Die Durchseuchungsrate der Bevölkerung in Deutschland mit den humanen ß-Herpesviren liegt zwischen 40 und 90%. Nach der Primärinfektion verbleiben die ß-Herpesviren latent in den Körperzellen und haben die Fähigkeit, z.B. nach körperlichem Stress, bei Immunsuppression oder unter UV-Strahlung erneut in den lytischen Vermehrungszyklus einzutreten. Die kommerziell erhältlichen serologischen Methoden für die Diagnostik der humanen ß Herpesviren haben sich in den letzten Jahren wenig weiterentwickelt. Der enzymgekoppelte Immunadsorptionstest (ELISA) und der Immunfluoreszenztest (IFT) sind die Standardmethoden für die Diagnostik der humanen ß-Herpesviren. Da bei der Bestimmung des IgM-Titers Kreuzreaktionen sowie falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse auftreten können, reicht der IgM-Titer als alleinige Aussage für die Diagnose einer akuten Infektion nicht aus. Weiterhin fehlt bei einer Superinfektion mit einem anderen Stamm des gleichen Virus oder im Falle einer Reaktivierung des Virus oft die IgM-Antwort. In diesen Fällen kann nur auf Grund des IgG-Titeranstieges eine Reaktivierung bzw. Superinfektion angenommen werden. Bei fehlender Immunkompetenz bleibt der Anstieg des IgG-Titers jedoch oft aus. Serologische ELISA-IgG-Tests und IFT-IgG-Tests auf der Basis von Mischantigenen für den Nachweis von HCMV- oder HHV6-Reaktivierungen zeigen bei immunsupprimierten Patienten zurückliegende Infektionen bzw. Reaktivierungen an. Kommerzielle Western Blots für den Nachweis von IgG-Antikörpern gegen „late antigens“ der Zytomegalieviren sind verfügbar, werden aber nur in Speziallaboratorien eingesetzt. Weiterhin ist eine Differenzierung der Subtypen HHV6 A und HHV6 B mit den kommerziell erhältlichen Methoden wie ELISA und IFT nicht möglich. Eine Unterscheidung der Subtypen HHV6 A und HHV6 B wäre aber auf Grund der Unterschiede in der Infektionsfähigkeit, im Replikationsmuster, in der Epidemiologie und der Pathogenität wünschenswert. Im Rahmen des BMBF-Projektes Bioresponse (Projektträger Jülich: Förderkennzahl beim BMBF: 03WKR03E) und der nachfolgenden Stipendiatenförderung durch die Jürgen-Manchot-Stiftung wurden für eine differenzierte ß-Herpesvirusdiagnostik auf Basis des Mikroblots je zehn HCMV- und HHV6-Antigene exprimiert und evaluiert. Die Mikroblottechnologie - eine an Mikrowellplatten angepasste und miniaturisierte Form der Streifentesttechnologie - ermöglicht den simultanen Nachweis von bis zu zehn Antigen-spezifischen IgG Antikörpern bei geringem Proben- und Reagenzienverbrauch. Von in der Literatur als antigen beschriebenen Strukturproteinen und Nichtstrukturproteinen der Betaherpesviren wurden Proteinbereiche mit und ohne bekannten Epitopen ausgewählt und als Fusionsproteine in BL-21 Zellen exprimiert. Jeweils zehn über die Ni-NTA-Agarose-Säule aufgereinigte virusspezifische Fusionsantigene wurden zur Herstellung der Mikroblots eingesetzt. Der HCMV-IgG-Mikroblot und der HHV6-IgG-Mikroblot wiesen zu den kommerziell erhältlichen serologischen Testsystemen (HHV6 IgG-IFT von Euroimmun, Lübeck, HCMV-IgG-ELISA von Dade Behring, Marburg, HCMV IgG recom Blot von Mikrogen, Neuried) vergleichbare Sensitivitäten auf. Im Vergleich zum HHV6-IgG-ELISA (Panbio, Rüsselsheim) ist der HHV6 IgG-Mikroblot die empfindlichere Nachweismethode. Die Spezifität des HHV6 IgG-Mikroblots ist mit den HHV6-Testsystemen (HHV6-IgG-IFT von Euroimmun, Lübeck, HHV6-IgG-ELISA von Panbio, Rüsselsheim) vergleichbar. Weiterhin wies der HCMV-IgG-Mikroblot im Vergleich zum kommerziell erhältlichen HCMV-IgG-ELISA (Dade Behring, Marburg) und zum HCMV-IgG-recom Blot (Mikrogen, Neuried) eine Spezifität von 80% bzw. 83% auf. Der Mikroblot hat sich als ein geeignetes diagnostisches Instrument erwiesen, um neben der Entwicklung des IgG-Antikörpertiters auch differenziert die Antigen-spezifischen IgG Antikörperantworten unter bestimmten Fragestellungen zu untersuchen. So ermöglicht der HHV6 IgG-Mikroblot erstmals eine serologische Unterscheidung von HHV6 A und HHV6 B monovalenten Seren und den Nachweis von HHV6 A/ B polyvalenten Seren. Die Mikroblottechnologie wurde primär für die serologische Testung von Seren und Plasmen etabliert. Mit dem HCMV-IgG-Mikroblot wäre aber auch eine Liquordiagnostik möglich. Jedoch konnte mit dem HHV6-IgG-Mikroblot vermutlich auf Grund nicht ausreichender Sensitivität eine Einsatzmöglichkeit in der Liquordiagnostik anhand dieser Arbeit wegen zu geringer Probenzahlen nicht gezeigt werden. In einer anschließenden Studie sollte dennoch die Eignung der HHV6-Antigene für die HHV6-Liquordiagnostik mit einem größeren Umfang an Liquores geprüft werden. Stabilitätstestungen zeigten, dass die Messergebnisse von am gleichen Tag wiederholt gemessenen Seren oder Plasmen reproduzierbar waren. An verschiedenen Tagen gemessene Seren und Plasmen wiesen jedoch unterschiedliche Messergebnisse auf. Mögliche Ursachen für die geringe Reproduzierbarkeit der Messergebnisse im Mikroblot sind die unterschiedlichen Epitopdichten ein und desselben Antigens in den Mikroblots, die unspezifische Hintergrundfärbung in den Mikroblots sowie die nicht konstante bivalente Gleichgewichts- und Bindungskonstante der IgG-Antikörper im Mikroblot. In folgenden Studien sollte durch eine Optimierung des Proteintransfers der Antigene auf die Nitrozellulosemembran eine gleiche Epitopdichte gewährleistet werden. Gleichzeitig muss der Algorithmus der Software dahingehend verbessert werden, dass dieser trotz einer möglichen Verunreinigung der Mikroblots oder schwacher Hintergrundfärbung die Markerbande erkennt und eine Auswertung gewährleistet werden kann. Die unspezifische Hintergrundfärbung in den Mikroblots sollte nach Absprache mit dem Hersteller durch den Einsatz alternativer Blockreagenzien weitgehend reduziert werden. Weiterhin muss die Cutoff-Grenze so definiert werden, dass eine bestmögliche Sensitivität bei optimaler Spezifität der Mikroblotmethode ermöglicht wird. Dieser Cutoff kann sowohl durch die Anzahl der reaktiven Antigene als auch durch die Färbungsstärke der Antigen-Antikörperreaktion mit einem spezifischen Antigen definiert werden. In einem zweiten klinisch orientierten Teil dieser Arbeit wurden mit der Mikroblottechnologie die HCMV- und HHV6-Antikörperantworten nach hämatopoetischer Stammzell-transplantation (HSZT) untersucht. Die HCMV- und HHV6-Antikörperverläufe der Patienten nach HSZT wiesen keinen Zusammenhang zwischen nachgewiesener Reaktivierung und IgG-Antikörperentwicklung auf. Der Nachweis einer HCMV- bzw. HHV6-Reaktivierung bzw. -Infektion nur auf Grundlage des IgG-Antikörpertiters ist bei immunsupprimierten Patienten daher nicht möglich. Es konnte nicht nach jeder positiven HCMV- bzw. HHV6 PCR ein IgG-Antikörperanstieg beobachtet werden, was vermutlich durch die Immunsuppression der Patienten bedingt war. Weiterhin konnten HCMV- bzw. HHV6 IgG Antikörperanstiege selten zeitnah zu positiven HCMV- bzw. HHV6-PCR-Nachweisen gezeigt werden. Im Gegensatz dazu wurden bei weiteren Patienten mit HCMV- bzw. HHV6-positiven Transplantatspendern trotz negativer PCR frühe HCMV- bzw. HHV6-IgG-Antikörperanstiege bis zu 180 Tage nach der HSZT nachgewiesen. Diese frühen IgG-Antikörperanstiege sind wahrscheinlich durch die mit dem Stammzelltransplantat übertragenen B Gedächtniszellen sowie Plasmazellen verursacht und tragen zur frühen Immunrekonstitution des Patienten bei. Chemoradioresistente langlebige Plasmazellen können ebenfalls eine Ursache für frühe IgG Antikörperanstiege bis zu 180 Tage nach der HSZT bei HCMV-positiven Patienten mit negativen HCMV- bzw. HHV6-Transplantatspendern oder bei Patienten mit positiven HCMV bzw. HHV6-Transplantatspendern darstellen. Während die HCMV-IgG-Antikörperverläufe der Patienten nach der HSZT unabhängig von den positiven HCMV-PCR-Nachweisen durch mehrere HCMV-IgG-Antikörperanstiege und abfälle gekennzeichnet waren, wiesen die HHV6-IgG-Antikörperverläufe unabhängig von den positiven HHV6-PCR-Nachweisen nur einen HHV6-IgG-Antikörperanstieg auf, der von einem HHV6-Antikörperabfall gefolgt wurde. Da HHV6-Reaktivierungen mit 14-28 Tagen kurz nach der HSZT und im Gegensatz zu HCMV-Reaktivierungen nur in einem kurzen Zeitfenster nachgewiesen wurden, ist vermutlich nur für diesen begrenzten Zeitraum HHV6-Antigen als Trigger für die Antikörper produzierenden Plasmazellen verfügbar. Ob gesunde Probanden nach einer HHV6-Infektion oder HHV6-Reaktivierung eine ähnliche Antikörperkinetik wie HSZT-Patienten aufweisen, sollte in einer Folgestudie untersucht werden. Mit der Mikroblottechnologie konnte ein Einfluss des HCMV-Serostatus vom Transplantatspender auf die HCMV-IgG-Antikörperentwicklung nach HSZT gezeigt werden. Überwiegend nur HCMV-positive Patienten mit positiven HCMV-Transplantatspendern wiesen unabhängig von der HCMV-Reaktivierung frühe IgG-Antikörperanstiege bis zu 180 Tage nach der HSZT auf. Diese frühen IgG-Antikörperanstiege sind durch die mit dem Stammzelltransplantat übertragenen B-Gedächtniszellen oder Plasmazellen sowie seltener durch chemoradioresistente Plasmazellen verursacht und können zu einer frühen Immunrekonstitution beitragen. Im Gegensatz zu der kommerziell erhältlichen ELISA-Technik kann mit dem Mikroblot neben der Antikörperkinetik auch differenziert die Entwicklung der Antigen-spezifischen IgG-Antikörperreaktionen untersucht werden. So konnte bei sieben von 22 Patienten trotz Abfall des HCMV-Antikörpertiters bzw. stabilem HCMV-Antikörpertiter eine Zunahme von einzelnen HCMV Antigen spezifischen IgG Antikörpern nach hämatopoetischer Stammzell-transplantation beobachtet werden. Diese einzelen IgG-Antikörperanstiege könnten serologisch auf eine HCMV-Reaktivierung hinweisen. Weiterhin konnte bei drei von zehn Patienten mit HCMV-negativen Transplantatspendern unabhängig vom HCMV-IgG-Antikörpertiter ein Wechsel der HCMV Antigen-spezifischen IgG Antikörpermuster ab dem 6. Monat beobachtet werden. Der Wechsel der HCMV Antigen-spezifischen IgG-Antikörpermuster verweist auf die Bildung von neuen IgG-Antikörper sezernierenden B-Lymphozyten und vermutlich auf einen Wechsel der B Lymphozytenpopulation vom Empfänger zum Spender. Der Wechsel der B Lymphozytenpopulation vom Empfänger zum Spender ist für den Patienten ein wichtiger Schritt für die Rekonstitution der B Lymphozyten nach HSZT. Mit dem HHV6-IgG-Mikroblot hingegen konnte ein Wechsel der Antigen-spezifischen IgG-Antikörper nicht beobachtet werden. Eine Unterscheidung der HHV6-Subtypen auf serologischer Basis nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation wurde neu etabliert. Alle sieben mit dem HHV6-IgG-Mikroblot nachgewiesenen HHV6-IgG-Antikörperanstiege zeigten sowohl HHV6 A Antigen-spezifische, als auch HHV6 B Antigen-spezifische IgG-Antikörperreaktionen. Jedoch zeigten vier von sieben Antikörperverläufen überwiegend HHV6 B Antigen-spezifische IgG-Antikörperreaktionen. Weiterhin konnten HHV6 B Antigen-spezifische IgG Antikörper früher als HHV6 A Antigen-spezifische IgG-Antikörper nachgewiesen werden. Auf Grund dieser Beobachtungen ist zu vermuten, dass der HHV6 B-Subtyp zu einem früheren Zeitpunkt und häufiger nach der HSZT als der HHV6 A-Subtyp reaktiviert.

Die Durchseuchungsrate der Bevölkerung in Deutschland mit den humanen ß-Herpesviren liegt zwischen 40 und 90%. Nach der Primärinfektion verbleiben die ß-Herpesviren latent in den Körperzellen und haben die Fähigkeit, z.B. nach körperlichem Stress, bei Immunsuppression oder unter UV-Strahlung erneut in den lytischen Vermehrungszyklus einzutreten. Die kommerziell erhältlichen serologischen Methoden für die Diagnostik der humanen ß Herpesviren haben sich in den letzten Jahren wenig weiterentwickelt. Der enzymgekoppelte Immunadsorptionstest (ELISA) und der Immunfluoreszenztest (IFT) sind die Standardmethoden für die Diagnostik der humanen ß-Herpesviren. Da bei der Bestimmung des IgM-Titers Kreuzreaktionen sowie falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse auftreten können, reicht der IgM-Titer als alleinige Aussage für die Diagnose einer akuten Infektion nicht aus. Weiterhin fehlt bei einer Superinfektion mit einem anderen Stamm des gleichen Virus oder im Falle einer Reaktivierung des Virus oft die IgM-Antwort. In diesen Fällen kann nur auf Grund des IgG-Titeranstieges eine Reaktivierung bzw. Superinfektion angenommen werden. Bei fehlender Immunkompetenz bleibt der Anstieg des IgG-Titers jedoch oft aus. Serologische ELISA-IgG-Tests und IFT-IgG-Tests auf der Basis von Mischantigenen für den Nachweis von HCMV- oder HHV6-Reaktivierungen zeigen bei immunsupprimierten Patienten zurückliegende Infektionen bzw. Reaktivierungen an. Kommerzielle Western Blots für den Nachweis von IgG-Antikörpern gegen „late antigens“ der Zytomegalieviren sind verfügbar, werden aber nur in Speziallaboratorien eingesetzt. Weiterhin ist eine Differenzierung der Subtypen HHV6 A und HHV6 B mit den kommerziell erhältlichen Methoden wie ELISA und IFT nicht möglich. Eine Unterscheidung der Subtypen HHV6 A und HHV6 B wäre aber auf Grund der Unterschiede in der Infektionsfähigkeit, im Replikationsmuster, in der Epidemiologie und der Pathogenität wünschenswert. Im Rahmen des BMBF-Projektes Bioresponse (Projektträger Jülich: Förderkennzahl beim BMBF: 03WKR03E) und der nachfolgenden Stipendiatenförderung durch die Jürgen-Manchot-Stiftung wurden für eine differenzierte ß-Herpesvirusdiagnostik auf Basis des Mikroblots je zehn HCMV- und HHV6-Antigene exprimiert und evaluiert. Die Mikroblottechnologie - eine an Mikrowellplatten angepasste und miniaturisierte Form der Streifentesttechnologie - ermöglicht den simultanen Nachweis von bis zu zehn Antigen-spezifischen IgG Antikörpern bei geringem Proben- und Reagenzienverbrauch. Von in der Literatur als antigen beschriebenen Strukturproteinen und Nichtstrukturproteinen der Betaherpesviren wurden Proteinbereiche mit und ohne bekannten Epitopen ausgewählt und als Fusionsproteine in BL-21 Zellen exprimiert. Jeweils zehn über die Ni-NTA-Agarose-Säule aufgereinigte virusspezifische Fusionsantigene wurden zur Herstellung der Mikroblots eingesetzt. Der HCMV-IgG-Mikroblot und der HHV6-IgG-Mikroblot wiesen zu den kommerziell erhältlichen serologischen Testsystemen (HHV6 IgG-IFT von Euroimmun, Lübeck, HCMV-IgG-ELISA von Dade Behring, Marburg, HCMV IgG recom Blot von Mikrogen, Neuried) vergleichbare Sensitivitäten auf. Im Vergleich zum HHV6-IgG-ELISA (Panbio, Rüsselsheim) ist der HHV6 IgG-Mikroblot die empfindlichere Nachweismethode. Die Spezifität des HHV6 IgG-Mikroblots ist mit den HHV6-Testsystemen (HHV6-IgG-IFT von Euroimmun, Lübeck, HHV6-IgG-ELISA von Panbio, Rüsselsheim) vergleichbar. Weiterhin wies der HCMV-IgG-Mikroblot im Vergleich zum kommerziell erhältlichen HCMV-IgG-ELISA (Dade Behring, Marburg) und zum HCMV-IgG-recom Blot (Mikrogen, Neuried) eine Spezifität von 80% bzw. 83% auf. Der Mikroblot hat sich als ein geeignetes diagnostisches Instrument erwiesen, um neben der Entwicklung des IgG-Antikörpertiters auch differenziert die Antigen-spezifischen IgG Antikörperantworten unter bestimmten Fragestellungen zu untersuchen. So ermöglicht der HHV6 IgG-Mikroblot erstmals eine serologische Unterscheidung von HHV6 A und HHV6 B monovalenten Seren und den Nachweis von HHV6 A/ B polyvalenten Seren. Die Mikroblottechnologie wurde primär für die serologische Testung von Seren und Plasmen etabliert. Mit dem HCMV-IgG-Mikroblot wäre aber auch eine Liquordiagnostik möglich. Jedoch konnte mit dem HHV6-IgG-Mikroblot vermutlich auf Grund nicht ausreichender Sensitivität eine Einsatzmöglichkeit in der Liquordiagnostik anhand dieser Arbeit wegen zu geringer Probenzahlen nicht gezeigt werden. In einer anschließenden Studie sollte dennoch die Eignung der HHV6-Antigene für die HHV6-Liquordiagnostik mit einem größeren Umfang an Liquores geprüft werden. Stabilitätstestungen zeigten, dass die Messergebnisse von am gleichen Tag wiederholt gemessenen Seren oder Plasmen reproduzierbar waren. An verschiedenen Tagen gemessene Seren und Plasmen wiesen jedoch unterschiedliche Messergebnisse auf. Mögliche Ursachen für die geringe Reproduzierbarkeit der Messergebnisse im Mikroblot sind die unterschiedlichen Epitopdichten ein und desselben Antigens in den Mikroblots, die unspezifische Hintergrundfärbung in den Mikroblots sowie die nicht konstante bivalente Gleichgewichts- und Bindungskonstante der IgG-Antikörper im Mikroblot. In folgenden Studien sollte durch eine Optimierung des Proteintransfers der Antigene auf die Nitrozellulosemembran eine gleiche Epitopdichte gewährleistet werden. Gleichzeitig muss der Algorithmus der Software dahingehend verbessert werden, dass dieser trotz einer möglichen Verunreinigung der Mikroblots oder schwacher Hintergrundfärbung die Markerbande erkennt und eine Auswertung gewährleistet werden kann. Die unspezifische Hintergrundfärbung in den Mikroblots sollte nach Absprache mit dem Hersteller durch den Einsatz alternativer Blockreagenzien weitgehend reduziert werden. Weiterhin muss die Cutoff-Grenze so definiert werden, dass eine bestmögliche Sensitivität bei optimaler Spezifität der Mikroblotmethode ermöglicht wird. Dieser Cutoff kann sowohl durch die Anzahl der reaktiven Antigene als auch durch die Färbungsstärke der Antigen-Antikörperreaktion mit einem spezifischen Antigen definiert werden. In einem zweiten klinisch orientierten Teil dieser Arbeit wurden mit der Mikroblottechnologie die HCMV- und HHV6-Antikörperantworten nach hämatopoetischer Stammzell-transplantation (HSZT) untersucht. Die HCMV- und HHV6-Antikörperverläufe der Patienten nach HSZT wiesen keinen Zusammenhang zwischen nachgewiesener Reaktivierung und IgG-Antikörperentwicklung auf. Der Nachweis einer HCMV- bzw. HHV6-Reaktivierung bzw. -Infektion nur auf Grundlage des IgG-Antikörpertiters ist bei immunsupprimierten Patienten daher nicht möglich. Es konnte nicht nach jeder positiven HCMV- bzw. HHV6 PCR ein IgG-Antikörperanstieg beobachtet werden, was vermutlich durch die Immunsuppression der Patienten bedingt war. Weiterhin konnten HCMV- bzw. HHV6 IgG Antikörperanstiege selten zeitnah zu positiven HCMV- bzw. HHV6-PCR-Nachweisen gezeigt werden. Im Gegensatz dazu wurden bei weiteren Patienten mit HCMV- bzw. HHV6-positiven Transplantatspendern trotz negativer PCR frühe HCMV- bzw. HHV6-IgG-Antikörperanstiege bis zu 180 Tage nach der HSZT nachgewiesen. Diese frühen IgG-Antikörperanstiege sind wahrscheinlich durch die mit dem Stammzelltransplantat übertragenen B Gedächtniszellen sowie Plasmazellen verursacht und tragen zur frühen Immunrekonstitution des Patienten bei. Chemoradioresistente langlebige Plasmazellen können ebenfalls eine Ursache für frühe IgG Antikörperanstiege bis zu 180 Tage nach der HSZT bei HCMV-positiven Patienten mit negativen HCMV- bzw. HHV6-Transplantatspendern oder bei Patienten mit positiven HCMV bzw. HHV6-Transplantatspendern darstellen. Während die HCMV-IgG-Antikörperverläufe der Patienten nach der HSZT unabhängig von den positiven HCMV-PCR-Nachweisen durch mehrere HCMV-IgG-Antikörperanstiege und abfälle gekennzeichnet waren, wiesen die HHV6-IgG-Antikörperverläufe unabhängig von den positiven HHV6-PCR-Nachweisen nur einen HHV6-IgG-Antikörperanstieg auf, der von einem HHV6-Antikörperabfall gefolgt wurde. Da HHV6-Reaktivierungen mit 14-28 Tagen kurz nach der HSZT und im Gegensatz zu HCMV-Reaktivierungen nur in einem kurzen Zeitfenster nachgewiesen wurden, ist vermutlich nur für diesen begrenzten Zeitraum HHV6-Antigen als Trigger für die Antikörper produzierenden Plasmazellen verfügbar. Ob gesunde Probanden nach einer HHV6-Infektion oder HHV6-Reaktivierung eine ähnliche Antikörperkinetik wie HSZT-Patienten aufweisen, sollte in einer Folgestudie untersucht werden. Mit der Mikroblottechnologie konnte ein Einfluss des HCMV-Serostatus vom Transplantatspender auf die HCMV-IgG-Antikörperentwicklung nach HSZT gezeigt werden. Überwiegend nur HCMV-positive Patienten mit positiven HCMV-Transplantatspendern wiesen unabhängig von der HCMV-Reaktivierung frühe IgG-Antikörperanstiege bis zu 180 Tage nach der HSZT auf. Diese frühen IgG-Antikörperanstiege sind durch die mit dem Stammzelltransplantat übertragenen B-Gedächtniszellen oder Plasmazellen sowie seltener durch chemoradioresistente Plasmazellen verursacht und können zu einer frühen Immunrekonstitution beitragen. Im Gegensatz zu der kommerziell erhältlichen ELISA-Technik kann mit dem Mikroblot neben der Antikörperkinetik auch differenziert die Entwicklung der Antigen-spezifischen IgG-Antikörperreaktionen untersucht werden. So konnte bei sieben von 22 Patienten trotz Abfall des HCMV-Antikörpertiters bzw. stabilem HCMV-Antikörpertiter eine Zunahme von einzelnen HCMV Antigen spezifischen IgG Antikörpern nach hämatopoetischer Stammzell-transplantation beobachtet werden. Diese einzelen IgG-Antikörperanstiege könnten serologisch auf eine HCMV-Reaktivierung hinweisen. Weiterhin konnte bei drei von zehn Patienten mit HCMV-negativen Transplantatspendern unabhängig vom HCMV-IgG-Antikörpertiter ein Wechsel der HCMV Antigen-spezifischen IgG Antikörpermuster ab dem 6. Monat beobachtet werden. Der Wechsel der HCMV Antigen-spezifischen IgG-Antikörpermuster verweist auf die Bildung von neuen IgG-Antikörper sezernierenden B-Lymphozyten und vermutlich auf einen Wechsel der B Lymphozytenpopulation vom Empfänger zum Spender. Der Wechsel der B Lymphozytenpopulation vom Empfänger zum Spender ist für den Patienten ein wichtiger Schritt für die Rekonstitution der B Lymphozyten nach HSZT. Mit dem HHV6-IgG-Mikroblot hingegen konnte ein Wechsel der Antigen-spezifischen IgG-Antikörper nicht beobachtet werden. Eine Unterscheidung der HHV6-Subtypen auf serologischer Basis nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation wurde neu etabliert. Alle sieben mit dem HHV6-IgG-Mikroblot nachgewiesenen HHV6-IgG-Antikörperanstiege zeigten sowohl HHV6 A Antigen-spezifische, als auch HHV6 B Antigen-spezifische IgG-Antikörperreaktionen. Jedoch zeigten vier von sieben Antikörperverläufen überwiegend HHV6 B Antigen-spezifische IgG-Antikörperreaktionen. Weiterhin konnten HHV6 B Antigen-spezifische IgG Antikörper früher als HHV6 A Antigen-spezifische IgG-Antikörper nachgewiesen werden. Auf Grund dieser Beobachtungen ist zu vermuten, dass der HHV6 B-Subtyp zu einem früheren Zeitpunkt und häufiger nach der HSZT als der HHV6 A-Subtyp reaktiviert.:1. Einleitung 8 1.1 Humane Herpesviren 8 1.1.1 Die humanen Betaherpesviren 9 1.2 Nachweis der HCMV- und HHV6-Viren 11 1.2.1 Nachweis der HCMV- und HHV6-Viren mittels Virusanzucht 12 1.2.2 Nachweis der HCMV- und HHV6-Viren durch molekularbiologische Methoden 12 1.2.3 Nachweis der HCMV- und HHV6-Viren durch serologische Methoden 13 1.3 Multiparameterdiagnostik 14 1.4 B-Lymphozyten, die Produzenten der Antikörper 14 1.4.1 Bildung und Reifung von B-Lymphozyten 14 1.4.2 B-Zellaktivierung und Antikörperproduktion 15 1.4.3 Aufbau und Funktion des Immunglobulins G 16 1.5 Hämatopoetische Stammzelltransplantation 17 1.5.1 Rekonstitution der B-Lymphozyten nach hämatopoetischer Stammzell-transplantation (HSZT) 18 1.5.2 HCMV und HHV6, ein pathogenes Potential nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) 19 1.6 Zielstellung 21 2. Material und Methoden 22 2.1 Material 22 2.1.1 Geräte 22 2.1.2 Chemikalien und Substanzen 22 2.1.3 Medien 24 2.1.4 Zelllinie 24 2.1.5 Bakterien- und Virusstämme 24 2.1.6 Plasmide 25 2.1.7 Enzyme 25 2.1.8 DNA-Marker und Proteinmarker 25 2.1.9 Kits 25 2.1.10 Primer 26 2.2 Methoden 29 2.2.1 Expression der HCMV- und HHV6-Antigene 29 2.2.2 Evaluierung der viralen Antigene im Mikroblot 49 2.2.3 Vergleichsanalysen 50 2.3 Patientenproben 52 2.4 Statistische Methoden 52 3. Ergebnisse 53 3.1 Expression der HCMV- und HHV6-Antigene 53 3.1.1 Auswahl der Zielsequenzen 53 3.1.2 Klonierung der Zielsequenzen in den Expressionsvektor pet 28a (+) 54 3.1.3 Aufreinigung der Fusionsantigene 57 3.2 Evaluierung der Virusantigene im Mikroblot 59 3.2.1 Auswertung der Mikroblotdaten 62 3.2.2 Optimierung der Reaktionsbedingungen im Mikroblot 67 3.2.3 Plasma- und Liquordiagnostik – ein weiteres Einsatzfeld der Mikroblots 68 3.2.4 Untersuchungen zur Reproduzierbarkeit der Messergebnisse im Mikroblot 77 3.2.5 Sensitivitäts- und Spezifitätstestung des HCMV-Mikroblots 82 3.2.6 Sensitivitäts- und Spezifitätstestung des HHV6-Mikroblots 85 3.2.7 Beurteilung der Testseren mit dem HHV6-IgG-Mikroblot 89 3.2.8 Untersuchungen zur serologischen Unterscheidung der HHV6-positiven Seren 93 3.3 Antikörperkinetiken nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation 97 3.3.1 Entwicklung der HCMV spezifischen IgG-Antikörperantwort nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) 97 3.3.2 Entwicklung der HHV6 spezifischen IgG-Antikörperantwort nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) 100 4. Diskussion 104 4.1 Probleme der heterologen Proteinexpression 104 4.2 Grenzen der Aufreinigung über die Ni-NTA-Agarose-Säule 104 4.3 Semiquantitative Auswertung der Mikroblotdaten 105 4.4 Optimierung der Farbreaktion im Mikroblot 106 4.5 Seren, Plasmen und Liquores - im Mikroblot einsetzbare Probenmaterialien 107 4.5.1 Vergleich der Reaktivität von Seren und Plasmen im Mikroblot 107 4.5.2 Liquordiagnostik – Möglichkeiten und Grenzen mit dem Mikroblot 108 4.6 Untersuchungen zur Stabilität der Mikroblots 109 4.6.1 Reproduzierbarkeit der Messergebnisse in einem Reaktionsansatz 109 4.6.2 Signifikante Unterschiede bei wiederholter Messung an verschiedenen Tagen 110 4.7 HCMV-Mikroblot - ein sensitives diagnostisches Testsystem 111 4.8 Drei verschiedene HHV6-Testsysteme – drei verschiedene HHV6-Prävalenzen 112 4.9 Der Mikroblot – eine serologische Methode zur Unterscheidung von monovalenten HHV6 A- und HHV6 B-Seren 114 4.9.1 Serologische Dominanz des HHV6 B-Subtyps 115 4.9.2 Interpretation der IgG-Antikörperreaktionen mit den homologen HHV6-Antigenpaaren 116 4.10 Unterschiedliche HCMV- bzw. HHV6-IgG-Antikörperkinetiken nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) 118 4.11 Reduktion der HCMV-Reaktivierung durch HCMV-positive Transplantatspender 121 4.12 HCMV pp52-F1 Antigen-spezifische IgG-Antikörperreaktionen – möglicherweise ein Nachweis für HCMV-Reaktivierungen nach HSZT 122 4.13 Wechsel der Antigen-spezifischen IgG-Antikörpermuster 182, 204 und 283 Tage nach der HSZT 123 4.14 Differenzierung der HHV6 A-Antigen- und HHV6 B-Antigen-spezifischen Antikörperreaktionen nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) 123 5. Zusammenfassung, Ausblick und Perspektiven für die Mikroblottechnologie 125 6. Literatur 129 7. Danksagung: 142 8. Thesen 144

HHV-6 is a ubiquitous human herpesvirus. Most individuals become infected at the age of 2 years. Primary infection by the virus causes a self-limiting febrile illness called exanthem subitum or roseola. In adults, primary infection may cause mononucleosis-like illnesses. The infection usually remains latent in healthy individuals, but often reactivates in immunocompromised individuals, for example, transplant patients and AIDS patients. The virus has also been associated with cancers and lymphoproliferative disorders. The virus encodes two proteins that interact with p53. However, little is known concerning the impact of the virus on cell cycle progression in human cells. The investigations reported in the thesis were focused on this issue. We show here that that HHV-6 infection delays the cell cycle progression in human T cell line HSB-2, as well as in primary human T cells and causes their accumulation in S and G2/M phase. By degrading the viral DNA in the virus-infected cells, we show that the infected cells accumulate in the G2/M and not in the S phase. We observed an increase in the kinase activity of cdc2 in virus-infected cells despite lower levels of its catalytic partners, cyclin A and cyclin B. We show here that the viral early antigen p41 associates with, and increases the kinase activity of, CDK1. Our studies have shown that there is a drastic reduction of p21 protein, despite the virus-induced stabilization and activation of p53 suggesting that p53 may be transcriptionally inactivated in the virus-infected cells. This decrease of p21 in infected cells was partially restored by proteasome inhibitors. These results suggest that HHV-6 causes perturbations in the normal progression of cell cycle in human T cells. Autophagy is a physiological cell process during which old cellular constituents and long-lived proteins in cells are degraded. This process is regulated in a cell cycle-dependent manner. We show here that infection with HHV-6 induces autophagy in HSB-2 cells. This was shown by the induction of LC-3 II as well as by the appearance of autophagic vacuoles in the virus-infected cells. However, we found that the virus inhibits fusion between autophagic vacuoles and lysosomes formed in infected cells, thus evading the autophagic response of infected host cells. Finally we tried to investigate replication of the virus in human cells in the absence of P53; a tumor suppressor gene which is also known as "the guardian of the genome ". During these investigations, we found that that inhibition of p53 gene expression mediated by siRNA as well as its inhibition by pharmacological inhibitors leads to massive cell death in human T cell line HSB-2 that carries a wild-type p53. We show that this death also occurs in another cell line CEM, which carries a transcriptionally mutated p53. Interestingly, the cell death could be prevented by pharmacological inhibitors of autophagy and necroptosis. Taken together, our results provide important novel insights concerning the impact of HHV-6 on cell cycle regulation and autophagy as well as of basal level p53 in cell survival. / HHV-6 est un virus herpès humain ubiquitaire. La plupart des individus deviennent séropositifs à l’âge de 2 ans. L’infection primaire par HHV-6 donne lieu à une maladie fébrile chez les enfants, appelée exanthème subitum ou la roséole. Par contre, chez l'adulte, cette infection cause des maladies de type mononucléose. L'infection reste généralement latente chez les individus sains, mais elle se réactive souvent chez les personnes immunodéprimées, par exemple, chez les personnes greffées et les patients atteints du sida. HHV-6 a été associé à plusieurs types de cancers et de désordres lymphoprolifératifs. Ce virus induit l’immunosuppression et inhibe la prolifération des lymphocytes par les mitogènes. C’est pour toutes ces raisons que nous voulions savoir si ce virus dérègle le cycle cellulaire des cellules qu’il infecte. Les travaux réalisés durant cette thèse ont porté sur les changements induits dans les cellules humaines par ce virus au cours de la progression du cycle cellulaire. Nous avons montré que l'infection par HHV-6 retarde la progression du cycle cellulaire dans la lignée cellulaire T humaine HSB-2, ainsi que dans les lymphocytes T primaires humains pour les accumuler dans les phases S et G2/M. Cependant, après avoir traité les cellules avec la nucléase du Micrococcus, nous avons constaté que le cycle cellulaire des cellules infectées s’accumulait plutôt dans la phase G2/M. La nucléase dégrade préférentiellement l’ADN virale. Nous avons observé une augmentation de l'activité kinase de cdc2 dans les cellules infectées malgré une baisse des niveaux de ses partenaires catalytiques, la cycline A et la cycline B. Nos études ont montré qu’il y a une diminution drastique de la protéine p21 dans les cellules infectées, en dépit de la stabilisation et de l'activation de p53 induite dans ces cellules. Ce qui laisse penser que la protéine p53 pourrait être inactive sur le plan transcriptionnel dans les cellules infectées. Cette diminution de p21 dans les cellules infectées est partiellement restaurée après incubation des cellules dans un milieu de culture contenant des inhibiteurs du protéasome. En plus, nous démontrons ici qu’une protéine virale précoce, p41, s’associe et se fixe avec cdc2 et augmente son activité kinase. Tous ces résultats suggèrent que HHV-6 provoque des perturbations énormes dans la progression normale du cycle cellulaire dans les cellules T humaines. Dans ces études, nous avons démontré aussi que l’infection par HHV-6 induit l'autophagie dans les cellules HSB-2, comme il a été démontré par l’induction de LC-3 II et par la formation de vacuoles autophagiques dans les cellules qui sont infectées. Nos résultats indiquent que HHV-6 inhibe la fusion entre les vacuoles autophagiques formées et les lysosomes dans les cellules infectées modulant ainsi la réponse autophagique des cellules hôtes infectées. Nous avons trouvé aussi que l’inhibition de ce processus par un inhibiteur pharmacologique diminue la réplication virale. L'autophagie est un processus physiologique cellulaire pendant lequel les vieux constituants cellulaires (mitochondries, protéines cellulaires, etc) se dégradent. Le fait que ce processus soit modulé dans les cellules dépendantes des différentes phases du cycle cellulaire, nous a poussé à l’étudier. Enfin, nous essayons d’investiguer la réplication virale dans les cellules dépourvues de p53, le gène suppresseur de tumeur, qui contrôle la progression de cycle cellulaire. Nous avons émis l’hypothèse suivante, que ces virus peuvent mieux se répliquer dans les cellules n’exprimant pas le gène p53. En vérifiant cette hypothèse, nous avons trouvé que l'inhibition de l’expression de p53 provoquée par siRNA ou par un agent pharmacologique conduit à une mort cellulaire massive dans une lignée de cellules T humaines ayant un gène p53 de type sauvage. Nous démontrons que cette mort se produit aussi dans une autre lignée cellulaire dont le p53 est muté et qu’elle pourrait être évitée par des inhibiteurs d'autophagie ou de nécroptose. Nos observations mettent en évidence qu’un niveau d’expression basale de p53 est nécessaire à la survie cellulaire.

HHV-6 is a ubiquitous human herpesvirus. Most individuals become infected at the age of 2 years. Primary infection by the virus causes a self-limiting febrile illness called exanthem subitum or roseola. In adults, primary infection may cause mononucleosis-like illnesses. The infection usually remains latent in healthy individuals, but often reactivates in immunocompromised individuals, for example, transplant patients and AIDS patients. The virus has also been associated with cancers and lymphoproliferative disorders. The virus encodes two proteins that interact with p53. However, little is known concerning the impact of the virus on cell cycle progression in human cells. The investigations reported in the thesis were focused on this issue. We show here that that HHV-6 infection delays the cell cycle progression in human T cell line HSB-2, as well as in primary human T cells and causes their accumulation in S and G2/M phase. By degrading the viral DNA in the virus-infected cells, we show that the infected cells accumulate in the G2/M and not in the S phase. We observed an increase in the kinase activity of cdc2 in virus-infected cells despite lower levels of its catalytic partners, cyclin A and cyclin B. We show here that the viral early antigen p41 associates with, and increases the kinase activity of, CDK1. Our studies have shown that there is a drastic reduction of p21 protein, despite the virus-induced stabilization and activation of p53 suggesting that p53 may be transcriptionally inactivated in the virus-infected cells. This decrease of p21 in infected cells was partially restored by proteasome inhibitors. These results suggest that HHV-6 causes perturbations in the normal progression of cell cycle in human T cells. Autophagy is a physiological cell process during which old cellular constituents and long-lived proteins in cells are degraded. This process is regulated in a cell cycle-dependent manner. We show here that infection with HHV-6 induces autophagy in HSB-2 cells. This was shown by the induction of LC-3 II as well as by the appearance of autophagic vacuoles in the virus-infected cells. However, we found that the virus inhibits fusion between autophagic vacuoles and lysosomes formed in infected cells, thus evading the autophagic response of infected host cells. Finally we tried to investigate replication of the virus in human cells in the absence of P53; a tumor suppressor gene which is also known as "the guardian of the genome ". During these investigations, we found that that inhibition of p53 gene expression mediated by siRNA as well as its inhibition by pharmacological inhibitors leads to massive cell death in human T cell line HSB-2 that carries a wild-type p53. We show that this death also occurs in another cell line CEM, which carries a transcriptionally mutated p53. Interestingly, the cell death could be prevented by pharmacological inhibitors of autophagy and necroptosis. Taken together, our results provide important novel insights concerning the impact of HHV-6 on cell cycle regulation and autophagy as well as of basal level p53 in cell survival. / HHV-6 est un virus herpès humain ubiquitaire. La plupart des individus deviennent séropositifs à l’âge de 2 ans. L’infection primaire par HHV-6 donne lieu à une maladie fébrile chez les enfants, appelée exanthème subitum ou la roséole. Par contre, chez l'adulte, cette infection cause des maladies de type mononucléose. L'infection reste généralement latente chez les individus sains, mais elle se réactive souvent chez les personnes immunodéprimées, par exemple, chez les personnes greffées et les patients atteints du sida. HHV-6 a été associé à plusieurs types de cancers et de désordres lymphoprolifératifs. Ce virus induit l’immunosuppression et inhibe la prolifération des lymphocytes par les mitogènes. C’est pour toutes ces raisons que nous voulions savoir si ce virus dérègle le cycle cellulaire des cellules qu’il infecte. Les travaux réalisés durant cette thèse ont porté sur les changements induits dans les cellules humaines par ce virus au cours de la progression du cycle cellulaire. Nous avons montré que l'infection par HHV-6 retarde la progression du cycle cellulaire dans la lignée cellulaire T humaine HSB-2, ainsi que dans les lymphocytes T primaires humains pour les accumuler dans les phases S et G2/M. Cependant, après avoir traité les cellules avec la nucléase du Micrococcus, nous avons constaté que le cycle cellulaire des cellules infectées s’accumulait plutôt dans la phase G2/M. La nucléase dégrade préférentiellement l’ADN virale. Nous avons observé une augmentation de l'activité kinase de cdc2 dans les cellules infectées malgré une baisse des niveaux de ses partenaires catalytiques, la cycline A et la cycline B. Nos études ont montré qu’il y a une diminution drastique de la protéine p21 dans les cellules infectées, en dépit de la stabilisation et de l'activation de p53 induite dans ces cellules. Ce qui laisse penser que la protéine p53 pourrait être inactive sur le plan transcriptionnel dans les cellules infectées. Cette diminution de p21 dans les cellules infectées est partiellement restaurée après incubation des cellules dans un milieu de culture contenant des inhibiteurs du protéasome. En plus, nous démontrons ici qu’une protéine virale précoce, p41, s’associe et se fixe avec cdc2 et augmente son activité kinase. Tous ces résultats suggèrent que HHV-6 provoque des perturbations énormes dans la progression normale du cycle cellulaire dans les cellules T humaines. Dans ces études, nous avons démontré aussi que l’infection par HHV-6 induit l'autophagie dans les cellules HSB-2, comme il a été démontré par l’induction de LC-3 II et par la formation de vacuoles autophagiques dans les cellules qui sont infectées. Nos résultats indiquent que HHV-6 inhibe la fusion entre les vacuoles autophagiques formées et les lysosomes dans les cellules infectées modulant ainsi la réponse autophagique des cellules hôtes infectées. Nous avons trouvé aussi que l’inhibition de ce processus par un inhibiteur pharmacologique diminue la réplication virale. L'autophagie est un processus physiologique cellulaire pendant lequel les vieux constituants cellulaires (mitochondries, protéines cellulaires, etc) se dégradent. Le fait que ce processus soit modulé dans les cellules dépendantes des différentes phases du cycle cellulaire, nous a poussé à l’étudier. Enfin, nous essayons d’investiguer la réplication virale dans les cellules dépourvues de p53, le gène suppresseur de tumeur, qui contrôle la progression de cycle cellulaire. Nous avons émis l’hypothèse suivante, que ces virus peuvent mieux se répliquer dans les cellules n’exprimant pas le gène p53. En vérifiant cette hypothèse, nous avons trouvé que l'inhibition de l’expression de p53 provoquée par siRNA ou par un agent pharmacologique conduit à une mort cellulaire massive dans une lignée de cellules T humaines ayant un gène p53 de type sauvage. Nous démontrons que cette mort se produit aussi dans une autre lignée cellulaire dont le p53 est muté et qu’elle pourrait être évitée par des inhibiteurs d'autophagie ou de nécroptose. Nos observations mettent en évidence qu’un niveau d’expression basale de p53 est nécessaire à la survie cellulaire.