La tumeur des cellules de la granulosa (GCT) représente 5% des cas de cancers ovariens chez la femme. Bien que considérées comme peu malignes, la mort survient dans 80% des cas suite à une recrudescence de la maladie. En dépit de ces statistiques sinistres, peu d’études ont été portées sur ce type de cancer. Le premier objectif de cette étude consistait à élucider les mécanismes moléculaires causant les GCT en démontrant l’implication de la voie de signalisation PI3K/AKT dans leur étiologie. Pour ce faire, nous avons employé la technologie Cre-Lox afin de cibler le gène Pten (antagoniste de cette voie) spécifiquement dans les cellules de la granulosa chez la souris. Ces souris (Ptenflox/flox;Amhr2cre/+) ont occasionnellement développé des GCT, soutenant notre hypothèse de l’importance de la voie PI3K/AKT dans leur étiologie. La voie WNT/CTNNB1 est une autre voie de signalisation qui a récemment été impliquée dans le développement des GCT. Dans le cadre de ce projet, nous avons également testé l’existence possible d’une synergie fonctionnelle entre les voies WNT/CTNNB1 et PI3K/AKT dans le développement de la maladie. Pour ce faire, nous avons créé le modèle transgénique Ptenflox/flox;Ctnnb1flox(ex3)/+;Amhr2cre/+, chez lequel les cellules de la granulosa présentant non seulement une désinhibition de la voie PI3K/AKT, mais aussi une suractivation de la voie WNT/CTNNB1. Tel que prédit, les souris Ptenflox/flox;Ctnnb1flox(ex3)/+;Amhr2cre/+ ont développé une forme de GCT beaucoup plus agressive que celle observée chez les femelles Ptenflox/flox;Amhr2cre/+. Spécifiquement, le développement des tumeurs se déclenchait plus tôt, leur croissance était beaucoup plus rapide, nous avons pu observer des métastases pulmonaires et la dissémination des cellules tumorales dans la cavité péritonéale, et la maladie était invariablement fatale avant l’âge de 8 semaines. Le modèle Ptenflox/flox;Ctnnb1flox (ex3)/+;Amhr2cre/+ a donc servi à démontrer l'existence d'une synergie entre les voies WNT/CTNNB1 et PI3K/AKT dans le développement de la GCT. De façon inattendue, les souris Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ ont aussi présenté un phénotype de sous-fertilité qui n’était pas d’origine ovarienne. Il a récemment été démontré que la souche Amhr2cre dirige l’expression de Cre non seulement aux cellules de la granulosa, mais aussi au stroma utérin et au myomètre. Le second objectif de ce travail était donc de démontrer si et comment le phénotype d’infertilité chez les souris Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ pouvait découler d’un défaut utérin. Lors de l'implantation, les cellules du stroma utérin se différencient en cellules déciduelles pour former la décidua maternelle (DM), qui se régresse ensuite par apoptose afin de faciliter l’invasion des cellules trophoblastiques. De plus, la DM, en collaboration avec le tissu foetal, recrute des uNKs dont le rôle est de remodeler les artères spiralées pour augmenter l’apport sanguin maternel vers le foetus en développement. Nous avons pu démontrer que l'utérus des femelles gestantes Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ présentait une DM anormalement résistante à l'apoptose, moins de uNKs et des artères spiralées non-remodelées. Par conséquent, l’invasion des cellules du trophoblaste était restreinte, compromettant le développement et la survie de l'embryon. Nous avons donc établi pour la première fois l’importance de Pten lors de la décidualisation et de l’invasion du trophoblaste. / The granulosa cell tumor (GCT) represents up to 5% of all ovarian cancer cases in women. Although GCT is characterized as a low-grade malignancy, death occurs in approximately 80% of cases following to the disease’s recurrence. Despite these statistics, very few studies have been dedicated to increasing our understanding of the molecular mechanisms responsible for the development of GCT. The first objective of this work was to elucidate some of these molecular mechanisms by proving the involvement of the PI3K/AKT signaling pathway in the etiology of GCT. To this end, we used Cre-LoxP technology to conditionally target Pten (a PI3K/AKT signaling antagonist) in granulosa cells. These transgenic mice (Ptenflox/flox;Amhr2cre/+) occasionally developed GCT, supporting our hypothesis on the importance of the PI3K/AKT pathway in the etiology of this disease. The WNT/CTNNB1 signaling pathway has also recently been implicated in GCT development. We therefore postulated that a functional synergy may exist between the WNT/CTNNB1 and PI3K/AKT pathways in development of GCT. To test this, we created a second transgenic model (Ptenflox/flox;Ctnnb1flox(ex3)/+;Amhr2cre/+), in which the granulosa cells featured not only a disinhibition of the PI3K/AKT pathway but also a constitutive activation of the WNT/CTNNB1 pathway. As predicted, the Ptenflox/flox;Ctnnb1flox(ex3)/+;Amhr2cre/+ mice developed a form of GCT that was much more aggressive than the one observed in the Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ model. Specifically, the tumors developed sooner, their growth was faster, pulmonary metastases and the seeding of tumor cells in the abdominal cavity were observed, and the disease was invariably fatal by 8 weeks of age. The Ptenflox/flox;Ctnnb1flox(ex3)/+;Amhr2cre/+ model therefore served to demonstrate a synergy between the WNT/CTNNB1 and PI3K/AKT pathways in GCT development. Unexpectedly, the majority of the Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ females presented an infertility phenotype that was not caused by an ovarian defect. Recently, it has been shown that the Amhr2cre strain can direct the Cre activity not only to the granulosa cells but also to the uterine stroma and myometrium. The second objective of this work was therefore to determine if and how the infertility observed in Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ mice could be caused by a uterine defect. During implantation, uterine stromal cells differentiate into decidual cells and form the maternal decidua (MD), which subsequently regresses by apoptosis to facilitate trophoblast invasion. In collaboration with the fetal tissue, the MD also recruits uNKs, which are responsible for spiral artery remodeling that increases maternal blood flow to the developing fetus. We were able to demonstrate that the uteri of pregnant Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ females had a MD that was resistant to apoptosis, less uNKs, and spiral arteries that were not properly remodeled. Consequently, the trophoblast cell invasion was restricted, thereby compromising the development and survival of the embryo. We have therefore established for the first time the importance of Pten during the decidualization of the uterine stroma and trophoblast invasion.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les tumeurs des cellules de la granulosa (GCTs) sont des tumeurs avec un potentiel malin ayant tendance à récidiver, provoquant ainsi la mort dans 80% des cas de stade avancé consécutif à une rechute. Bien que les GCTs représentent 5% des tumeurs ovariennes, peu d’études ont évalué les protocoles de traitement adjuvant pour la maladie avancée ou récurrente. Notre but était d’évaluer l’efficacité de la voie de signalisation du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire A (VEGFA) comme cible pour le traitement de la GCT utilisant le modèle murin transgénique Ptentm1Hwu/tm1Hwu; Ctnnb1tm1Mmt/+; Amhr2tm3(cre)Bhr/+ (PCA) qui reproduit le stade avancé de la maladie humaine. Un anticorps anti-VEGFA a été administré une fois par semaine par voie intrapéritonéale (IP) à partir de 3 semaines d’âge. La thérapie anti-VEGFA a permis une réduction de la taille des tumeurs à 6 semaines d’âge (p<0.05) et une prolongation de la survie des animaux traités, lorsque comparé aux animaux contrôles. L’analyse des GCTs a montré une réduction significative de la prolifération cellulaire (p<0.05) et de la densité microvasculaire (p<0.01) mais aucune différence significative n’a été détectée dans l’apoptose cellulaire. p44/p42 MAPK, un effecteur de la signalisation pour le récepteur 2 de VEGFA (VEGFR2) associé à la prolifération cellulaire, était moins activé dans les tumeurs traitées (p<0.05). Par contre, l’activation d’AKT, un effecteur impliqué dans la survie cellulaire, était similaire d’un groupe à l’autre. Ces résultats suggèrent que l’anticorps anti-VEGFA réduit la prolifération cellulaire et la densité microvasculaire chez les souris PCA par inhibition de la voie de signalisation VEGFR2-MAPK, inhibant ainsi la croissance tumorale. En conclusion, l’efficacité de la thérapie anti- VEGFA mérite d’être évaluée en essais contrôlés randomisés pour le traitement des GCTs chez l’homme. / Ovarian granulosa cell tumors (GCTs) are potentially malignant tumors that have a tendency for late recurrence and cause death in 80% of women with advanced GCT due to recurrent disease. Although GCTs represent 5% of ovarian tumors in women, few studies have evaluated adjuvant treatment protocols for advanced or recurrent disease. Our goal was to determine the potential of targeting the vascular endothelial growth factor A (VEGFA) signaling pathway for the treatment of GCT. We used a genetically engineered mouse model, Ptentm1Hwu/tm1Hwu; Ctnnb1tm1Mmt/+; Amhr2tm3(cre)Bhr/+ (PCA), which imitates the advanced human disease. A monoclonal anti-VEGFA antibody was administered by intra-peritoneal injection once a week beginning at 3 weeks of age. Anti-VEGFA therapy significantly decreased tumor weights by 6 weeks of age (p<0.05) and increased survival in treated animals in comparison to controls. Significant decreases in tumor cell proliferation (p<0.05) and microvessel density (p<0.01), but no significant difference in apoptosis was found in PCA tumors. p44/p42 MAPK, a VEGFA receptor 2 (VEGFR2) signaling effector associated with cell proliferation, was significantly less activated in anti-VEGFA-treated tumors (p<0.05). In contrast, AKT activation, a VEGFR2 signaling effector associated with cell survival was similar among all groups. These results suggest that anti-VEGFA therapy effectively reduces cell proliferation and microvessel density in PCA mice by inhibition of the VEGFR2-MAPK pathway, resulting in inhibition of GCT growth. We conclude that anti-VEGFA therapy merits further investigation in the form of controlled randomized trials for the treatment of human GCT.

Abstract Anti-Müllerian hormone (AMH) was identified originally in connection with its role in male sexual differentiation. In females, AMH is secreted by ovarian granulosa cells of growing follicles and its serum levels correlate well with the remaining number of follicles, thus reflecting ovarian reserve. The aim of this study was to explore the expression and secretion of AMH in human ovarian development and in various disorders resulting in decreased reproductive function. In fetal ovaries, AMH expression was found to be initiated at midgestation and it increased gradually towards term. In serum samples from infant girls, transient postnatal activation of the pituitary-ovarian axis was found and it occurred later in premature infants, reflected in lower serum AMH levels and lower numbers of growing follicles. This immaturity resulted in insufficient feedback from ovary to pituitary and may explain the higher levels of follicle-stimulating hormone (FSH) in these girls. Ovarian follicle reserve is typically diminished in women with primary ovarian insufficiency (POI). Assay of serum AMH may be used to identify women with POI and existing follicles, as women with FSH receptor mutation who were known to have follicles had serum AMH levels in low normal range and girls/women with Turner syndrome mosaicism had higher serum AMH levels compared with those with other karyotypes. The diagnostics and follow-up of ovarian granulosa cell tumors (GCTs) are challenging as a result of the rarity of the disease and late possible recurrences. Assay of serum AMH combined with assay of the currently used marker inhibin B was shown to improve follow-up of GCTs in individual patients, compared with serum inhibin B measurement alone. The analyses revealed that AMH and inhibin B assays perform similarly in detecting macroscopic tumors. Continuous use of combined hormonal contraceptives inhibited ovarian activity independently of the administration route, as serum AMH levels decreased significantly and similarly during oral, transdermal or vaginal administration. The decrease of serum AMH levels indicates that AMH is secreted partially from FSH-dependent follicles. The study provides novel information on AMH secretion in ovarian development, and the use of AMH assay in assessing ovarian reserve and detecting ovarian disorders such as ovarian insufficiency and GCTs. / Tiivistelmä Naisen munasarjassa munarakkuloiden granuloosasolut erittävät anti-Müllerian hormonia (AMH), ja sen pitoisuudet seerumissa heijastavat jäljellä olevien munarakkuloiden määrää. Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin AMH:n eritystä ja ilmentymistä munasarjan kehityksen aikana ja erilaisissa munasarjan toiminnan häiriötiloissa. Tuloksina havaittiin, että AMH:a ilmentyy sikiökaudella munasarjassa jo keskiraskaudesta eteenpäin. Syntymän jälkeen otetuissa seeruminäytteissä todettiin ohimenevä aivolisäkkeen ja munasarjan aktivaatio, joka ilmeni myöhemmin ennenaikaisesti syntyneillä tytöillä. Heillä havaittiin vähemmän kasvavia munarakkuloita ja matalammat seerumin AMH-pitoisuudet syntymän jälkeen kuin täysiaikaisilla tytöillä. Tämä kypsymättömyys johtui todennäköisesti munasarjan riittämättömästä palautejärjestelmästä aivolisäkkeeseen, mikä voi selittää korkeammat follikkelia stimuloivan hormonin (FSH) pitoisuudet ennenaikaisesti syntyneillä tytöillä. Ennenaikainen munasarjojen toiminnan hiipuminen voi johtua esim. kromosomi- tai geenivirheestä. Naisilla, joilla on virheellinen FSH-reseptori, tiedetään olevan munarakkuloita jäljellä, ja tulokset osoittivat seerumin AMH-pitoisuuksien olevan lähes normaali näillä naisilla. Myös tytöillä ja naisilla, joilla on todettu Turnerin oireyhtymän mosaikismi, AMH-pitoisuudet olivat merkittävästi korkeammat verrattuna muihin karyotyyppeihin. Täten AMH-määrityksen avulla voidaan mahdollisesti löytää ennenaikaisesta munasarjojen toiminnan hiipumisesta kärsivien joukosta ne naiset, joilla on vielä jäljellä munarakkuloita. Munasarjan granuloosasolukasvaimen diagnostiikka ja seuranta ovat haastavia kasvaimen myöhäisen uusiutumistaipumuksen ja harvinaisuuden vuoksi. Tulokset osoittivat, että seerumin AMH-määrityksen yhdistäminen tällä hetkellä käytössä olevaan inhibiini B -määritykseen voisi parantaa yksittäisten potilaiden seurantaa makroskooppisen kasvaimen toteamisen osalta. Tutkimus osoitti hormonaalisten yhdistelmäehkäisyvalmisteiden jatkuvan käytön vähentävän munasarjan aktiivisuutta merkittävästi annostelureitistä riippumatta, koska seerumin AMH-pitoisuudet laskivat samalla tavalla ehkäisypilleriä, -rengasta ja -laastaria käyttävillä naisilla. Tutkimus toi uutta tietoa AMH:n erityksestä munasarjan kehityksen aikana sekä AMH-määrityksen käytön mahdollisuuksista munarakkuloiden määrän arvioinnissa ja eri häiriötilojen tunnistamisessa.

Abstract Despite the development of assisted reproduction technologies and significant advances in reproductive biology and medicine over the years the cause of infertility remains unexplained in 10–20% of cases. The cause of infertility in these cases may be connected to problems in fertilization or implantation and genetic factors may play a part in this. The zona pellucida (ZP) is an extracellular matrix surrounding the oocyte and early-stage embryos. It is important for folliculogenesis, fertilization and implantation. In humans, it is composed of four known ZP glycoproteins that all show varying degrees of structural and functional roles in reproduction. The aim of the present study was to examine the role of zona pellucida genes in cases of total fertilization failure and zona anomalies, and to study their expression in human fetal and adult ovaries. A total of 34 sequence variations were detected in genes expressing the four human ZP proteins (ZP1–ZP4) among women with fertilization failure and those with varying degrees of zona anomalies in their oocytes. Most of the variations were known single nucleotide polymorphisms, while three were novel findings. Women with fertilization failure had a higher mean number of sequence variations in ZP1 and ZP3 when compared with controls. Some of the most frequent zona anomalies may be at least partly explained by sequence variations in ZP1–ZP4 genes. In fetal life, the expression of ZP3 protein and mRNA could already be detected as early as at the 11th week of gestation and it peaked at the 20th week, the time of primordial follicle formation. This suggests that components needed for zona matrix are already present well before the formation of the zona pellucida and may have a role in the development of primordial follicles. Expression of the transcription factor FIGLA (factor in the germline alpha) was increased at around the 20th week of gestation, supporting previous findings of its critical role in the initiation of folliculogenesis and primordial follicle formation. The present study adds to our knowledge on the currently still incomplete picture of formation of the ZP and fertilization in humans. Understanding the genetic background of infertile patients may help us to develop new tools not only to evaluate but also to improve their fertilization potential, and to choose the optimal treatment to achieve pregnancy. / Tiivistelmä Diagnostiikan kehityksestä huolimatta hedelmättömyyden syy jää edelleen epäselväksi 10–20 %:ssa tapauksista. Niissä hedelmättömyyden taustalla voivat olla munasolun hedelmöittymiseen ja kohtuun kiinnittymiseen liittyvät ongelmat, jotka voivat osittain johtua geneettisistä syistä. Alkiokuori on munasolua ja varhaista alkiota ympäröivä rakenne, joka osallistuu munarakkulan kehittymiseen, munasolun hedelmöittymiseen ja alkion tarttumiseen kohdun limakalvolle. Ihmisellä alkiokuori muodostuu neljästä tunnetusta alkiokuoriproteiinista (ZP1–ZP4). Tutkimuksessa selvitettiin alkiokuoriproteiineja koodittavien geenien vaikutusta hedelmällisyyteen potilailla, joilla koeputkihedelmöitys ei ollut tuottanut yhtään hedelmöittynyttä munasolua (engl. total fertilization failure, TFF) tai joiden munasoluissa havaittiin alkiokuoren rakennemuutoksia (engl. zona anomalies, ZA). Lisäksi selvitettiin alkiokuoriproteiinien ja niiden lähetti-RNA:n esiintymistä sikiöiden ja aikuisten munasarjoissa. TFF- ja ZA-potilaiden alkiokuoriproteiineja koodittavista geeneistä löytyi yhteensä 34 nukleotidimuutosta. Muutoksista kolme oli uusia löydöksiä, mutta suurin osa oli ennalta tunnettuja yhden nukleotidin polymorfioita eli geneettisiä monimuotoisuuskohtia. TFF-potilailla havaittiin ZP1- ja ZP3-geeneissä keskimäärin enemmän polymorfioita kuin verrokeilla. Myös osa yleisimmistä alkiokuoren rakennemuutoksista voidaan mahdollisesti selittää ZP1–ZP4-geeneistä löytyneillä polymorfioilla. Sikiöllä ZP3:n ilmentyminen oli havaittavissa jo 11. raskausviikolla, mutta voimakkainta se oli primordiaalivaiheen munarakkuloiden muodostumisen aikaan 20. raskausviikolla. Tämä voi viitata siihen, että ZP3 saattaa osallistua primordiaalivaiheen munarakkulan kehittymiseen ennen varsinaisen alkiokuoren muodostumista. ZP-geenien säätelytekijän FIGLA:n esiintyminen lisääntyi 20. raskausviikolla, mikä tukee aikaisempia havaintoja FIGLA:n merkityksestä munarakkulan kehittymisen aktivaatiossa ja primordiaalivaiheen munarakkuloiden muodostumisessa. Tämä tutkimus tuo lisätietoa alkiokuoren merkityksestä munasolun hedelmöittymisessä ja syventää tietämystämme alkiokuoren muodostumisesta ihmisellä. Hedelmättömyyden taustalla olevien geneettisten tekijöiden tunteminen voi parantaa lapsettomuuspotilaiden hedelmällisyyden arviointia ja auttaa löytämään heille parhaiten sopivan hoidon.