Les gliomes infiltrants du tronc cérébral (DIPG) sont les gliomes pédiatriques les plus agressifs. Leur localisation dans le pont de Varole et leur caractère infiltrant les rendent inopérables. Le manque de matériel biologique et l’absence de modèles pertinents ont longtemps freiné le développement de nouvelles thérapies. Le séquençage du génome entier de ces tumeurs a identifié la substitution K27M des gènes d’histone HIST1H3B/C et H3F3A comme mutation somatique initiatrice des DIPG. Bien que partageant la mutation sur le même résidu, notre laboratoire a montré que les tumeurs mutées dans le gène codant H3.1 ou H3.3 définissent des sous-groupes de DIPG avec des programmes oncogéniques, propriétés d’invasion et survies différents.Dans ce contexte, le premier objectif de ma thèse a consisté à développer des modèles in vitro et in vivo pertinents de la maladie. Pour ce faire, nous avons dissocié des biopsies fraiches de DIPG naïves de tout traitement et avons, de manière systématique, mis en culture une moitié de la suspension dans du milieu sans sérum pour permettre l’expansion de cellules souches de gliomes (GSC). En parallèle, l’autre moitié a été directement injectée par stéréotaxie dans le cerveau de souris immunodéprimées, pour obtenir des modèles de xénogreffes dérivés de patients (PDX). De plus, nous avons obtenu un second type de modèle in vivo de DIPG à partir des cellules tumorales en culture greffées dans le tronc par stéréotaxie (CDX). Au préalable, les GSC ont été modifiées pour exprimer de manière stable la protéine fluorescente mKate2 et l’enzyme Luciférase, permettant le suivi longitudinal de la croissance tumorale. Nous avons pu générer des GSCs issues de 26 patients différents mutées dans le gène codant H3.1 ou H3.3 et qui maintiennent leurs propriétés de cellules souches in vitro. De plus, nous avons généré 8 modèles PDX et 6 modèles CDX développant des tumeurs infiltrantes et présentant les mêmes symptômes neurologiques que les patients. Conformément aux données cliniques, nos modèles in vivo mutés H3.3 ont développé des tumeurs infiltrant le parenchyme plus rapidement que les modèles H3.1. En somme, ces résultats indiquent que nous avons réussi à générer des modèles de DIPG à partir d’échantillons naïfs de tout traitement, et qui récapitulent les aspects cliniques et moléculaires de ce cancer.Nous avons ensuite profité des modèles GSCs pour étudier les mécanismes moléculaires qui conduisent au phénotype invasif. Dans un premier temps, nous avons montré que l’expression de CXCR4, un récepteur de chimiokines, est corrélée à la capacité migratoire des GSC in vitro. Cependant, l’inhibition de CXCR4 par un antagoniste n’a montré d’efficacité que dans une partie des GSC testées, suggérant l’implication d’autres voies de signalisations dans leur motilité. Aussi, dans le but d’identifier de manière non biaisée de nouveaux mécanismes moléculaires impliqués dans la migration des GSC, nous avons analysé le profil transcriptomique de 13 GSC présentant une mutation K27M dans les gènes codant H3.1 ou H3.3 par séquençage de l’ARN. Nous avons ensuite sélectionné les gènes dont le niveau d’expression était corrélé à la vitesse de migration des différentes GSCs. Ainsi, nous avons découvert plusieurs candidats, parmi lesquels CXCL10, le ligand du récepteur aux chimiokines CXCR3, et SPSB4, une ubiquitine-ligase, qui sont surexprimés dans les tumeurs migrant rapidement. L’implication de ces 2 gènes dans la migration sera étudiée in vitro et in vivo dans des expériences de perte de fonction en utilisant des constructions exprimant des shARN inductibles.Au total, ce travail a permis le développement de modèles pertinents de DIPG qui récapitulent les caractéristiques de la tumeur dont ils dérivent et qui reflètent l’hétérogénéité interindividuelle observée chez les patients. De plus, cette étude a permis la découverte de nouveaux mécanismes moléculaires qui favorisent la migration de ces cellules tumorales très particulières. / Diffuse Instrincic Pontine Gliomas (DIPG) are the most aggressive form of pediatric gliomas. They are infiltrative tumors originating from the brainstem. The lack of biological material and the absence of relevant models have for long hampered the development of new therapeutics. Whole genome sequencing of tumor DNA identified a K27M substitution in the histone genes HIST1H3B/C and H3F3A as a recurrent somatic driver mutation in DIPG. Despite sharing the mutation on the same residue, our lab demonstrated that H3.1- and H3.3-mutated tumors define distinct subgroups of DIPG with different oncogenic programs, overall survival or invasion properties.Thus, the first goal of my PhD project consisted in developing relevant in vitro and in vivo models from treatment-naive primary specimen of DIPG that would mimic the disease. To do so, our strategy has been to dissociate fresh biopsies upon reception from the operating room and systematically place one-half of the cell suspension in serum-free culture to allow the expansion of Glioma Stem-like cells (GSCs) while the other half is directly stereotactically injected into the brain of Nude mice to develop Patient-derived xenograft models (PDX). We also obtained a second type of in vivo DIPG models, Cell-derived Xenograft models (CDX), after stereotactic xenografting of GSCs. Cells were modified beforehand to stably express a fluorescent protein as well as the Firefly luciferase enzyme, thus allowing the longitudinal record of tumor growth. We succeeded in generating GSCs from 26 different patients harboring a K27M mutation either in H3.1 or H3.3, that maintained stemness properties in culture. In addition, we generated 8 PDX and 6 CDX models that developed infiltrative tumors with maintenance of DIPG hallmarks. All tumor-bearing mice displayed neurological disorders like impaired walking and/or hemi-paralysis, as observed in patients. In accordance with the clinical data, our H3.3-K27M in vivo models developed tumors faster than H3.1-K27M, as well as they infiltrate the parenchyma faster and deeper than H3.1-K27M models. Taken together, these results showed that we succeeded in generating models of DIPG from treatment-naïve samples that mimic the clinical and molecular aspects of the disease.We then took advantage of such GSCs models to decipher the molecular mechanisms driving the invasive phenotype of patients with DIPG. First, we showed that CXCR4 expression, a chemokine receptor, is correlated with the in vitro migration capacity of our cellular models of DIPG. However, inhibition using CXCR4-antagonist CXCR4 was only efficient in a subset of our models, suggesting that other signaling pathways could be involved in their motility. To further identify the molecular mechanisms involved in migration of GSCs in vitro in an unbiased manner, we profiled the transcriptome of 13 GSCs harboring both H3.1- and H3.3-K27M genotype by RNA-sequencing. We then selected genes which expression levels correlated with the migration speed of the different GSCs. We uncovered several candidates among which CXCL10, the ligand of the chemokine receptor CXCR3, and SPSB4, an ubiquitin-ligase, up-regulated in highly migrating tumor cells. The involvement of these 2 genes in migration will be investigated in vitro and in vivo in loss of function experiments using doxycycline-inducible shRNA expressing constructs.Altogether, this work allowed for the development of pertinent DIPG models that resemble the primary tumors they derive from and also reflect the inter-individual heterogeneity observed in patients. Additionally, we gained new insights on the molecular mechanisms promoting cell migration in these particular cells.

Les DIPG représentent les tumeurs cérébrales pédiatriques les plus sévères. Aucun progrès dans leur prise en charge n’a été accompli au cours des 50 dernières années et la radiothérapie ne demeure que transitoirement efficace. Récemment, une mutation somatique de l’histone H3 (K27M) spécifique des DIPG a été trouvée chez environ 95% des patients. Elle est aujourd’hui considérée comme l'événement oncogénique initiateur de ces tumeurs. Deux sous-groupes majeurs de patients présentant des programmes oncogéniques et une réponse à la radiothérapie distincts peuvent être définis en fonction du gène dans lequel l’altération survient, codant les variantes protéiques H3.1 ou H3.3. Nous avons réalisé deux cribles de létalité synthétique par ARN interférence ciblant le kinome humain afin d'identifier d’une part les gènes nécessaires à la survie des DIPG et d’autre part les gènes dont l’inhibition sensibilise ces tumeurs à la radiothérapie. Le double objectif de ce projet était de mieux comprendre la biologie sous-jacente à l’oncogenèse des DIPG et de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques.Nous avons mis en évidence 41 gènes requis pour la survie des DIPG sans effet délétère majeur sur des cellules contrôles normales. Parmi eux, nous avons identifié VRK3 codant une serine thréonine kinase dont les fonctions restent peu décrites à ce jour et qui n'avait jamais été associée préalablement à l'oncogenèse de DIPG. Nous avons pu confirmer par la suite que son inhibition conduit à un arrêt total de la prolifération des cellules de DIPG associé à d’importants changements morphologiques, plus particulièrement dans les tumeurs mutées pour H3.3-K27M. VRK3 constitue par conséquent une nouvelle cible thérapeutique prometteuse dans cette pathologie à l’issue fatale pour la totalité des patients.En parallèle, un crible de survie similaire a été réalisé en conjonction avec l’irradiation des cellules. Très peu d’ARN interférents ont permis de sensibiliser les cellules H3.3-K27M à la radiothérapie contrairement aux cellules H3.1-K27M. Ce travail nous a permis de mettre en évidence une différence significative de radiosensibilité des modèles vitro de DMG en fonction du sous-groupe de tumeurs considéré, H3.1- ou H3.3-K27M muté, conformément à la survie des patients observée suite à la radiothérapie. Ces résultats inédits laissent entrevoir des perspectives d’amélioration du traitement de référence des patients atteints de DIPG actuellement identique quelle que soit leur génotype. / DIPG is one of the most severe paediatric brain tumours. No progress has been made in their management over the past 50 years and radiotherapy remains only transiently effective. Recently, a specific somatic mutation in the histone H3 (K27M) has been found in approximately 95% of DIPG patients and can be considered as the oncogenic driver of these tumours. Two major subgroup of patients with distinct oncogenic program and response to radiotherapy can be defined according to the gene in which the alteration occurs, encoding the H3.1 or H3.3 protein variants. We performed two synthetic lethality screens by RNA interference targeting the human kinome in order to identify the genes responsible for DIPG cell survival, as well as those sensitizing tumour cells to radiotherapy after inhibition. The dual purpose of this project was to better understand the biology underlying oncogenesis of DIPGs and to discover new therapeutic targets.We identified 41 genes required for DIPG cell survival with no major deleterious effect on normal control cells. Among them, we identified VRK3, a serine threonine kinase never involved in DIPG oncogenesis with functions remaining poorly described to date. We have shown that its inhibition leads to a complete arrest of DIPG cell proliferation and is additionally associated with important morphological changes, more particularly in H3.3-K27M mutated tumours. VRK3 is therefore a promising new therapeutic target for all patients in this fatal pathology.In parallel, a similar survival screen was performed in conjunction to cell radiation and very few interfering RNAs enhance H3.3-K27M cell radiosensitivity, in contrast to H3.1-K27M cells. These data highlighted a significant difference in radiosensitivity of the DMG in vitro models in H3.1- versus H3.3-K27M mutated tumours, in a concordant way with patient survival following radiotherapy. These unprecedented results suggest new opportunities for improving the current treatment of DIPG patients regardless of their genotype.

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