestimation de la clairance rénale du médicament. En procédant ainsi, nous avons réussi à reproduire des données cliniques obtenues dans diverses conditions (l'administration exogène du G-CSF, l'administration du PM00104, CHOP14). Nous avons aussi fourni une explication logique des mécanismes responsables de la réponse physiologique aux deux médicaments. Finalement, afin de mettre en exergue l’approche intégrative en pharmacologie adoptée dans cette thèse, nous avons démontré sa valeur inestimable pour la mise en lumière et la reconstruction des systèmes vivants complexes, en faisant le parallèle avec d’autres disciplines scientifiques telles que la paléontologie et la forensique, où une approche semblable a largement fait ses preuves. Nous avons aussi discuté du potentiel de la pharmacologie quantitative des systèmes appliquées au développement du médicament et à la médecine translationnelle, en se servant du modèle physio-PK/PD que nous avons mis au point. / Dose-limitation or interruption of chemotherapeutic treatment is most often prompted by a decrease in circulating neutrophils, the most abundant white blood cell in the human body. Myelosuppression, or a reduction in absolute neutrophil counts (ANCs) by anti-cancer treatments, is precipitated by the nonspecific killing effect of chemotherapeutic drugs which have toxic effects on noncancerous cells. To mitigate this myelosuppressive effect, patients are frequently administered recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (rhG-CSF), an exogenous form of the cytokine G-CSF, which stimulates neutrophil production and release into the blood stream. While the benefits of adjuvant treatment rhG-CSF during chemotherapy are well recognised, the protocols with which it is administered are not well defined and are frequently determined ad libitum by clinicians. To quantify and address the optimisation of the administration of rhG-CSF during chemotherapeutic treatment, we developed a physiological model of granulopoiesis which incorporates the contemporary understanding of the production of neutrophils from the hematopoietic stem cells in the bone marrow. To this physiological model, we incorporated mechanistic pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) models of two drugs, PM00104 (Zalypsis), a chemotherapeutic drug, and rhG-CSF (filgrastim). Through exhaustive parameter estimation using first principles and no data fitting, we successfully predicted clinical data from 172 patients for an average patient undergoing the CHOP14 protocol (6 cycles of 14-day periodic chemotherapy with rhG-CSF administered on days 4-13 post-chemotherapy). We then demonstrated that delaying the administration of rhG-CSF to 6 or 7 days post-chemotherapy allowed for a reduction in the number of filgrastim administrations from ten to four or even three while maintaining or improving the neutrophil nadir. We also investigated the effects of PK variability on the model's predictions by incorporating population PK (PopPK) models of both drugs. Using five different variability scenarios and cohorts of 500 in silico patients per scenario, we established that there are no statistically significant differences between a typical patient and the population in the model's predictions with respect to three crucial clinical endpoints, namely the time to ANC nadir, the ANC nadir, and the area under the concentration-effect curve. The model's robustness to PK variability allows for the scaling up from the individual to population level. Motivated by the use of rhG-CSF in other disease-states, namely periodic pathologies like cyclical neutropenia, we next endeavoured to contextualise the model within dynamic diseases. By bringing to light that the cytokine paradigm is broken when exogenous cytokine mimetics are administered, we developed a novel physiological PK model for G-CSF incorporating both unbound and bound concentrations. The updated PK model prompted changes to the PD model since we could now track the concentrations of bound G-CSF. We showed that the mass-action equilibrium hypopthesis for bound and unbound drugs is not valid and led to overestimations of the renal clearance of G-CSF. We also successfully reproduced clinical data in a variety of settings (exogenous G-CSF alone, PM00104 alone, CHOP14 protocol) and clarified the mechanisms underlying the body's response to both drugs. Lastly, we discussed the potential of quantitative systems pharmacology in both drug development and translational medicine by using the physiological PK/PD model we developed.

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Introduction Adipocytes are part of hematopoietic microenvironment, even though they are generally believed to play no active role during hematopoiesis. We have shown that accumulation of fat cells in femoral bone marrow (BM) coincides with increased expression of neuropilin-1 (NP-1), while it is weakly expressed in hematopoietic iliac crest BM. Starting from this observation, we postulated that adipocytes might exert a negative effect on hematopoiesis mediated through NP-1. Material and Methode To test this hypothesis, we set up BM adipocytes differentiated into fibroblast-like fat cells (FLFC), which share the major characteristics of primitive unilocular fat cells, as an experimental model. Results Morphological and immunophenotypic analysis of FLFCs in co-culture with CD34+ cells revealed that FLFCs constitutively produced M-CSF and induced CD34+ differentiation into macrophages independently of cell-to-cell contact. By contrast, granulopoiesis was hampered by cell-to-cell contact but could be restored in transwell culture conditions, together with G-CSF production. Both functions were also recovered when FLFCs cultured in contact with CD34+ cells were treated with an antibody neutralizing NP-1, which proved its critical implication in contact inhibition. Conclusion Our data provide the first evidence that adipocytes exert regulatory functions during hematopoiesis that might be implicated in some pathological processes.