A habilidade das células-tronco de se diferenciar em diferentes tipos celulares faz delas fortes candidatas para serem utilizadas em terapias celulares como tratamento de diversas doenças. No entanto, para explorar este potencial e necessário o estabelecimento de estratégias efetivas para modificações genéticas nessas células. Associado a outras tecnologias, o sistema de vetores lentivirais tem sido usado como um método atrativo para entrega de transgenes de interesse por possuírem uma alta eficiência de transdução. Além disso, eles permitem a transdução em células em proliferação ou quiescentes. A eficácia desses vetores para expressão de transgenes depende do uso de promotores corretos que possam garantir uma alta expressão genica e sustentável. Assim, o objetivo deste projeto foi comparar a eficiência dos promotores de citomegalovírus (CMV) e do fator de elongação-1<font face=\"Symbol\">a (EF1<font face=\"Symbol\">a) no sistema de entrega genica lentiviral em células-tronco mesenquimais de pele humana (HU). Para isso, foram construídos vetores lentivirais que possuem o promotor de CMV ou o promotor de EF1<font face=\"Symbol\">a, além do gene-repórter eGFP (\'\'enhanced green fluorescence protein\'\'). Para avaliar a eficiência de transfecção das construções, os vetores contendo os promotores e o gene-repórter (pLVCMVeGFP e pLVEF-1<font face=\"Symbol\">a-eGFP) foram utilizadas células 293T (produtora de partículas virais) e verificamos a presença da proteína fluorescente verde por microscopia de fluorescência, indicando a funcionalidade dos promotores. Visando analisar a eficiência das construções, células HU foram transduzidas e observamos a presença da proteína fluorescente nas transduções, demonstrando que os promotores encontram-se ativos em ambas as células. Após a verificação da eficácia das construções plasmidiais, foram feitas analises para avaliar a eficiência da transdução das construções em células HU. Para tal, as células foram transduzidas com lentivirus contendo um dos promotores analisados em diferentes multiplicidades de infecção (1, 5 e 10) e analisadas através da intensidade do sinal de fluorescencia e pela porcentagem de células eGFP positivas. Detectamos mais células eGFP positivas com a transdução do gene a partir do promotor PCMV do que com a do promotor PEF-1<font face=\"Symbol\">a. Assim, comparamos a eficiência destes promotores em MOI 1. Os resultados mostraram que a transdução com o promotor PEF-1<font face=\"Symbol\">a foi superior quando comparado ao promotor PCMV, portanto sendo a melhor escolha para esse sistema de entrega genica em células-tronco mesenquimais de pele humana. / The hability of stem cells to form a wide source spectrum of cell type makes them an interesting source for cell therapies. However, to exploit their remarkable potentials, the development of effective strategies for genetic modifications of MSCs is required. Lentiviral based vectors, with other techniques, offer an attractive system for efficient gene delivery in stem cells. These vectors efficiently transduce stem cells, and can infect dividing and nondividing cells. However, the efficiency of this vectors to genetic manipulation depends on the use of corrects cellular promoters for driving a high and stable expression of exogenous genes. In this study, we have chosen the cytomegalovirus (CMV) and the elongation factor 1-<font face=\"Symbol\">a promoters. We have compared the efficiency of this promoters in drive expression of the transgene in human dermal mesenchymal stem cells. The lentiviral vectors were constructed with the CMV promoter or the EF-1<font face=\"Symbol\">a promoter, together with the eGFP gene (enhanced green fluorescence protein). To evaluate the efficiency of the lentiviral vectors, 293T cells were transfected and analyzed for eGFP expression using fluorescence microscopy. We were able to observe the expression of eGFP, indicating that the vectors were working. Dermal mesenchymals stem cells were transduced with CMV- and EF-1<font face=\"Symbol\">a lentiviral vectors to evaluate the efficiency of the transductions. Efficiency of transductions was measured by flow cytometry (FACS) as percentage eGFP+ cells and signal intensity with different MOIs (multiplicity of infections).
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-06112013-091351 |
| Date | 01 August 2013 |
| Creators | Mourão, Roberta Ferrari |
| Contributors | Paiva, Katiucia Batista da Silva |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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