O emprego de aditivos hidrossolúveis como açúcares, tensoativos, sais e polímeros é prática comum na tentativa de se estabilizar proteínas durante aquecimento. Diversos polímeros têm sido utilizados para estabilizar proteínas, sendo seu efeito dependente das características da proteína. Sais podem estabilizar, desestabilizar ou não ter efeito na estabilidade de proteínas; dependendo do tipo, concentração, natureza das interações iônicas e resíduos carregados da proteína. A termoestabilidade da proteína verde fluorescente (GFP) tem sido demonstrada ao calor úmido, à temperaturas elevadas (T ≥ 95°C), à valores de pH alcalinos e a alguns agentes químicos. Sua denaturação térmica é altamente reprodutível e a variação da intensidade de fluorescência pode ser facilmente determinada por espectrofluorimetria. O objetivo deste trabalho foi estudar o comportamento da GFP na presença de diferentes soluções aquosas de polímeros (polietileno glicol, DEAE-Dextrana e ácido poliacrílico) e sais (citrato e fosfato). A partir dos dados obtidos, pode-se concluir que o citrato favoreceu a preservação da estrutura nativa da GFP nas temperaturas estudadas (70 a 95ºC), em concentrações acima de 10% m/m. O ácido poliacrílico também auxiliou na manutenção da estrutura nativa da GFP, porém em menor intensidade, e com concentrações acima de 20% m/m. / The addition of hydrosoluble excipients, such as, sugars, surfactants, salts and polymers is a common practice in the intent of stabilization of proteins during heating. Several polymers have been used to proteins stabilization, being their effect dependent of protein characteristics, however in some cases, it could cause a reduction of stability. Salts can stabilize proteins, or have no influence in their stability, and these behaviors depend on the type, concentration, ionic interaction and charged protein residues. Thermal stability of green protein fluorescent (GFP) have been demonstrated to humid heat, elevated temperatures (T ≥ 95°C), alkaline pH and to some chemical agents. Its thermal denaturation is highly reproducible and the variation of fluorescence intensity can be easily determinate by spectrofluorometry. The objective of this work was study the behavior of GFP in the presence of different aqueous solutions of polymers (polyethylene glycol, DEAE-Dextran and acid polyacrylic) and salts (citrate and phosphate). From the results, it may be concluded that the citrate favored the preservation of native structure of GFP in the temperatures studied (70ºC to 95ºC), in concentrations above 10% m/m. The PAA polymer also favored the GFP thermal stability, but in a minor intensity and in concentrations above 20% m/m.

O emprego de aditivos hidrossolúveis como açúcares, tensoativos, sais e polímeros é prática comum na tentativa de se estabilizar proteínas durante aquecimento. Diversos polímeros têm sido utilizados para estabilizar proteínas, sendo seu efeito dependente das características da proteína. Sais podem estabilizar, desestabilizar ou não ter efeito na estabilidade de proteínas; dependendo do tipo, concentração, natureza das interações iônicas e resíduos carregados da proteína. A termoestabilidade da proteína verde fluorescente (GFP) tem sido demonstrada ao calor úmido, à temperaturas elevadas (T ≥ 95°C), à valores de pH alcalinos e a alguns agentes químicos. Sua denaturação térmica é altamente reprodutível e a variação da intensidade de fluorescência pode ser facilmente determinada por espectrofluorimetria. O objetivo deste trabalho foi estudar o comportamento da GFP na presença de diferentes soluções aquosas de polímeros (polietileno glicol, DEAE-Dextrana e ácido poliacrílico) e sais (citrato e fosfato). A partir dos dados obtidos, pode-se concluir que o citrato favoreceu a preservação da estrutura nativa da GFP nas temperaturas estudadas (70 a 95ºC), em concentrações acima de 10% m/m. O ácido poliacrílico também auxiliou na manutenção da estrutura nativa da GFP, porém em menor intensidade, e com concentrações acima de 20% m/m. / The addition of hydrosoluble excipients, such as, sugars, surfactants, salts and polymers is a common practice in the intent of stabilization of proteins during heating. Several polymers have been used to proteins stabilization, being their effect dependent of protein characteristics, however in some cases, it could cause a reduction of stability. Salts can stabilize proteins, or have no influence in their stability, and these behaviors depend on the type, concentration, ionic interaction and charged protein residues. Thermal stability of green protein fluorescent (GFP) have been demonstrated to humid heat, elevated temperatures (T ≥ 95°C), alkaline pH and to some chemical agents. Its thermal denaturation is highly reproducible and the variation of fluorescence intensity can be easily determinate by spectrofluorometry. The objective of this work was study the behavior of GFP in the presence of different aqueous solutions of polymers (polyethylene glycol, DEAE-Dextran and acid polyacrylic) and salts (citrate and phosphate). From the results, it may be concluded that the citrate favored the preservation of native structure of GFP in the temperatures studied (70ºC to 95ºC), in concentrations above 10% m/m. The PAA polymer also favored the GFP thermal stability, but in a minor intensity and in concentrations above 20% m/m.

Orientador: Ana Maria Aparecida Guaraldo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T15:15:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pinto_HelenCupertinoSilva_M.pdf: 1411655 bytes, checksum: 74209c9aaeedc867a4d0f783be898b27 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A malária cerebral humana é a manifestação mais grave do Plasmodium falciparum que ocorre em 1% das infecções, sendo responsável por mais de dois milhões de mortes anuais entre crianças abaixo de cinco anos. O modelo experimental mais aceito da malária cerebral é o camundongo C57BL/6 infectado pelo Plasmodium berghei ANKA (PbA). A administração da fração mononuclear da medula óssea, contendo principalmente células tronco mesenquimais e hematopoiéticas, constitui uma estratégia promissora no tratamento de danos neurais causados por acidente vascular cerebral. Neste estudo, foi avaliado o efeito de células da medula óssea de camundongos transgênicos C57BL/6 GFP HET transplantadas em C57BL/6JUnib infectados com 106 hemácias parasitadas pelo PbA. Resumidamente, células perfundidas da medula do fêmur e tíbia de C57BL/6 GFP HET foram purificadas por gradiente de Ficoll (Histopaque) a 1000 x g por 15 minutos. Após duas lavagens em meio RPMI, as células foram ressuspensas em NaCl 0,15 M. No segundo dia após a infecção (dai) pelo PbA, foram injetadas 3,0 x 106 a 4,6 x 107 células de medula óssea (CMO) no plexo oftálmico dos camundongos devidamente anestesiados com ketamina/xylasina (protocolo 1078-1 CEEA/Unicamp). Alguns camundongos receberam apenas a injeção de células totais da medula óssea (CTMO), sem a purificação pelo gradiente de Ficoll. Foi avaliada a integridade da barreira hemato-encefálica, mediante a injeção de azul de Evans 1% no plexo oftálmico em camundongos transplantados e não transplantados com células mononucleares da medula óssea (CMoMO) no 2º dai. Após 3 e 4 dias do transplante, não houve proteção da barreira hemato-encefálica. Para constatação da presença das células de medula óssea no cérebro, outro grupo de camundongos infectados pelo PbA recebeu no 2º dai, 4,6 x 107 CMoMO provenientes de camundongos GFP. Após a manifestação de sinais clínicos da MC os camundongos foram sacrificados para remoção do cérebro e preparo de cortes em criostato. Foi possível observar, sob microscópio de fluorescência, a presença de células da medula no bulbo olfatório de camundongos com MC+. Também foram avaliadas a sobrevivência, a parasitemia e a ação coadjuvante do tratamento com cloroquina (0,8 mg/dia/animal). Todos os 38 animais do grupo controle morreram até o 7º dia de infecção pelo PbA (13,16% no 5º dia, 68,42% no 6º dia e 18,42 % no 7º dai). A injeção de células da medula óssea não interferiu na parasitemia dos animais. Apesar dos animais que superaram a fase aguda da malária cerebral morrerem em decorrência de hiperparasitismo e anemia, o tratamento com células da medula óssea (fração mononuclear ou células totais) mostrou-se capaz de ampliar a sobrevivência em 10 a 21 dias, resultados considerados promissores. As células da medula óssea promoveram a melhora clínica do quadro neurológico da malária cerebral. / Abstract: The cerebral malaria (CM) is the most serious complication of Plasmodium falciparum occurring in 1% of infections, and is responsible for more than two million of annual deaths among children under five years old. The experimental model for brain malaria currently used is the C57BL/6 mice infected by Plasmodium berghei ANKA (PbA). Administration of mononuclear population from bone marrow containing mainly mesenchymal stem cells and haematopoietic stem cells, is a promising strategy to treat neural damages caused by stroke. In this study was evaluated the effect of bone marrow mononuclear cells of transgenic mice C57BL/6 GFP HET transplanted into C57BL/6JUnib, infected by 106 parasitized erythrocyte PbA. Briefly, bone marrow mononuclear cells flushed from femur and tibia of C57BL/6 GFP HET were purified through Ficoll (Histopaque) gradient at 1000xg during 15 minutes. After two washes with RPMI medium, the cells were resuspended in NaCl 0,15M. On the second day after infection (DAI) by PbA, were injected into mice orbital plexus 3x10 6 to 4.6x107 cells of after anaesthesia with Ketamine/Xylazine (protocol nº 1078-1 CEEA/UNICAMP). Some mice received only injection of total bone marrow cells without purification on Ficoll gradient. The injection of bone marrow mononuclear cells on the second day of infection by PbA was unable in recovering the brain blood barrier after three or four days. In order to confirm the presence of bone marrow cells in the brain, another group of infected C57BL/6JUnib received on the second day after infection 4.6 x 107 bone marrow mononuclear cells from GFP mice. They were sacrificed between 6th and 8th day after onset of clinical signs of the CM. After removal and preparation of the brain for criostate cuts, was possible to observe, under fluorescence microscope, the presence of GFP bone marrow cells in the olfactory bulb on CM+ mice. It was evaluated survival, parasitemia and action of the adjuvant treatment of chloroquine (0.8 mg/day/animal) as well. All the 38 animals from control group died until 7th DAI. (13.16% at 5th DAI,68.42% at 6th DAI and 18.42% at 7th DAI). The transplantation of bone marrow cells did not affect the parasitemia. The bone marrow cells therapy infected mice by PbA was able to revert the clinical signs of cerebral malaria, increasing the survival up to 21 days. / Mestrado / Parasitologia / Mestre em Parasitologia

No / The ability of neurons to modulate synaptic strength underpins synaptic plasticity, learning and memory, and adaptation to sensory experience. Despite the importance of synaptic adaptation in directing, reinforcing, and revising the behavioral response to environmental influences, the cellular and molecular mechanisms underlying synaptic adaptation are far from clear. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is a prime initiator of structural and functional synaptic adaptation. However, the signaling cascade activated by BDNF to initiate these adaptive changes has not been elucidated. We have previously shown that BDNF activates mitogen- and stress-activated kinase 1 (MSK1), which regulates gene transcription via the phosphorylation of both CREB and histone H3. Using mice with a kinase-dead knock-in mutation of MSK1, we now show that MSK1 is necessary for the upregulation of synaptic strength in response to environmental enrichment in vivo. Furthermore, neurons from MSK1 kinase-dead mice failed to show scaling of synaptic transmission in response to activity deprivation in vitro, a deficit that could be rescued by reintroduction of wild-type MSK1. We also show that MSK1 forms part of a BDNF- and MAPK-dependent signaling cascade required for homeostatic synaptic scaling, which likely resides in the ability of MSK1 to regulate cell surface GluA1 expression via the induction of Arc/Arg3.1. These results demonstrate that MSK1 is an integral part of a signaling pathway that underlies the adaptive response to synaptic and environmental experience. MSK1 may thus act as a key homeostat in the activity- and experience-dependent regulation of synaptic strength.