Einleitung: Das Darmmikrobiom, ein hochkomplexes Ökosystem an Mikroorganismen, geht eine lebenslange wechselseitige Beziehung mit seinem Wirt ein und beeinflusst wesentlich dessen Darmreifung post partum. Dazu interagieren Darmbakterien direkt und indirekt mit den intestinalen Stammzellen in den Krypten und regulieren Zellteilung und -differenzierung, wobei die Mechanismen nicht abschließend geklärt sind. Das Darmmikrobiom stellt eine wichtige Quelle für Mikroben-assoziierte molekulare Muster (MAMPs) dar, die von Mustererkennungsrezeptoren wie den Toll-like-Rezeptoren (TLR) auf den intestinalen Epithelzellen erkannt werden können. Somit können TLR auf den intestinalen Epithelzellen eine mögliche Verbindung zwischen Darmmikrobiom und Anpassungsreaktionen der Dünndarmmorphologie darstellen. Ziele der Untersuchung: Folgende Hypothesen sollten untersucht werden: 1. Die Anwesenheit von Darmbakterien beeinflusst die Morphologie der Dünndarmschleimhaut. 2. Diese Wirkung wird über Toll-like-Rezeptoren und den Hedgehog-Signalweg in Epithelzellen vermittelt. 3. Über diese Signalwege werden auch funktionelle Eigenschaften wie die Durchlässigkeit der Darmbarriere verändert. Tiere, Material und Methoden: Zur Untersuchung des Einflusses des Mikrobioms wurden in einem gnotobiotischen Mausmodell keimfreie Tiere mit dem minimalen mikrobiellen Konsortium Altered Schaedler Flora (ASF) besiedelt. Die ASF, welche sich aus acht definierten Bakterienarten zusammensetzt, wurde aus dem Caecum ASF-besiedelter C3H/HeNTac-Mäuse entnommen und männlichen und weiblichen keimfreien C57BL/6J-Mäusen appliziert. Der Nachweis der Bakterienspezies erfolgte aus bakterieller DNA, die aus frischen Kotpellets isoliert wurde. Der Vergleich wurde zwischen Dünndärmen ASF-kolonisierter Mäuse (n = 13), keimfreien Tieren (n = 8), konventionell gehaltenen (n = 7) und einer Gruppe Antibiotika-behandelter Mäuse (n = 8) durchgeführt. Zur Untersuchung des Einflusses der Toll-like-Rezeptoren TLR2 und TLR4 wurden epithelspezifische TLR2-defiziente (TLR2ΔIEC) bzw. TLR4-defiziente Mäuse (TLR4ΔIEC) verwendet und mit ihren jeweiligen Wildtyp-Geschwistertieren (WT) verglichen. Die morphometrische Eigenschaften des Dünndarms wurden anhand von histologischen Schnitten untersucht, die mit Hämatoxylin-Eosin oder Periodic-Acid-Schiff gefärbt waren. Hierbei wurden u.a. Mukosahöhe und Villuslänge gemessen sowie die Anzahl der Epithelzellen und Anzahl der Becherzellen pro Villus gezählt. Weiterhin wurden sowohl in Dünndarmgewebe als auch in isolierten intestinalen Epithelzellen mittels qPCR die mRNAExpression der Liganden des Hedgehog (Hh)-Signalwegs Sonic Hedgehog (Shh) und Indian Hedgehog (Ihh) sowie Hedgehog-Zielgene wie Glioma-associated oncogene transcription factor 1 (Gli-1), Patched-1 (Ptch-1) und Hedgehog Interacting Protein (Hhip) untersucht. In einem Teil der Tiere wurde der Hedgehog-Signalweg durch Applikation des Inhibitors Vismodegib gehemmt. Ein möglicher Einfluss auf die Permeabilität des Dünndarms wurde über die mRNA-Expression diverser Tight Junction-Proteine wie Occludin oder Claudin-4 sowie durch einen Permeabilitätsassay mit FITC-Dextran untersucht. Gruppenvergleiche wurden mit einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) und Holm-Šídák post-hoc Test bzw. zwischen den TLR2ΔIEC oder TLR4ΔIEC und WT-Mäusen mittels zweiseitigem ungepaarten t-Test durchgeführt. Unterschiede wurden bei P < 0,05 als statistisch signifikant betrachtet. Ergebnisse: Durch den Nachweis aller acht Bakterienarten in den Kotproben der behandelten Mäuse konnte die erfolgreiche Übertragung der ASF auf die Empfängertiere nachgewiesen werden. Hinsichtlich Mukosahöhe, Villuslänge, Anzahl der Epithelzellen und der Becherzellen wiesen keimfreie gegenüber konventionell gehaltenen Mäusen signifikant höhere Werte auf. Die Kolonisierung mit ASF führte zu einer signifikanten Verringerung dieser Merkmale, so dass sie sich denen der konventionell gehaltenen Tiere annäherten. Die mRNA-Expression der Hh-Liganden Shh und Ihh war sowohl im Dünndarm als auch in isolierten intestinalen Epithelzellen ASF-besiedelter Mäuse signifikant erhöht. Die Hh-Zielgene Gli-1, Ptch-1 und Hhip waren auf mRNA-Ebene im Dünndarm ASF-besiedelter Mäuse ebenfalls signifikant höher exprimiert. Mukosahöhe, Epithelzellzahl und Villuslänge waren im Jejunum von TLR2ΔIEC- und TLR4ΔIEC-Mäusen gegenüber ihren WT-Geschwistern signifikant höher. Während bei TLR2ΔIEC-Mäusen außer Shh alle untersuchten Hh-Zielgene vermehrt exprimiert waren, waren bei TLR4ΔIEC-Mäusen die gleichen Gene signifikant weniger exprimiert. Wurde hingegen der Hh-Signalweg in konventionell gehaltenen C57BL/6-Mäusen mit Vismodegib inhibiert, waren der Expression der Hh-Zielgene, des TLR2 und des TLR4 signifikant vermindert. Sowohl die Hemmung des Hh-Signalwegs mit Vismodegib als auch das Fehlen der epithelialen TLR2 oder TLR4 bedingte eine verminderte Expression von Tight Junction-Proteinen, die mit einer erhöhten Darmpermeabilität einherging. Konventionell gehaltene Mäuse hatten sowohl gegenüber keimfreien als auch gegenüber mit ASF besiedelten Tieren eine signifikant niedrigere Expression von Tight Junction-Proteinen, was mit einer signifikant höheren Darmpermeabilität verbunden war. Schlussfolgerungen: Zusammenfassend lassen die Ergebnisse dieser Studie darauf schließen, dass Darmbakterien über intestinale TLR2 und TLR4 den Hh-Signalweg regulieren und darüber die Morphologie der Dünndarmmukosa als auch deren funktionelle Eigenschaften wie die Durchlässigkeit der Darmbarriere beeinflussen. / Introduction: The intestinal microbiome, a highly complex ecosystem of microorganisms, enters into a lifelong reciprocal relationship with its host and significantly influences its intestinal maturation postpartum. To this end, intestinal bacteria interact directly and indirectly with intestinal stem cells in the crypts and regulate cell division and differentiation, although the mechanisms are not conclusively understood. The intestinal microbiome represents an important source of microbeassociated molecular patterns (MAMPs) that can be recognized by pattern recognition receptors such as Toll-like-Receptors (TLRs) on intestinal epithelial cells. Thus, TLRs on intestinal epithelial cells may represent a potential link between gut microbiome and adaptation responses of small intestinal morphology. Aims: The following hypotheses should be investigated: 1. The presence of intestinal bacteria affects the morphology of the small intestinal mucosa. 2. This effect is mediated via Toll-like-Receptors and the Hedgehog signaling pathway in epithelial cells. 3. Functional properties such as the permeability of the intestinal barrier are also altered via these signaling pathways. Animals, materials and methods: To investigate the influence of the microbiome, germ-free animals were colonized with the minimal microbial consortium Altered Schaedler Flora (ASF) in a gnotobiotic mouse model. The ASF, which is composed of eight defined bacterial species, was harvested from the caecum of ASF-colonized C3H/HeNTac mice and applied to male and female germ-free C57BL/6J mice. Bacterial species were detected from bacterial DNA isolated from fresh fecal pellets. Comparison was made between small intestines of ASF-colonized mice (n = 13), germ-free animals (n = 8), conventionally housed (n = 7), and a group of antibiotic-treated mice (n = 8). To investigate the influence of Toll-like-Receptors TLR2 and TLR4, epithelial-specific TLR2-deficient (TLR2ΔIEC) or TLR4-deficient mice (TLR4ΔIEC) were used and compared with their respective wild-type (WT) littermates. Morphometric characteristics of the small intestine were examined using histological sections stained with hematoxylin-eosin or periodic-acid-Schiff. Here, mucosa height and villus length were measured, and the number of epithelial cells and number of goblet cells per villus were counted, among other measurements. Furthermore, mRNA expression of the ligands of the Hedgehog (Hh) signaling pathway Sonic Hedgehog (Shh) and Indian Hedgehog (Ihh) as well as Hedgehog target genes such as Gliomaassociated oncogene transcription factor 1 (Gli-1), Patched-1 (Ptch-1) and Hedgehog Interacting Protein (Hhip) were examined in small intestinal tissue as well as in isolated intestinal epithelial cells by qPCR. In a subset of animals, Hedgehog signaling was inhibited by application of the inhibitor Vismodegib. A possible influence on small intestinal permeability was investigated by mRNA expression of various tight junction proteins such as Occludin or Claudin-4 and by permeability assay with FITC-dextran. Group comparisons were performed with a one-way analysis of variance (ANOVA) and Holm-Šídák post-hoc test or between the TLR2ΔIEC or TLR4ΔIEC and WT mice by two-tailed unpaired t test. Differences were considered statistically significant at P < 0.05. Results: Detection of all eight bacterial species in the fecal samples of treated mice demonstrated successful transfer of ASF to recipient animals. In terms of mucosa height, villus length, number of epithelial cells and goblet cells, germ-free mice had significantly higher values compared to conventionally housed mice. Colonization with ASF significantly decreased these characteristics to approach those of conventionally housed animals. The mRNA expression of the Hh ligands Shh and Ihh was significantly increased in the small intestine as well as in isolated intestinal epithelial cells of ASF colonized mice. The Hh target genes Gli-1, Ptch-1, and Hhip were also significantly higher expressed at the mRNA level in the small intestine of ASF-colonized mice. Mucosa height, epithelial cell number, and villus length were significantly higher in the jejunum of TLR2ΔIEC and TLR4ΔIEC mice compared with their WT littermates. Whereas in TLR2ΔIEC mice, except for Shh, all Hh target genes examined were increased in expression, the same genes were significantly less expressed in TLR4ΔIEC mice. In contrast, when the Hh pathway was inhibited with Vismodegib in conventionally maintained C57BL/6J mice, the expression of Hh target genes, TLR2, and TLR4 were significantly decreased. Both inhibition of the Hh pathway with Vismodegib and absence of epithelial TLR2 or TLR4 caused decreased expression of tight junction proteins, which was associated with increased intestinal permeability. Conventionally housed mice had significantly lower expression of tight junction proteins compared with both germ-free and ASF-populated animals, which was associated with significantly higher intestinal permeability. Conclusions: In summary, the results of this study suggest that intestinal bacteria regulate the Hh signaling pathway via intestinal TLR2 and TLR4 and thereby influence the morphology of the small intestinal mucosa as well as its functional properties such as intestinal barrier permeability.

<p>The crossing of host barriers (intestinal, blood-brain, and placental) is a critical step for systemic infections caused by entero-invasive pathogens. In the intestine, the epithelial cells are the first line of defense against enteric pathogens. <i>Listeria monocytogenes</i> is a facultative-intracellular foodborne pathogen that first crosses the intestinal barrier to cause a systemic infection. However, the underlying mechanism is not well understood.</p><p><br></p> <p>We demonstrate that <i>Listeria</i> adhesion protein (LAP) promotes the translocation of <i>L. monocytogenes </i>across the intestinal barrier in mouse models (A/J and C57BL/6). Relative to the wild-type (WT; serotype 4b) or the isogenic bacterial invasion protein Internalin A mutant (Δ<i>inlA</i>) strain, the <i>lap^─</i> strain showed significant defect in translocation across the intestinal barrier and colonization of the mesenteric-lymph nodes, liver and spleen in the early phase of infection (24 h and 48 h). LAP induces intestinal epithelial barrier dysfunction for increased translocation as evidenced by increased permeability to 4-kDa FITC-dextran (FD4), a marker of paracellular permeability, in the serum and urine of WT and Δ<i>inlA</i>- infected mice and across Caco-2 cell barrier, but not the <i>lap^─</i> mutant strain. Microscopic examination confirmed localization of the WT and Δ<i>inlA</i> strains in the tight junction, a crucial barrier of intestinal paracellular permeability, in the mouse ileal tissue but the <i>lap^─</i> strain remained confined in the lumen. LAP also upregulates TNF-α and IL-6 in intestinal epithelia of mice and in Caco-2 cells for increased permeability. </p><p><br></p> <p>Investigation of the underlying molecular mechanisms of LAP-mediated increase in intestinal permeability by using <i>lap^─</i> mutant strain, purified LAP and shRNA-mediated Hsp60 suppression, we demonstrate that LAP interacts with its host receptor, Hsp60, and activates the canonical NF-κB signaling, which in turn facilitates myosin light-chain kinase (MLCK)-mediated opening of the epithelial barrier via the cellular redistribution of major epithelial junctional proteins claudin-1, occludin, and E-cadherin. Pharmacological inhibition of NF-κB or MLCK in cells or genetic ablation of MLCK in mice (C57BL/6) prevents mislocalization of epithelial junctional proteins, intestinal permeability and <i>L. monocytogenes</i> translocation across the intestinal barrier.</p> <p><br></p><p>Furthermore, LAP also promotes <i>L. monocytogenes </i>translocation across the intestinal barrier and systemic dissemination in a Mongolian gerbil that are permissive to the bacterial invasion proteins; InlA-and InlB-mediated pathways; similar to that in humans. We show a direct LAP-dependent and InlA-independent pathway<i> </i>for <i>L. monocytogenes</i> paracellular translocation across the intestinal epithelial cells that do not express luminally accessible E-cadherin. Additionally, we show a functional InlA/E-cadherin interaction pathway that aids <i>L. monocytogenes</i> translocation by targeting cells with luminally accessible E-cadherin such as cells at the site of epithelial cell extrusion, epithelial folds and mucus-expelling goblet cells. Thus, <i>L. monocytogenes</i> uses LAP to exploit epithelial innate defense in the early phase of infection to cross the intestinal epithelial barrier, independent of other invasion proteins.</p><p><br></p> <p>This work fills a critical gap in our understanding of <i>L. monocytogenes </i>pathogenesis and sheds light to the complex interplay between host-pathogen interactions for bacterial crossing of the crucial intestinal barrier.</p> <br>