Submitted by Vasti Diniz (vastijpa@hotmail.com) on 2017-09-08T14:21:13Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1859059 bytes, checksum: b132aa4cd1f20f233d8bac438414a9bc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-08T14:21:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1859059 bytes, checksum: b132aa4cd1f20f233d8bac438414a9bc (MD5) Previous issue date: 2015-04-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The mutual ineffective for many antibiotics called multidrug resistance (MDR), has undermined the therapeutic value of existing antibacterial. With the identification and characterization of efflux systems that confer clinical resistance to antimicrobial, has emerged interest in developing a new class of agents enhancers the antibiotic action that act as inhibitors of efflux pumps, this are also called antibiotic activity modifiers or antibiotics adjuvantes. In this study, were evaluated synthetic guanylhydrazones derivatives as antibacterial and agents modulators of drug resistance in strains of Staphylococcus aureus. The bacterial strains used express the genes NorA, MrsA or TetK encoding proteins efflux for norfloxacin and ethidium bromide (NorA), erythromycin (MsrA) and tetracycline(TetK), respectively. The minimum inhibitory concentrations (MIC) values of the antibiotics and synthetic derivatives were determined in nutrient broth by the microdilution assay, and to evaluate the modulator activity, the MIC of antibiotics and ethidium bromide were determined in the absence and presence of subinibitory concentrations of guanylhydrazones. The compounds tested did not display relevant antibacterial activity for majority compounds at the concentrations tested, showing MIC ranging from (16 to > 256 μg/mL). When combined with the antibiotics tetracycline and erythromycin some compounds reduced their MIC 2-fold and 4-fold respectively. However, when combined with norfloxacin, except only one compound, all guanylhydrazones derivatives in different ratios and degrees of sensitivity, were able to potentiate the effect of this antibiotic, with three compounds which reduced its MIC 16-fold to norfloxacin, 32-fold to ethidium bromide and 8-fold for berberine used as positive controls for NorA pump. The molecular docking studies showed that both norfloxacin and compound 13 are recognized by the same binding site on the NorA pump, suggesting a competitive mechanism. The results presented here reported for the first time its great potential of guanylhydrazones derivatives to be putative inhibitors of bacterial efflux systems, especially for strains Staphylococcus aureus. / A ineficácia mútua para diversos antibióticos chamada de resistência múltipla as drogas (MDR), tem minado o valor terapêutico dos antibacterianos existentes. Com a identificação e caracterização de sistemas de efluxo que conferem resistência clínica aos antimicrobianos, tem surgido interesse no desenvolvimento de uma nova classe de agentes potenciadores da ação antibiótica que atuem como inibidores de bombas de efluxo, estes também são chamados de modificadores de atividade antibiótica ou adjuvantes de antibióticos. No presente trabalho, foram avaliados derivados sintéticos guanilhidrazônicos como antibacterianos e agentes moduladores da resistência à drogas em linhagens de Staphylococcus aureus. As linhagens bacterianas utilizadas expressam o gene norA, msrA ou tetK codificadores das proteínas de efluxo para norfloxacina e brometo de etídeo (NorA), eritromicina (MsrA) e tetraciclina (TetK), respectivamente. Foram determinadas por meio da técnica de microdiluição em caldo nutritivo os valores das concentrações inibitória mínima (CIM) dos antibióticos e dos derivados sintéticos, e para avaliar a atividade moduladora, as CIM dos antibióticos e do brometo de etídeo foram determinadas na ausência e na presença de concentrações subinibitórias dos compostos sintéticos. Os compostos ensaiados não mostraram atividade antibacteriana efetiva para a maioria dos compostos nas concentrações testadas, exibindo CIM variando entre (16 à >256 μg/mL). Quando combinados com os antibióticos tetraciclina e eritromicina alguns reduziram suas CIM em 2 e 4 vezes respectivamente. Entretanto quando combinado com norfloxacina, exceto apenas um composto, todos os derivados guanilhidrazônicos em diferentes proporções e graus de sensibilidade, foram capazes de potencializar o efeito deste antibiótico, apresentando três compostos que reduziram sua CIM até 16 vezes, 32 vezes para brometo de etídeo e 8 vezes para berberina usados como controles positivos para bomba NorA. Os estudos de docking molecular mostrou que tanto a norfloxacina quanto o composto 13 reconhecem o mesmo sítio de ligação na bomba NorA, sugerindo um mecanismo competitivo para atividade moduladora a drogas. Estes resultados aqui apresentados relatam pela primeira vez, o potencial de derivados guanilhidrazônicos em ser putativos inibidores dos sistemas de efluxo bacterianos, em especial para estirpes de Staphylococcus aureus.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:16:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 WanessaAB_DISSERT.pdf: 3799185 bytes, checksum: ce77744774059676a04175b60c73d121 (MD5) Previous issue date: 2014-03-26 / The synthetic guanylhydrazones WE010 (3,5-di-tert-butil-4-hidroxibenzaldehyde-guanylhydrazone), WE014 (4-bifenilcarboxialdehydeguanylhydrazone) and WE017 (3,4-diclorobenzaldehydeguanylhydrazone) showed high cytotoxic activity in terms of percentage inhibition of cancer cells growth. However, further progress in the development of these drug candidates requires precise and convenient methods for their qualitative and quantitative analyses. The aim of this study was to develop and validate High Performance Liquid Chromatography with diode-array detection (HPLC-DAD) and Ultra Fast Liquid Chromatography with diode-array detection (UFLC-DAD) methods suitable for as simultaneous as isolated determination of studied guanylhydrazones, based on the optimization of chromatographic parameters and obtaining reduced detection times. The chromatographic analyses of analytes by HPLC were performed on C18 ACE analytical column (150 mm x 4.6 mm), with a particle size of 5.0 ?m. Among all the conditions assayed, the best results of separation were obtained with a mixture of methanol:water (60:40, v/v) as the mobile phase at a flow rate 1.5mL/min and pH of 3.5 adjusted at acetic acid. The UFLC method was developed by experimetal desing techniques in order to find optimal chromatographic analytical conditions, which were achieved on XR-ODS analytical column (50 mm x 3.0 mm), with a particle size of 2,2 ?m, maintained at 25 ?C. The mobile phase was consisted of methanol:water (65:35, v/v) with 0.1% triethylamine (TEA) and pH of 3.5 adjusted at acetic acid, at a flow rate 0.5 mL/min. The procedure were validated following evaluating parameters such as specificity, linearity, limits of detection (LD) and quantification (LQ), precision, accuracy and robustness, giving results within the acceptable range. Although the UFLC method shows better sensitivity (lower values of LD and LQ), robustness (lower rates of relative standard deviation) and minimize spending time and solvent, both developed methods were adequately applied to the analysis of guanylhydrazones molecules, may be used in routine of quality control laboratories. Keywords: guanylhydrazones, HPLC/DAD, UFLC/DAD, validation of analitical method / As guanilhidrazonas sint?ticas WE010 (3,5-di-tert-butil-4-hidroxibenzalde?do-guanilhidrazona), WE014 (4-bifenilcarboxialde?doguanilhidrazona) e WE017 (3,4-diclorobenzalde?doguanilhidrazona) apresentaram alta atividade citot?xica em rela??o a inibi??o do crescimento de c?lulas cancer?genas. Contudo, o avan?o no desenvolvimento desses candidatos a f?rmacos necessitam de m?todos precisos para suas adequadas an?lises quantitativas e qualitativas. O objetivo desse estudo foi desenvolver e validar m?todos por Cromatografia L?quida de Alta Efici?cia com Detector de Arranjo Diodo (CLAE-DAD) e Cromatografia L?quida de Ultra Efici?cia com Detector de Arranjo Diodo (CLUE-DAD) adequados para a determina??o simult?nea, bem como isolada das guanilhidrazonas em estudo, baseado na otimiza??o de par?metros cromatogr?ficos e obten??o de tempos reduzidos de detec??o. As an?lises cromatogr?ficas por CLAE foram realizadas numa coluna anal?tica C18 ACE (150 mm x 4,6 mm), com tamanho de part?cula de 5,0 ?m. Dentre as condi??es analisadas, os melhores resultados de separa??o foram obtidos com uma fase m?vel composta por metanol:?gua (60:40), em um fluxo de 1,5 mL/min. e um pH de 3,5 ajustado com ?cido ac?tico. O m?todo por CLUE foi desenvolvido a partir de t?cnicas de planejamento fatorial, com o objetivo de se encontrar as melhores condi??es anal?ticas, que foram obtidas a partir de an?lise em uma coluna XR-ODS (50 mm x 3,0 mm), com tamanho de part?cula de 2,2 ?m, mantida a 25 ?C. A fase m?vel foi constitu?da por metanol:?gua (65:35) com 0,1% de Trietilamina (TEA) e pH de 3,5 ajustado com ?cido ac?tico. Os procedimentos foram validados a partir da avalia??o de par?metros de especificidade, linearidade, limites de detec??o (LD) e quantifica??o (LQ), precis?o exatid?o e robustez, obtendo-se resultados dentro do intervalo aceit?vel. Embora o m?todo por CLUE tenha mostrado melhor sensibilidade (menores valores de LD e LQ), robustez (menores ?ndices de desvio padr?o relativo) e minimizado gastos de tempo e solvente, ambos os m?todos desenvolvidos foram adequadamente aptos para as an?lises das mol?culas de guanilhidrazonas, podendo ser utilizados na rotina de laborat?rios de controle de qualidade