A habilidade das células-tronco de se diferenciar em diferentes tipos celulares faz delas fortes candidatas para serem utilizadas em terapias celulares como tratamento de diversas doenças. No entanto, para explorar este potencial e necessário o estabelecimento de estratégias efetivas para modificações genéticas nessas células. Associado a outras tecnologias, o sistema de vetores lentivirais tem sido usado como um método atrativo para entrega de transgenes de interesse por possuírem uma alta eficiência de transdução. Além disso, eles permitem a transdução em células em proliferação ou quiescentes. A eficácia desses vetores para expressão de transgenes depende do uso de promotores corretos que possam garantir uma alta expressão genica e sustentável. Assim, o objetivo deste projeto foi comparar a eficiência dos promotores de citomegalovírus (CMV) e do fator de elongação-1<font face=\"Symbol\">a (EF1<font face=\"Symbol\">a) no sistema de entrega genica lentiviral em células-tronco mesenquimais de pele humana (HU). Para isso, foram construídos vetores lentivirais que possuem o promotor de CMV ou o promotor de EF1<font face=\"Symbol\">a, além do gene-repórter eGFP (\'\'enhanced green fluorescence protein\'\'). Para avaliar a eficiência de transfecção das construções, os vetores contendo os promotores e o gene-repórter (pLVCMVeGFP e pLVEF-1<font face=\"Symbol\">a-eGFP) foram utilizadas células 293T (produtora de partículas virais) e verificamos a presença da proteína fluorescente verde por microscopia de fluorescência, indicando a funcionalidade dos promotores. Visando analisar a eficiência das construções, células HU foram transduzidas e observamos a presença da proteína fluorescente nas transduções, demonstrando que os promotores encontram-se ativos em ambas as células. Após a verificação da eficácia das construções plasmidiais, foram feitas analises para avaliar a eficiência da transdução das construções em células HU. Para tal, as células foram transduzidas com lentivirus contendo um dos promotores analisados em diferentes multiplicidades de infecção (1, 5 e 10) e analisadas através da intensidade do sinal de fluorescencia e pela porcentagem de células eGFP positivas. Detectamos mais células eGFP positivas com a transdução do gene a partir do promotor PCMV do que com a do promotor PEF-1<font face=\"Symbol\">a. Assim, comparamos a eficiência destes promotores em MOI 1. Os resultados mostraram que a transdução com o promotor PEF-1<font face=\"Symbol\">a foi superior quando comparado ao promotor PCMV, portanto sendo a melhor escolha para esse sistema de entrega genica em células-tronco mesenquimais de pele humana. / The hability of stem cells to form a wide source spectrum of cell type makes them an interesting source for cell therapies. However, to exploit their remarkable potentials, the development of effective strategies for genetic modifications of MSCs is required. Lentiviral based vectors, with other techniques, offer an attractive system for efficient gene delivery in stem cells. These vectors efficiently transduce stem cells, and can infect dividing and nondividing cells. However, the efficiency of this vectors to genetic manipulation depends on the use of corrects cellular promoters for driving a high and stable expression of exogenous genes. In this study, we have chosen the cytomegalovirus (CMV) and the elongation factor 1-<font face=\"Symbol\">a promoters. We have compared the efficiency of this promoters in drive expression of the transgene in human dermal mesenchymal stem cells. The lentiviral vectors were constructed with the CMV promoter or the EF-1<font face=\"Symbol\">a promoter, together with the eGFP gene (enhanced green fluorescence protein). To evaluate the efficiency of the lentiviral vectors, 293T cells were transfected and analyzed for eGFP expression using fluorescence microscopy. We were able to observe the expression of eGFP, indicating that the vectors were working. Dermal mesenchymals stem cells were transduced with CMV- and EF-1<font face=\"Symbol\">a lentiviral vectors to evaluate the efficiency of the transductions. Efficiency of transductions was measured by flow cytometry (FACS) as percentage eGFP+ cells and signal intensity with different MOIs (multiplicity of infections).

A proposta deste trabalho é a padronização do método de eletroporação direta (utilizando eletrodos) em músculo sóleo de ratos wistar. Deste processo físico, pudemos variar a voltagem, o número de pulsos e duração do pulso. O objetivo principal foi à busca de um parâmetro ideal onde deveria haver a menor lesão tecidual com a maior quantidade de expressão do GFP. Métodos de análise (fluorescência e histologia) foram utilizados para a determinação da eficiência de transferência de genes, onde se considerou a razão entre as fibras musculares sadias emissoras fluorescência e o número total de fibras sadias. Como resultado, atingimos a taxa de eficiência de (50,3 ± 20%) em transferência de genes, utilizando a voltagem de 25 V, trem de 8 pulsos com duração de 20ms e freqüência de 1Hz. A possibilidade de interferir na função deste músculo abre a perspectiva de se estudar o papel de certos genes na plasticidade muscular esquelética, especialmente no crescimento muscular longitudinal. / The use of electrical pulses for gene transfer has been successfully used to reach significant levels of gene expression in vitro and in vivo. Therefore electroporation can be considered an important device to get further insight on biological mechanisms and also to treatment. The aim of the present work is to achieve a high level of gene transfer throughout electroporation in the soleus muscle of Wistar rats. The muscle was surgically accessed, injected with Hyaluronidase and subsequently injected with a plasmid expressing GFP (Green Fluorescence Protein). Observation of fluorescence produced in situ and also HE (Hematoxilin-eosin) preparations revealed that the best gene transfer efficiency (50, 3 ± 20%) was achieved with 25 V and 8 pulses (1Hz) lasting 20ms. These results point to a potential use of electroporation as a tool for investigating cellular and molecular aspects of skeletal muscle plasticity, especially those that can be approached only in soleus muscle, such as longitudinal growth.

Orientador: Selma Giorgio / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T13:17:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_SolangedosSantos_M.pdf: 4660323 bytes, checksum: 5aef15cb049a82091dd076c48c1f6f2b (MD5) Previous issue date: 2010 / Mestrado / Parasitologia / Mestre em Parasitologia

A proposta deste trabalho é a padronização do método de eletroporação direta (utilizando eletrodos) em músculo sóleo de ratos wistar. Deste processo físico, pudemos variar a voltagem, o número de pulsos e duração do pulso. O objetivo principal foi à busca de um parâmetro ideal onde deveria haver a menor lesão tecidual com a maior quantidade de expressão do GFP. Métodos de análise (fluorescência e histologia) foram utilizados para a determinação da eficiência de transferência de genes, onde se considerou a razão entre as fibras musculares sadias emissoras fluorescência e o número total de fibras sadias. Como resultado, atingimos a taxa de eficiência de (50,3 ± 20%) em transferência de genes, utilizando a voltagem de 25 V, trem de 8 pulsos com duração de 20ms e freqüência de 1Hz. A possibilidade de interferir na função deste músculo abre a perspectiva de se estudar o papel de certos genes na plasticidade muscular esquelética, especialmente no crescimento muscular longitudinal. / The use of electrical pulses for gene transfer has been successfully used to reach significant levels of gene expression in vitro and in vivo. Therefore electroporation can be considered an important device to get further insight on biological mechanisms and also to treatment. The aim of the present work is to achieve a high level of gene transfer throughout electroporation in the soleus muscle of Wistar rats. The muscle was surgically accessed, injected with Hyaluronidase and subsequently injected with a plasmid expressing GFP (Green Fluorescence Protein). Observation of fluorescence produced in situ and also HE (Hematoxilin-eosin) preparations revealed that the best gene transfer efficiency (50, 3 ± 20%) was achieved with 25 V and 8 pulses (1Hz) lasting 20ms. These results point to a potential use of electroporation as a tool for investigating cellular and molecular aspects of skeletal muscle plasticity, especially those that can be approached only in soleus muscle, such as longitudinal growth.

A habilidade das células-tronco de se diferenciar em diferentes tipos celulares faz delas fortes candidatas para serem utilizadas em terapias celulares como tratamento de diversas doenças. No entanto, para explorar este potencial e necessário o estabelecimento de estratégias efetivas para modificações genéticas nessas células. Associado a outras tecnologias, o sistema de vetores lentivirais tem sido usado como um método atrativo para entrega de transgenes de interesse por possuírem uma alta eficiência de transdução. Além disso, eles permitem a transdução em células em proliferação ou quiescentes. A eficácia desses vetores para expressão de transgenes depende do uso de promotores corretos que possam garantir uma alta expressão genica e sustentável. Assim, o objetivo deste projeto foi comparar a eficiência dos promotores de citomegalovírus (CMV) e do fator de elongação-1<font face=\"Symbol\">a (EF1<font face=\"Symbol\">a) no sistema de entrega genica lentiviral em células-tronco mesenquimais de pele humana (HU). Para isso, foram construídos vetores lentivirais que possuem o promotor de CMV ou o promotor de EF1<font face=\"Symbol\">a, além do gene-repórter eGFP (\'\'enhanced green fluorescence protein\'\'). Para avaliar a eficiência de transfecção das construções, os vetores contendo os promotores e o gene-repórter (pLVCMVeGFP e pLVEF-1<font face=\"Symbol\">a-eGFP) foram utilizadas células 293T (produtora de partículas virais) e verificamos a presença da proteína fluorescente verde por microscopia de fluorescência, indicando a funcionalidade dos promotores. Visando analisar a eficiência das construções, células HU foram transduzidas e observamos a presença da proteína fluorescente nas transduções, demonstrando que os promotores encontram-se ativos em ambas as células. Após a verificação da eficácia das construções plasmidiais, foram feitas analises para avaliar a eficiência da transdução das construções em células HU. Para tal, as células foram transduzidas com lentivirus contendo um dos promotores analisados em diferentes multiplicidades de infecção (1, 5 e 10) e analisadas através da intensidade do sinal de fluorescencia e pela porcentagem de células eGFP positivas. Detectamos mais células eGFP positivas com a transdução do gene a partir do promotor PCMV do que com a do promotor PEF-1<font face=\"Symbol\">a. Assim, comparamos a eficiência destes promotores em MOI 1. Os resultados mostraram que a transdução com o promotor PEF-1<font face=\"Symbol\">a foi superior quando comparado ao promotor PCMV, portanto sendo a melhor escolha para esse sistema de entrega genica em células-tronco mesenquimais de pele humana. / The hability of stem cells to form a wide source spectrum of cell type makes them an interesting source for cell therapies. However, to exploit their remarkable potentials, the development of effective strategies for genetic modifications of MSCs is required. Lentiviral based vectors, with other techniques, offer an attractive system for efficient gene delivery in stem cells. These vectors efficiently transduce stem cells, and can infect dividing and nondividing cells. However, the efficiency of this vectors to genetic manipulation depends on the use of corrects cellular promoters for driving a high and stable expression of exogenous genes. In this study, we have chosen the cytomegalovirus (CMV) and the elongation factor 1-<font face=\"Symbol\">a promoters. We have compared the efficiency of this promoters in drive expression of the transgene in human dermal mesenchymal stem cells. The lentiviral vectors were constructed with the CMV promoter or the EF-1<font face=\"Symbol\">a promoter, together with the eGFP gene (enhanced green fluorescence protein). To evaluate the efficiency of the lentiviral vectors, 293T cells were transfected and analyzed for eGFP expression using fluorescence microscopy. We were able to observe the expression of eGFP, indicating that the vectors were working. Dermal mesenchymals stem cells were transduced with CMV- and EF-1<font face=\"Symbol\">a lentiviral vectors to evaluate the efficiency of the transductions. Efficiency of transductions was measured by flow cytometry (FACS) as percentage eGFP+ cells and signal intensity with different MOIs (multiplicity of infections).

O emprego de aditivos hidrossolúveis como açúcares, tensoativos, sais e polímeros é prática comum na tentativa de se estabilizar proteínas durante aquecimento. Diversos polímeros têm sido utilizados para estabilizar proteínas, sendo seu efeito dependente das características da proteína. Sais podem estabilizar, desestabilizar ou não ter efeito na estabilidade de proteínas; dependendo do tipo, concentração, natureza das interações iônicas e resíduos carregados da proteína. A termoestabilidade da proteína verde fluorescente (GFP) tem sido demonstrada ao calor úmido, à temperaturas elevadas (T &#8805; 95°C), à valores de pH alcalinos e a alguns agentes químicos. Sua denaturação térmica é altamente reprodutível e a variação da intensidade de fluorescência pode ser facilmente determinada por espectrofluorimetria. O objetivo deste trabalho foi estudar o comportamento da GFP na presença de diferentes soluções aquosas de polímeros (polietileno glicol, DEAE-Dextrana e ácido poliacrílico) e sais (citrato e fosfato). A partir dos dados obtidos, pode-se concluir que o citrato favoreceu a preservação da estrutura nativa da GFP nas temperaturas estudadas (70 a 95ºC), em concentrações acima de 10% m/m. O ácido poliacrílico também auxiliou na manutenção da estrutura nativa da GFP, porém em menor intensidade, e com concentrações acima de 20% m/m. / The addition of hydrosoluble excipients, such as, sugars, surfactants, salts and polymers is a common practice in the intent of stabilization of proteins during heating. Several polymers have been used to proteins stabilization, being their effect dependent of protein characteristics, however in some cases, it could cause a reduction of stability. Salts can stabilize proteins, or have no influence in their stability, and these behaviors depend on the type, concentration, ionic interaction and charged protein residues. Thermal stability of green protein fluorescent (GFP) have been demonstrated to humid heat, elevated temperatures (T &#8805; 95°C), alkaline pH and to some chemical agents. Its thermal denaturation is highly reproducible and the variation of fluorescence intensity can be easily determinate by spectrofluorometry. The objective of this work was study the behavior of GFP in the presence of different aqueous solutions of polymers (polyethylene glycol, DEAE-Dextran and acid polyacrylic) and salts (citrate and phosphate). From the results, it may be concluded that the citrate favored the preservation of native structure of GFP in the temperatures studied (70ºC to 95ºC), in concentrations above 10% m/m. The PAA polymer also favored the GFP thermal stability, but in a minor intensity and in concentrations above 20% m/m.

O emprego de aditivos hidrossolúveis como açúcares, tensoativos, sais e polímeros é prática comum na tentativa de se estabilizar proteínas durante aquecimento. Diversos polímeros têm sido utilizados para estabilizar proteínas, sendo seu efeito dependente das características da proteína. Sais podem estabilizar, desestabilizar ou não ter efeito na estabilidade de proteínas; dependendo do tipo, concentração, natureza das interações iônicas e resíduos carregados da proteína. A termoestabilidade da proteína verde fluorescente (GFP) tem sido demonstrada ao calor úmido, à temperaturas elevadas (T &#8805; 95°C), à valores de pH alcalinos e a alguns agentes químicos. Sua denaturação térmica é altamente reprodutível e a variação da intensidade de fluorescência pode ser facilmente determinada por espectrofluorimetria. O objetivo deste trabalho foi estudar o comportamento da GFP na presença de diferentes soluções aquosas de polímeros (polietileno glicol, DEAE-Dextrana e ácido poliacrílico) e sais (citrato e fosfato). A partir dos dados obtidos, pode-se concluir que o citrato favoreceu a preservação da estrutura nativa da GFP nas temperaturas estudadas (70 a 95ºC), em concentrações acima de 10% m/m. O ácido poliacrílico também auxiliou na manutenção da estrutura nativa da GFP, porém em menor intensidade, e com concentrações acima de 20% m/m. / The addition of hydrosoluble excipients, such as, sugars, surfactants, salts and polymers is a common practice in the intent of stabilization of proteins during heating. Several polymers have been used to proteins stabilization, being their effect dependent of protein characteristics, however in some cases, it could cause a reduction of stability. Salts can stabilize proteins, or have no influence in their stability, and these behaviors depend on the type, concentration, ionic interaction and charged protein residues. Thermal stability of green protein fluorescent (GFP) have been demonstrated to humid heat, elevated temperatures (T &#8805; 95°C), alkaline pH and to some chemical agents. Its thermal denaturation is highly reproducible and the variation of fluorescence intensity can be easily determinate by spectrofluorometry. The objective of this work was study the behavior of GFP in the presence of different aqueous solutions of polymers (polyethylene glycol, DEAE-Dextran and acid polyacrylic) and salts (citrate and phosphate). From the results, it may be concluded that the citrate favored the preservation of native structure of GFP in the temperatures studied (70ºC to 95ºC), in concentrations above 10% m/m. The PAA polymer also favored the GFP thermal stability, but in a minor intensity and in concentrations above 20% m/m.

Orientador: Ana Maria Aparecida Guaraldo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T15:15:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pinto_HelenCupertinoSilva_M.pdf: 1411655 bytes, checksum: 74209c9aaeedc867a4d0f783be898b27 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A malária cerebral humana é a manifestação mais grave do Plasmodium falciparum que ocorre em 1% das infecções, sendo responsável por mais de dois milhões de mortes anuais entre crianças abaixo de cinco anos. O modelo experimental mais aceito da malária cerebral é o camundongo C57BL/6 infectado pelo Plasmodium berghei ANKA (PbA). A administração da fração mononuclear da medula óssea, contendo principalmente células tronco mesenquimais e hematopoiéticas, constitui uma estratégia promissora no tratamento de danos neurais causados por acidente vascular cerebral. Neste estudo, foi avaliado o efeito de células da medula óssea de camundongos transgênicos C57BL/6 GFP HET transplantadas em C57BL/6JUnib infectados com 106 hemácias parasitadas pelo PbA. Resumidamente, células perfundidas da medula do fêmur e tíbia de C57BL/6 GFP HET foram purificadas por gradiente de Ficoll (Histopaque) a 1000 x g por 15 minutos. Após duas lavagens em meio RPMI, as células foram ressuspensas em NaCl 0,15 M. No segundo dia após a infecção (dai) pelo PbA, foram injetadas 3,0 x 106 a 4,6 x 107 células de medula óssea (CMO) no plexo oftálmico dos camundongos devidamente anestesiados com ketamina/xylasina (protocolo 1078-1 CEEA/Unicamp). Alguns camundongos receberam apenas a injeção de células totais da medula óssea (CTMO), sem a purificação pelo gradiente de Ficoll. Foi avaliada a integridade da barreira hemato-encefálica, mediante a injeção de azul de Evans 1% no plexo oftálmico em camundongos transplantados e não transplantados com células mononucleares da medula óssea (CMoMO) no 2º dai. Após 3 e 4 dias do transplante, não houve proteção da barreira hemato-encefálica. Para constatação da presença das células de medula óssea no cérebro, outro grupo de camundongos infectados pelo PbA recebeu no 2º dai, 4,6 x 107 CMoMO provenientes de camundongos GFP. Após a manifestação de sinais clínicos da MC os camundongos foram sacrificados para remoção do cérebro e preparo de cortes em criostato. Foi possível observar, sob microscópio de fluorescência, a presença de células da medula no bulbo olfatório de camundongos com MC+. Também foram avaliadas a sobrevivência, a parasitemia e a ação coadjuvante do tratamento com cloroquina (0,8 mg/dia/animal). Todos os 38 animais do grupo controle morreram até o 7º dia de infecção pelo PbA (13,16% no 5º dia, 68,42% no 6º dia e 18,42 % no 7º dai). A injeção de células da medula óssea não interferiu na parasitemia dos animais. Apesar dos animais que superaram a fase aguda da malária cerebral morrerem em decorrência de hiperparasitismo e anemia, o tratamento com células da medula óssea (fração mononuclear ou células totais) mostrou-se capaz de ampliar a sobrevivência em 10 a 21 dias, resultados considerados promissores. As células da medula óssea promoveram a melhora clínica do quadro neurológico da malária cerebral. / Abstract: The cerebral malaria (CM) is the most serious complication of Plasmodium falciparum occurring in 1% of infections, and is responsible for more than two million of annual deaths among children under five years old. The experimental model for brain malaria currently used is the C57BL/6 mice infected by Plasmodium berghei ANKA (PbA). Administration of mononuclear population from bone marrow containing mainly mesenchymal stem cells and haematopoietic stem cells, is a promising strategy to treat neural damages caused by stroke. In this study was evaluated the effect of bone marrow mononuclear cells of transgenic mice C57BL/6 GFP HET transplanted into C57BL/6JUnib, infected by 106 parasitized erythrocyte PbA. Briefly, bone marrow mononuclear cells flushed from femur and tibia of C57BL/6 GFP HET were purified through Ficoll (Histopaque) gradient at 1000xg during 15 minutes. After two washes with RPMI medium, the cells were resuspended in NaCl 0,15M. On the second day after infection (DAI) by PbA, were injected into mice orbital plexus 3x10 6 to 4.6x107 cells of after anaesthesia with Ketamine/Xylazine (protocol nº 1078-1 CEEA/UNICAMP). Some mice received only injection of total bone marrow cells without purification on Ficoll gradient. The injection of bone marrow mononuclear cells on the second day of infection by PbA was unable in recovering the brain blood barrier after three or four days. In order to confirm the presence of bone marrow cells in the brain, another group of infected C57BL/6JUnib received on the second day after infection 4.6 x 107 bone marrow mononuclear cells from GFP mice. They were sacrificed between 6th and 8th day after onset of clinical signs of the CM. After removal and preparation of the brain for criostate cuts, was possible to observe, under fluorescence microscope, the presence of GFP bone marrow cells in the olfactory bulb on CM+ mice. It was evaluated survival, parasitemia and action of the adjuvant treatment of chloroquine (0.8 mg/day/animal) as well. All the 38 animals from control group died until 7th DAI. (13.16% at 5th DAI,68.42% at 6th DAI and 18.42% at 7th DAI). The transplantation of bone marrow cells did not affect the parasitemia. The bone marrow cells therapy infected mice by PbA was able to revert the clinical signs of cerebral malaria, increasing the survival up to 21 days. / Mestrado / Parasitologia / Mestre em Parasitologia