Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4828_1.pdf: 1055413 bytes, checksum: 4dae5bdcc85f3c7cc7eb4f56a9483f5b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / A infecção pelo lentivirus Caprine arthritis-encephalitis vírus (CAEV) causa doença progressiva crônica caracterizada por artrite, lesões no tecido linfóide, sistema nervoso e em outros órgãos, e o processo clínico é marcado por perda de peso, fragilidade e morte do animal. No Brasil, a infecção pelo CAEV, vem sendo considerada um problema de saúde pública que envolve vários rebanhos de caprinos do país. O presente estudo tem como objetivo avaliar o efeito da infecção pelo CAEV sobre o colesterol, fosfolipídios e triglicerídeos do plasma de caprinos de Pernambuco / Brasil. O plasma dos animais de diversos rebanhos foi analisado por método de imunodifusão em agar gel para detectar a presença de anticorpos para o lentivirus CAEV. Foram selecionados animais infectados pelo CAEV, sem sintomatologia clínica. Animais do grupo controle foram selecionados de rebanhos saudáveis da mesma região e com similar manipulação. Lipoproteína de alta densidade (HDL) plasmática foi isolada por precipitação seletiva das lipoproteínas de baixa (LDL) e muito baixa densidade (VLDL) com ácido fosfotungstico (1,4 mmol/L) e MgCl (53 mmol/L). Colesterol livre e esterificado, bem como, as subclasses de fosfolipídios foram separados por cromatografia em camada fina. Colesterol total e da HDL (HDL-C), bem como, triglicerídeos do plasma foram quantificados por ensaios enzimáticos, enquanto o colesterol das lipoproteínas VLDL e LDL (VLDL-C e LDL-C) foi determinado pela Equação de Friedwald. Os fosfolipídios totais e subclasses foram analisados por método químico. Animais infectados por CAEV apresentaram um aumento significativo nos níveis de colesterol total, ester de colesterila, fosfolipídeos totais e LDL-C. Os níveis plasmáticos de triglicerídeos, HDL-C e VLDL-C foram similares aos valores encontrados para o grupo controle. As concentrações de lisofosfatidilcolina, fosfatidicolina e fosfatidiletanolamina, subclasses de fosfolipídeos, foram aumentadas significativamente no plasma dos animais infectados, em comparação com o grupo controle. Contudo, nenhuma alteração foi observada em outra subclasse dos fosfolipídeos plasmáticos dos animais infectados: a esfingomielina. Os resultados indicam que a infecção pelo CAEV afeta o metabolismo lipídico animal. Os resultados deste trabalho servirão como teste laboratorial auxiliar do diagnóstico e prognóstico clínico/veterinário, importantes para os pequenos e grandes criadores de caprinos.

A terapia gênica consiste em introduzir uma sequência de nucleotídeos, codificante ou não-codificante, que tenha a capacidade de interferir na progressão de uma doença por ativação, inativação ou modulação da expressão de um gene alvo. Uma das rotas de transferência gênica é a ex vivo. Essa rota consiste em realizar a modificação gênica ex vivo de um tipo celular do organismo afetado, seguida do transplante celular no indivíduo para a correção do fenótipo. Dentre os vários vetores virais utilizados para transferência gênica, o sistema lentiviral é considerado um dos mais eficazes, visto que é capaz de manter altos níveis de expressão a longo prazo. Além disso, dentre os vetores virais que se integram no genoma, esse é considerado o mais seguro, tendo apresentado apenas um caso com relatado de efeito colateral sem reação adversa. Uma nova tecnologia utilizada para padronizar sistemas biológicos é a biologia sintética. Essa tecnologia pode ser utilizada como ferramenta para produzir e/ou otimizar sistemas de expressão para produção de proteínas de interesse terapêutico. O objetivo desse trabalho é gerar um vetor lentiviral sintético, para terapia gênica ex vivo, para reposição enzimática. Foram geradas quatro linhagens celulares humanas com produção transiente das proteínas terapêuticas Prot_Ctr e Prot_Mut sob controle dos promotores CMV e HeF1a. Para padronização do ensaio de transfecção, foram geradas duas linhagens celulares humanas que expressão da proteína fluorescente verde (GFP) sob controle dos mesmos promotores citados acima. Como controle negativo das linhagens produtoras da proteína terapêutica, foi gerada uma linhagem como vetor plasmidial vazio pLV_GTW_Mock. O nível de expressão do mRNA relativo às proteínas terapêuticas variou de 3.581,95 ± 1.322 a 10.377,18 ± 2.562 URE, não havendo diferenças significativas entre as linhagens produzidas (p > 0,05). O nível de produção da proteínas terapêuticas variou de 30,98 UI/mL a 241,1 UI/mL. A linhagem com maior produção dessa proteína foi a 293T/HeF1a_Prot_Mut, e essa diferença é significativa (p < 0,05). A partir da transfecção dos plasmídeos auxiliares e plasmídeo portador do cDNA que codifica a Prot-Mut na linhagem celular 293-T foi obtido o vetor lentiviral com título de 1,68x107 pLV/mL. Em conclusão, é possível gerar um vetor lentiviral funcional portador da Prot_Mut para utilização em terapia gênica ex vivo. Espera-se que o produto desse projeto de pesquisa gere uma patente. Para evitar a quebra de novidade, atividade inventiva e suficiência descritiva, requisitos mínimos de patenteabilidade, os resultados foram apresentados sem mencionar a doença e o gene em estudo / Gene therapy involves introducing a nucleotide sequence, coding or non-coding that can to interfere with the progression of a disease by activating, inactivating or modulating the expression of a target gene. One of the gene transfer routes is the ex vivo. This route consists in producing a ex vivo gene modification of a cellular kind of the affected organismo, following the transplant of those cells to correct the fenotype. Among the various viral vectors used for gene transfer, the lentiviral system is considered one of the most effective, since it is able to maintain high levels of long-term expression. Between the viral vectors that integrate into the genome, the lentiviral system is considered the safest, and It has only filed a case with reported side effect without adverse reaction. A new technology used to standardize biological systems is the synthetic biology. This technology can be used as a tool to produce and/or optimize expression systems for production of proteins of therapeutic interest. The aim of this study is to generate a synthetic lentiviral vector for ex vivo gene therapy, for enzyme replacement therapy. It were generated four human cell lines with transient production of therapeutic proteins Prot_Ctr and Prot_Mut under the control of CMV and HeF1a promoters. To standardize the transfection assay were generated two human cell lines expressing green fluorescent protein (GFP) under control of the same promoters cited above. As a negative control of the producing cell lines, It was generated a human cell line with an empty plasmid vector pLV_GTW_Mock. The level of mRNA expression relative to the therapeutic proteins ranged from 3581,95 ± 1322 to 10377,18 ± 2562 REU, there were no significant differences among the produced cell lines ( p > 0.05 ). The production level of therapeutic proteins ranged from 30.98 IU/mL to 241.1 IU/mL. The cell line with the highest production of the therapeutic protein was 93T/HeF1a_Prot_Mut+, and this difference is significant (p < 0.05 ). From the transfection of the plasmid containing the cDNA encoding the Prot_Mut and packing plasmid It was obtained lentiviral vector with the titer 1,68x107 pLV/mL. In conclusion, it is possible to generate a functional lentiviral vector carrying the Prot_Mut for use in ex vivo gene therapy. It is expected that the product of this research project generates a patent. To avoid breaking novelty, inventive activity and descriptive sufficiency, minimum requirements for patentability, the results were presented without mentioning the disease and the gene under study

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-08-25T13:01:31Z No. of bitstreams: 1 Elialdo Xavier de Melo.pdf: 849800 bytes, checksum: 5a5acddc75800240a45417c11a46286a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-25T13:01:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Elialdo Xavier de Melo.pdf: 849800 bytes, checksum: 5a5acddc75800240a45417c11a46286a (MD5) Previous issue date: 2012-02-29 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The objective this work was determine the prevalence of the infection by Lentivírus of Ruminants Small in caprine and ovines geneticly chosen, caprines and ovines of slaugherhauses an in caprines of the creations dairymen of the Pernambuco State. Behind may/2011 and april/2011, blood samples were gathered of 3679 ruminants small being 635 caprines and 1243 ovines geneticly chosen came of 34 creations of caprines in 29 municipalities and 61 creations of ovines in 29 municipalities, 1049 caprines of 51 creations of dairy caprines in eight municipalities and 369 caprines and 383 ovines in 10 municipalities. Utilized ruminants small raffled randon, being the calculation of the proportional example the laboratorial test applied was the Immunization in Gel of Agarose (IDGA) produced with spared of cultures of calls infected with CAEV-Co and MVV-1514 of the Laboratory Biovetec-Recife-PE. The prevalence of the infection of CAEV in caprines geneticly chose were 8,2% (52/635, IC 95% 6,2 – 10,6%) and the infection by MVV in ovines were 1,4 (17/ 1243, IC 95% 0,8 – 2,2%). In criations of caprines considering the sex variable verified that the femals introduced a suggestion of bigger prevalence of the infection by CAEV, in relation to males (p = 0,0041) and with relation to genetic group (p = 0,0046) there was a tendency of bigger prevalence of CAEV in the genetic groups Parda Alpina and Anglo-nubiana, with the genetic group Saanen. Already in ovines considering there was a tendency the gigger prevalency of MVV is the genetic groups Cariri (p=0,0002). The prevalence observed in dairy caprines of 15,8% (164/1049, IC 95% 13,6 – 18,2%), occurring by the way a soropositive animal in 35 of 51 creations studied and different meaning behing genetic group (race) (p= 037) and age (p=0,043). The prevalence of LVPR in caprines of slaughterhouses was of 1,9% (7/369) and in ovines was 0,3% (1/383). By the studies realized, concluded that the LVPR are presents in creations of caprines and ovines by the Pernambuco State, being necessary measure of cantion and control fixed by the organs of the govern and owners, to avoid the diffusion and damages caused by these infirmities. / O objetivo deste trabalho foi determinar a prevalência da infecção por Lentivírus de Pequenos Ruminantes (LVPR) em caprinos e ovinos geneticamente selecionados, caprinos e ovinos de abatedouros e em caprinos de criações leiteiras do Estado de Pernambuco. No período de maio de 2011 a abril de 2012, amostras de sangue foram colhidas de 3679 pequenos ruminantes, sendo 635 caprinos e 1243 ovinos selecionados geneticamente provenientes de 34 criações de caprinos em 29 municípios e 61 criações de ovinos em 29 municípios; 1049 caprinos de 51 criações leiteiras em oito municípios e 369 caprinos e 383 ovinos de abatedouros em 10 municípios. Utilizou-se como delineamento experimental por conglomerados das propriedades com pequenos ruminantes sorteados aleatoriamente, sendo o cálculo da amostra proporcional ao tamanho da população animal criadas. O teste laboratorial utilizado foi o da Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA) com antígenos produzidos a partir de sobrenadantes de culturas de células infectadas com CAEV-Co e MVV-1514 do Laboratório Biovetec-Recife-PE. A prevalência da infecção pelo CAEV em caprinos geneticamente selecionados foi 8,2% (52/635, IC 95% 6,2-10,6%) e da infecção pelo MVV em ovinos geneticamente selecionados foi 1,4% (17/1243, IC 95% 0,8-2,2%). Em criações de caprinos considerando a variável sexo verificou-se que as fêmeas apresentaram maior prevalência da infecção pelo CAEV em relação aos machos (p=0,0041) e com relação ao grupo genético (p=0,046) existiu uma tendência de maior prevalência do CAEV nos grupos genéticos Parda Alpina, Anglo-nubiana e Saanen. Já em ovinos considerando a variável grupo genético existiu uma tendência de maior prevalência do MVV no grupo genético Cariri (p=0,002). A prevalência observada em caprinos leiteiros foi de 15,8% (164/1049, IC 95% 13,6–18,2%), ocorrendo pelo menos um animal soropositivo em 35 das 51 criações estudadas existindo diferença significativa entre grupo genético (raça) (p=0,037) e idade - faixa etária (p=0,043). A prevalência de LVPR em caprinos de abatedouros foi 1,9% (7/369) e em ovinos foi 0,3% (1/383). Pelos resultados obtidos, concluiu-se que os LVPR estão presentes nas criações de caprinos e ovinos do Estado de Pernambuco, sendo necessárias adoções de medidas de prevenção e controle estabelecidas pelos órgãos governamentais e proprietários, para evitar a difusão e prejuízos causados por essas enfermidades.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-10-19T15:13:01Z No. of bitstreams: 1 Michele Moreira Martins de Oliveira.pdf: 2212206 bytes, checksum: d53260059f06790bee5fc10d080a68ba (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-19T15:13:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Michele Moreira Martins de Oliveira.pdf: 2212206 bytes, checksum: d53260059f06790bee5fc10d080a68ba (MD5) Previous issue date: 2007-02-05 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / In Brazil, the Agriculture Animal Husbandry and Supply Ministry (MAPA) has launched a Caprine and Ovine Health Program (PNSCO) which encompasses a National Plan of Control and Vigilance of Small Ruminants Lentiviruses (PNVCLVPR) that the usage of the agar gel immunediffusion(AGID) is recommended as a routine test in the diagnosis of lentiviruses being used anda the western blot (WB) as confirmatory test and for certification purposes, though the last is not available in the country. In this work a WB was standardized for the diagnosis of small ruminants lentiviruses (SRLV) in caprines, using antigen through a simplified purification system, initiated with the concentration by dialysis of the floating of infected corneas cell cultures and followed by centrifugation in continuous sucrose gradient. In the WB, five viral proteins were recognized by the standard positive serum, and showed molecular weights of 14-16, 25, 40, 50 and 70 kDa. When using filed samples of caprine serum, also positive in the immunoblot, at least one viral protein was recognized by all the samples. All serums displayed antibodies against the 25 kDa protein. Positive reaction to gp40 was observed in four animals, with discreet reaction intensity in three of them. Two animals displayed positive reaction to p16, and two to gp50, although not intense ones. It was also standardized an ELISA using G protein as a conjugate, ELISA-G, from an indirect ELISA (ELISA-i). The values of the positive/negative relation (P/N) obtained for the standard serum was significantly superior (P < 0,05) in the ELISA-G (10.9) than in the ELISA-i (4.8). When testing a group of 8 seropositive and 10 seronegative, it was observed, basically, the same behavior, with P/N values, in the ELISA-G of 4.68 and in the ELISA-i of 3.33, showing greater discrimination capacity regarding the ELISA-G, which is highly desirable in immune-enzymatic assays standardization (EEA). These tests are standardized, however the WB needs to be more widely evaluated and the ELISA requires validation (sensibility and specificity estimate), based on the test of a significant number of samples of the caprine and ovine population, representative of different existent epidemiological conditions in Brazil, so that it can be used in the serological diagnosis of lentiviruses in SRLV control programs. Using the WB, in addition to AGID, a serology was performed in animals born through induced labor, separated immediately after birth from their mothers and fed with artificial or treated termally colostrum, these measures, probably, would difficult the transmission of LVSR from the infected goats to their descendents, that would show low or null title of antibodies, however the results of both tests revealed that, although without clinical alterations compatible with infection by SRLV, 27.27% (12/44), all animals, showed antibodies against SRLV, concluding that the handling measures applied were not sufficient to avoid the infection by the SRLV, given that, possibly, an intrauterine infection, and/or failure to inactivate the virus in the colostrum and milk have occurred, besides horizontal transmission. / No Brasil, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) lançou um Programa de Sanidade Caprina e Ovina (PNSCO) que contempla um Plano Nacional de Vigilância e Controle das Lentiviroses de Pequenos Ruminantes (PNVCLVPR) onde está preconizado o uso da imunodifusão em gel de agar (IDGA) como teste de rotina no diagnóstico das lentiviroses, sendo empregado, como prova confirmatória e para fins de certificação, o western blot (WB), embora este último não esteja disponível no país. Neste trabalho foi padronizado um WB para diagnóstico de lentivírus de pequenos ruminantes (LVPR) em caprinos, utilizando antígeno através de um sistema simplificado de purificação, iniciado com a concentração por diálise do sobrenadante de culturas celulares de córnea infectadas e seguido de centrifugação em gradiente contínuo de sacarose. No WB, cinco proteínas virais foram reconhecidas pelo soro padrão positivo e apresentavam pesos moleculares de 14-16, 25, 40, 50 e 70 kDa. Ao se utilizarem amostras de campo de soro caprino positivas no immunoblot, pelo menos uma proteína viral foi reconhecida por todas as amostras. Todos os soros apresentavam anticorpos contra a proteína de 25 kDa. Reação positiva a gp40 foi observada em quatro animais, com intensidade de reação discreta em três deles. Dois animais apresentaram reação positiva à p16, e dois à gp50, embora pouco intensas. Foi ainda padronizado um ELISA utilizando proteína-G como conjugado, (ELISA-G), a partir de um ELISA indireto (ELISA-i). Os valores da relação positivo/negativo (P/N) obtidos para os soros padrão foi significativamente superior (P < 0,05) no ELISA-G (10,9) do que no ELISA-i (4,8). Ao testar um grupo de 8 soros positivos e 10 negativos, observou-se, basicamente, o mesmo comportamento, com valores de P/N, no ELISA-G de 4,68 e no ELISA-i de 3,33, demonstrando maior capacidade de discriminação no caso do ELISA-G, o que é altamente desejável em padronização de ensaios imunoenzimáticos (EIE). Estes testes estão padronizados, porém o WB necessita ser mais amplamente avaliado e o ELISA requer validação (estimativa da sensibilidade e especificidade), com base no teste de um número significativo de amostras da população de caprinos e ovinos, representativas das diferentes condições epidemiológicas existentes no Brasil, para ser utilizado nos programas de controle de LVPR. Utilizando o WB, em adição a IDGA, foi realizada uma sorologia em animais nascidos por parto induzido, separados imediatamente após o nascimento de suas mães, e alimentados com colostro artificial ou tratado termicamente. Estas medidas, provavelmente, dificultariam a transmissão de LVPR das cabras positivas a seus descendentes, os quais apresentariam título baixo ou nulo de anticorpos, porém os resultados dos dois testes revelaram que, embora sem alterações clínicas compatíveis com infecção por LVPR, 27,27% (12/44) dos animais anticorpos contra LVPR, concluindo-se que as medidas de manejo empregadas não foram suficientes para evitar a infecção pelos lentivírus; possivelmente, ocorreu infecção intrauterina, e/ou falha na inativação do vírus no colostro e leite, além da transmissão horizontal.

Estudou-se a freqüência da ocorrência de anticorpos antivírus da Artrite-encefalite dos Caprinos, em caprinos de 14 plantéis localizados no Estado de São Paulo, por um período de 2 anos, utilizando-se a técnica de imunodifusão em gel de ágar. A prevalência obtida foi de 26,3%, sendo significativamente maior nos caprinos mantidos em regime intensivo (31,8% - 733/2303) de criação do que no sistema semi-extensivo (13,1% - 128- 977). A infecção pelo vírus da Artrite-encefalite dos Caprinos aumentou gradativa e significativamente após os 6 meses de idade, havendo predominância da infecção nos caprinos mais velhos. Não se detectou influência de fatores sexuais sobre a prevalência da enfermidade determinada em caprinos do sexo feminino (27,9% - 663/2375) e masculino (32,3% - 94/291). A prevalência da doença foi significativamente maior nos caprinos das raças Anglo Nubiana (63,8% - 88/138) e Toggenbourg (56,0% - 28/50) do que nas demais raças estudadas: Saanen (27,4% - 673/2458), Alpina (11,9% - 59/497), Bôer (5,9% - 2/34) e caprinos mestiços (10,7% - 11/103). Paralelamente realizou-se estudo clínico dos animais infectados pelo vírus da Artrite-encefalite dos Caprinos, quando pudemos demonstrar que 17,1% (64/374) dos caprinos sororeagentes apresentavam a forma clínica articular da enfermidade e que 6,6% (17/249) das cabras sororeagentes apresentavam a forma mamária. A possibilidade de transmissão vertical transplacentária foi menor do que 3,8%. Verificou-se ser pequena a possibilidade dos cabritos se infectarem pelo colostro de cabras sororeagentes positivas, mas podem se infectar pelo leite oriundos dessas cabras infectadas (18,8% - 3/16). O tempo de duração dos anticorpos séricos adquiridos passivamente pelo colostro variou de 60 a 120 dias. Demonstrou-se, indiretamente, a presença e a viabilidade do vírus no sangue circulante, colostro e leite de caprinos infectados, bem como a possibilidadede infectar animais susceptíveis por inoculação, sendo o período de incubação de 45 a 60 dias. Não se demonstrou diferenças significativas dos teores séricos de proteína total, gamaglobulina e da atividade enzimática da glutamiltransferase - &gamma;GT em cabritos que receberam colostro de cabras infectadas ou não infectadas pelo mencionado vírus. / The frequency of occurrence of antibodies anti-caprine arthritis-encephalitis virus was studied in 14 herds in the State of São Paulo, during 2 years, using agar gel immunodiffusion. Prevalence was equal to 26.3%, and was significantly higher in animals kept under an intensive management scheme (31.8% - 733/2303), than in animals kept under a semi-extensive one (13.1% - 128- 977). Infection by the caprine arthritis-encephalitis virus increased gradual and significantly after 6 months of age. Infection was predominant in older animals. There was no gender influence on the prevalence of the disease, both in females (27.9% - 663/2375) and males (32.3% - 94/291). In relation to breed, prevalence of the disease was significantly higher in Anglo-Nubian (63.8% - 88/138) and Toggenbourg animals (56.0% - 28/50), than in the rest of the breeds studied: Saanen (27.4% - 673/2458), Alpine (11.9% - 59/497), Boer (5.9% - 2/34) and mixed breed animals (10.7% - 11/103). A clinical study of the animals infected by caprine arthritis-encephalitis virus was also performed. It was observed that 17.1% (64/374) of seroreagents presented the articular form of the disease and that 6.6% (17/249) of the seroreagent females presented the mammary form of the disease. The possibility of vertical, transplacentary transmission was lower than 3.8%. It was observed that the probability of infection of kids by colostrum of infected females was low (18.8% - 3/16). Antibodies passively acquired by colostrum ingestion lasted from 60 to 120 days. The presence and viability of the virus circulating in blood, colostrum and milk of infected animals, as well as the possibility of infection of susceptible animals by inoculation was indirectly demonstrated. Incubation period ranged from 45 to 60 days. There was no significant difference in serum levels of total protein and gammaglobulin, and in enzymatic activity of glutamiltransferase - &gamma;GT in kids that received colostrum from infected and non-infected females.

Orientador: Paula Rahal / Banca: Clarice Arns / Banca: João Pessoa Araújo Junior / Banca: Maurício Lacerda Nogueira / Banca: Cristiane Damas Gil / Resumo: A Hepatite C é a inflamação do fígado causada pela infecção pelo vírus da hepatite C (HCV). Essa inflamação ocorre na maioria das pessoas infectadas pelo vírus e, dependendo da intensidade e tempo de duração, pode levar à cirrose e câncer do fígado. No momento não existem vacinas eficazes e o tratamento convencional com peg-IFN e ribavirina tem eficácia bastante limitada e efeitos colaterais graves. Terapias moleculares utilizando a RNAi demonstraram ser eficientes na inibição deste vírus in vitro. O objetivo deste trabalho foi desenvolver diferentes metodologias para inibição da replicação do HCV utilizando-se da técnica de RNAi. Foram desenvolvidas 5 moléculas de dicer substrate siRNA, que em sua maioria foram capazes de reduzir a replicação viral em até 90% em relação ao controle negativo. Ainda, não foi observada a seleção de mutantes resistentes do vírus após o tratamento com os DsiRNAs por 21 dias. Também foram desenvolvidos 3 vetores lentivirais contendo sequencias codificantes de shRNA contra o HCV. Com a utilização destas partículas lentivirais foi possível reduzir a replicação do HCV em aproximadamente 99% em relação ao controle negativo. Neste estudo foi demonstrado que o HCV pode ser inibido eficientemente utilizando tecnologias distintas de RNAi. Os DsiRNAs são mais potentes que os tradicionais siRNAs e com menor probabilidade de selecionar mutantes resistentes. Os vetores lentivirais são eficientes na entrega dos genes contendo os shRNAs e potentes na inibição do HCV. Ambas as tecnologias no futuro poderão ser utilizadas na terapia alternativa de pacientes crônicos ou no caso dos DsiRNAs de forma preventiva à infecção / Abstract: Hepatitis C virus (HCV) frequently establishes persistent infections in the liver, leading to the development of chronic hepatitis, and, potentially, to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma at later stages. No vaccine is available for HCV and the current standard of care, which consists of pegylated interferon-α and ribavirin, has limited efficacy against certain HCV genotypes, and also produces significant adverse effects. Molecular therapies have proven to be effective in the inhibition of the virus in vitro. Molecular therapies based on RNAi has shown good efficiency on knockdown of HCV in vitro.The aim of this study was to develop different methodologies for inhibiting HCV replication using the RNAi technique. We developed five dicer substrate siRNA molecules, which mostly were able to reduce viral replication by 90% compared to the negative control. Still, there was no selection of resistant mutants of the virus after treatment with DsiRNAs for 21 days. In addition, we developed lentiviral vectors containing sequences encoding shRNA against HCV. With the use of these lentiviral particles, it was possible to reduce HCV replication by approximately 99% compared to negative control. In this study, it was demonstrated that HCV could be effectively inhibited using different RNAi technologies. The DsiRNAs are more powerful than traditional siRNAs and less likely to select resistant mutants. The lentiviral vectors are efficient in delivery of genes containing shRNAs and potent in the inhibition of HCV. Both technologies in the future may be used in alternative therapy for chronic patients or in case of DsiRNAs preventively to infection / Doutor

Made available in DSpace on 2014-08-27T14:36:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-15Bitstream added on 2014-08-27T15:57:02Z : No. of bitstreams: 1 000778124.pdf: 2188391 bytes, checksum: fd262617e1148f5350687c3217aafda3 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A Hepatite C é a inflamação do fígado causada pela infecção pelo vírus da hepatite C (HCV). Essa inflamação ocorre na maioria das pessoas infectadas pelo vírus e, dependendo da intensidade e tempo de duração, pode levar à cirrose e câncer do fígado. No momento não existem vacinas eficazes e o tratamento convencional com peg-IFN e ribavirina tem eficácia bastante limitada e efeitos colaterais graves. Terapias moleculares utilizando a RNAi demonstraram ser eficientes na inibição deste vírus in vitro. O objetivo deste trabalho foi desenvolver diferentes metodologias para inibição da replicação do HCV utilizando-se da técnica de RNAi. Foram desenvolvidas 5 moléculas de dicer substrate siRNA, que em sua maioria foram capazes de reduzir a replicação viral em até 90% em relação ao controle negativo. Ainda, não foi observada a seleção de mutantes resistentes do vírus após o tratamento com os DsiRNAs por 21 dias. Também foram desenvolvidos 3 vetores lentivirais contendo sequencias codificantes de shRNA contra o HCV. Com a utilização destas partículas lentivirais foi possível reduzir a replicação do HCV em aproximadamente 99% em relação ao controle negativo. Neste estudo foi demonstrado que o HCV pode ser inibido eficientemente utilizando tecnologias distintas de RNAi. Os DsiRNAs são mais potentes que os tradicionais siRNAs e com menor probabilidade de selecionar mutantes resistentes. Os vetores lentivirais são eficientes na entrega dos genes contendo os shRNAs e potentes na inibição do HCV. Ambas as tecnologias no futuro poderão ser utilizadas na terapia alternativa de pacientes crônicos ou no caso dos DsiRNAs de forma preventiva à infecção / Hepatitis C virus (HCV) frequently establishes persistent infections in the liver, leading to the development of chronic hepatitis, and, potentially, to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma at later stages. No vaccine is available for HCV and the current standard of care, which consists of pegylated interferon-? and ribavirin, has limited efficacy against certain HCV genotypes, and also produces significant adverse effects. Molecular therapies have proven to be effective in the inhibition of the virus in vitro. Molecular therapies based on RNAi has shown good efficiency on knockdown of HCV in vitro.The aim of this study was to develop different methodologies for inhibiting HCV replication using the RNAi technique. We developed five dicer substrate siRNA molecules, which mostly were able to reduce viral replication by 90% compared to the negative control. Still, there was no selection of resistant mutants of the virus after treatment with DsiRNAs for 21 days. In addition, we developed lentiviral vectors containing sequences encoding shRNA against HCV. With the use of these lentiviral particles, it was possible to reduce HCV replication by approximately 99% compared to negative control. In this study, it was demonstrated that HCV could be effectively inhibited using different RNAi technologies. The DsiRNAs are more powerful than traditional siRNAs and less likely to select resistant mutants. The lentiviral vectors are efficient in delivery of genes containing shRNAs and potent in the inhibition of HCV. Both technologies in the future may be used in alternative therapy for chronic patients or in case of DsiRNAs preventively to infection

Estudou-se a freqüência da ocorrência de anticorpos antivírus da Artrite-encefalite dos Caprinos, em caprinos de 14 plantéis localizados no Estado de São Paulo, por um período de 2 anos, utilizando-se a técnica de imunodifusão em gel de ágar. A prevalência obtida foi de 26,3%, sendo significativamente maior nos caprinos mantidos em regime intensivo (31,8% - 733/2303) de criação do que no sistema semi-extensivo (13,1% - 128- 977). A infecção pelo vírus da Artrite-encefalite dos Caprinos aumentou gradativa e significativamente após os 6 meses de idade, havendo predominância da infecção nos caprinos mais velhos. Não se detectou influência de fatores sexuais sobre a prevalência da enfermidade determinada em caprinos do sexo feminino (27,9% - 663/2375) e masculino (32,3% - 94/291). A prevalência da doença foi significativamente maior nos caprinos das raças Anglo Nubiana (63,8% - 88/138) e Toggenbourg (56,0% - 28/50) do que nas demais raças estudadas: Saanen (27,4% - 673/2458), Alpina (11,9% - 59/497), Bôer (5,9% - 2/34) e caprinos mestiços (10,7% - 11/103). Paralelamente realizou-se estudo clínico dos animais infectados pelo vírus da Artrite-encefalite dos Caprinos, quando pudemos demonstrar que 17,1% (64/374) dos caprinos sororeagentes apresentavam a forma clínica articular da enfermidade e que 6,6% (17/249) das cabras sororeagentes apresentavam a forma mamária. A possibilidade de transmissão vertical transplacentária foi menor do que 3,8%. Verificou-se ser pequena a possibilidade dos cabritos se infectarem pelo colostro de cabras sororeagentes positivas, mas podem se infectar pelo leite oriundos dessas cabras infectadas (18,8% - 3/16). O tempo de duração dos anticorpos séricos adquiridos passivamente pelo colostro variou de 60 a 120 dias. Demonstrou-se, indiretamente, a presença e a viabilidade do vírus no sangue circulante, colostro e leite de caprinos infectados, bem como a possibilidadede infectar animais susceptíveis por inoculação, sendo o período de incubação de 45 a 60 dias. Não se demonstrou diferenças significativas dos teores séricos de proteína total, gamaglobulina e da atividade enzimática da glutamiltransferase - &gamma;GT em cabritos que receberam colostro de cabras infectadas ou não infectadas pelo mencionado vírus. / The frequency of occurrence of antibodies anti-caprine arthritis-encephalitis virus was studied in 14 herds in the State of São Paulo, during 2 years, using agar gel immunodiffusion. Prevalence was equal to 26.3%, and was significantly higher in animals kept under an intensive management scheme (31.8% - 733/2303), than in animals kept under a semi-extensive one (13.1% - 128- 977). Infection by the caprine arthritis-encephalitis virus increased gradual and significantly after 6 months of age. Infection was predominant in older animals. There was no gender influence on the prevalence of the disease, both in females (27.9% - 663/2375) and males (32.3% - 94/291). In relation to breed, prevalence of the disease was significantly higher in Anglo-Nubian (63.8% - 88/138) and Toggenbourg animals (56.0% - 28/50), than in the rest of the breeds studied: Saanen (27.4% - 673/2458), Alpine (11.9% - 59/497), Boer (5.9% - 2/34) and mixed breed animals (10.7% - 11/103). A clinical study of the animals infected by caprine arthritis-encephalitis virus was also performed. It was observed that 17.1% (64/374) of seroreagents presented the articular form of the disease and that 6.6% (17/249) of the seroreagent females presented the mammary form of the disease. The possibility of vertical, transplacentary transmission was lower than 3.8%. It was observed that the probability of infection of kids by colostrum of infected females was low (18.8% - 3/16). Antibodies passively acquired by colostrum ingestion lasted from 60 to 120 days. The presence and viability of the virus circulating in blood, colostrum and milk of infected animals, as well as the possibility of infection of susceptible animals by inoculation was indirectly demonstrated. Incubation period ranged from 45 to 60 days. There was no significant difference in serum levels of total protein and gammaglobulin, and in enzymatic activity of glutamiltransferase - &gamma;GT in kids that received colostrum from infected and non-infected females.

O Brasil é o 18ª maior produtor de carne ovina e, apesar de ser em grande parte informal, é uma cultura crescente no país. Dentre as enfermidades infecciosas que acomete a ovinocultura a broncopneumonia é uma das mais recorrentes, no entanto, não há muitos estudos sobre esta enfermidade em pequenos ruminantes no Brasil. Por isso, esta pesquisa teve como objetivo verificar a ocorrência de doenças respiratórias no estado de São Paulo e Rio de Janeiro causadas por bactérias e vírus. Para a realização desse projeto foi utilizado a técnica de lavado traqueobrônquico transtraqueal e coleta de sangue total para obtenção do soro em 99 ovinos. Essas amostras foram submetidas a teste de virusneutralização para identificação de anticorpos contra vírus da Parainfluenza Tipo 3 (PI-3), Herpesvírus Bovino Tipo 1 (BoHV- 1), Vírus Sincicial Respiratório Bovino (BRSV) e Vírus da Diarreia Viral Bovina (VDVB). Utilização do teste de imunodifusão em gel de agarose e Eradikt&reg; para detectar a presença de anticorpos contra Lentivírus de Pequenos Ruminantes (LVPR). Isolamento e identificação bioquímica para M. haemolytica e Pasteurella multocida. Cultivo e isolamento, identificação bioquímica e PCR foram testes utilizados para identificação de micoplasmas (Mycoplasma bovis, M. agalactiae, M. mycoides subsp. capri). Das 99 amostras coletadas, 33 foram de ovinos doentes e 66 de ovinos sadios. Não houve identificação de M. haemolytica e P. multocida, nem presença de anticorpos contra BoHV-1 e VDVB. No entanto, observou-se a prevalência de 52,52%, 48,48% e 21,87% de PI-3, BRSV e LVPR respectivamente. Em relação as bactérias aeróbias, houve maior frequência de isolamento de Bacillus sp. e Gram-negativas não fermentadoras. Apesar de identificar bactérias da classe Mollicutes em colônias isoladas em 23,28% das amostras, houve apenas uma identificação com os oligonucleotídeos utilizados, o M. mycoides subsp. capri, primeiro isolamento em ovinos no estado de São Paulo e Rio de Janeiro. Houve diferença estatística significativa (p&lt;0,05) entre animais com broncopneumonia e manifestações clínicas como taquipneia, hipertermia, secreção nasal, tosse, dispneia, crepitação fina e ronco e entre animais com broncopneumonia e não realizam de quarentena e não separam animais doentes. A broncopneumonia envolve vários fatores, incluindo o manejo, agente infeccioso e a imunidade do animal. Por isso, é necessário conhecer todos esses aspectos e associá-los para uma melhor prevenção e tratamento. / Brazil is the 18th largest producer of sheep meat and, despite being largely informal, is a growing crop in the country. Among the infectious diseases that affect sheep production, bronchopneumonia is one of the most recurrent, however, there are not many studies on this disease in small ruminants in Brazil. Therefore, this research aimed to verify the occurrence of respiratory diseases in the state of São Paulo and Rio de Janeiro caused by bacteria and viruses. For the accomplishment of this project was used tracheobronchial lavage technique transtracheal and collection of whole blood to obtain serum in 99 sheep. These samples were submitted to virus neutralization test to identify antibodies against Parainfluenza Type 3 (PI-3), Bovine Herpesvirus Type 1 (BoHV-1), Bovine Respiratory Syncytial Virus (BRSV) and Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV). Use of the Eradikit &reg; and agarose gel immunodiffusion test to detect the presence of antibodies against Small Ruminant Lentiviruses (LVPR). Isolation and biochemical identification for M. haemolytica and Pasteurella multocida. Cultivation and isolation, biochemical identification and PCR were used to identify mycoplasmas (Mycoplasma bovis, M. agalactiae, M. mycoides subsp. Capri). Of the 99 samples collected, 33 were from diseased sheep and 66 from healthy sheep. There was no identification of M. haemolytica and P. multocida, nor presence of antibodies against BoHV-1 and BVDV. However, the prevalence of 52.52%, 48.48% and 21.87% of PI-3, BRSV and LVPR, respectively, was observed. In relation to aerobic bacteria, there was a higher frequency of isolation of Bacillus sp. and Gram-negative non-fermenters. Despite identifying Mollicute class bacteria in isolated colonies in 23.28% of the samples, there was only one identification with the oligonucleotides used, M. mycoides subsp. capri, first isolation in sheep in the state of São Paulo and Rio de Janeiro. There was a significant statistical difference (p &lt;0.05) between animals with bronchopneumonia and clinical manifestations such as tachypnea, hyperthermia, nasal secretion, cough, dyspnea, fine crackling and snoring, and between animals with bronchopneumonia and quarantine and separation of diseased animals. Bronchopneumonia involves several factors, including management, infectious agent and the immunity of the animal. Therefore, it is necessary to know all these aspects and to associate them for a better prevention and treatment.

A habilidade das células-tronco de se diferenciar em diferentes tipos celulares faz delas fortes candidatas para serem utilizadas em terapias celulares como tratamento de diversas doenças. No entanto, para explorar este potencial e necessário o estabelecimento de estratégias efetivas para modificações genéticas nessas células. Associado a outras tecnologias, o sistema de vetores lentivirais tem sido usado como um método atrativo para entrega de transgenes de interesse por possuírem uma alta eficiência de transdução. Além disso, eles permitem a transdução em células em proliferação ou quiescentes. A eficácia desses vetores para expressão de transgenes depende do uso de promotores corretos que possam garantir uma alta expressão genica e sustentável. Assim, o objetivo deste projeto foi comparar a eficiência dos promotores de citomegalovírus (CMV) e do fator de elongação-1<font face=\"Symbol\">a (EF1<font face=\"Symbol\">a) no sistema de entrega genica lentiviral em células-tronco mesenquimais de pele humana (HU). Para isso, foram construídos vetores lentivirais que possuem o promotor de CMV ou o promotor de EF1<font face=\"Symbol\">a, além do gene-repórter eGFP (\'\'enhanced green fluorescence protein\'\'). Para avaliar a eficiência de transfecção das construções, os vetores contendo os promotores e o gene-repórter (pLVCMVeGFP e pLVEF-1<font face=\"Symbol\">a-eGFP) foram utilizadas células 293T (produtora de partículas virais) e verificamos a presença da proteína fluorescente verde por microscopia de fluorescência, indicando a funcionalidade dos promotores. Visando analisar a eficiência das construções, células HU foram transduzidas e observamos a presença da proteína fluorescente nas transduções, demonstrando que os promotores encontram-se ativos em ambas as células. Após a verificação da eficácia das construções plasmidiais, foram feitas analises para avaliar a eficiência da transdução das construções em células HU. Para tal, as células foram transduzidas com lentivirus contendo um dos promotores analisados em diferentes multiplicidades de infecção (1, 5 e 10) e analisadas através da intensidade do sinal de fluorescencia e pela porcentagem de células eGFP positivas. Detectamos mais células eGFP positivas com a transdução do gene a partir do promotor PCMV do que com a do promotor PEF-1<font face=\"Symbol\">a. Assim, comparamos a eficiência destes promotores em MOI 1. Os resultados mostraram que a transdução com o promotor PEF-1<font face=\"Symbol\">a foi superior quando comparado ao promotor PCMV, portanto sendo a melhor escolha para esse sistema de entrega genica em células-tronco mesenquimais de pele humana. / The hability of stem cells to form a wide source spectrum of cell type makes them an interesting source for cell therapies. However, to exploit their remarkable potentials, the development of effective strategies for genetic modifications of MSCs is required. Lentiviral based vectors, with other techniques, offer an attractive system for efficient gene delivery in stem cells. These vectors efficiently transduce stem cells, and can infect dividing and nondividing cells. However, the efficiency of this vectors to genetic manipulation depends on the use of corrects cellular promoters for driving a high and stable expression of exogenous genes. In this study, we have chosen the cytomegalovirus (CMV) and the elongation factor 1-<font face=\"Symbol\">a promoters. We have compared the efficiency of this promoters in drive expression of the transgene in human dermal mesenchymal stem cells. The lentiviral vectors were constructed with the CMV promoter or the EF-1<font face=\"Symbol\">a promoter, together with the eGFP gene (enhanced green fluorescence protein). To evaluate the efficiency of the lentiviral vectors, 293T cells were transfected and analyzed for eGFP expression using fluorescence microscopy. We were able to observe the expression of eGFP, indicating that the vectors were working. Dermal mesenchymals stem cells were transduced with CMV- and EF-1<font face=\"Symbol\">a lentiviral vectors to evaluate the efficiency of the transductions. Efficiency of transductions was measured by flow cytometry (FACS) as percentage eGFP+ cells and signal intensity with different MOIs (multiplicity of infections).