Die Durchseuchungsrate der Bevölkerung in Deutschland mit den humanen ß-Herpesviren liegt zwischen 40 und 90%. Nach der Primärinfektion verbleiben die ß-Herpesviren latent in den Körperzellen und haben die Fähigkeit, z.B. nach körperlichem Stress, bei Immunsuppression oder unter UV-Strahlung erneut in den lytischen Vermehrungszyklus einzutreten. Die kommerziell erhältlichen serologischen Methoden für die Diagnostik der humanen ß Herpesviren haben sich in den letzten Jahren wenig weiterentwickelt. Der enzymgekoppelte Immunadsorptionstest (ELISA) und der Immunfluoreszenztest (IFT) sind die Standardmethoden für die Diagnostik der humanen ß-Herpesviren. Da bei der Bestimmung des IgM-Titers Kreuzreaktionen sowie falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse auftreten können, reicht der IgM-Titer als alleinige Aussage für die Diagnose einer akuten Infektion nicht aus. Weiterhin fehlt bei einer Superinfektion mit einem anderen Stamm des gleichen Virus oder im Falle einer Reaktivierung des Virus oft die IgM-Antwort. In diesen Fällen kann nur auf Grund des IgG-Titeranstieges eine Reaktivierung bzw. Superinfektion angenommen werden. Bei fehlender Immunkompetenz bleibt der Anstieg des IgG-Titers jedoch oft aus. Serologische ELISA-IgG-Tests und IFT-IgG-Tests auf der Basis von Mischantigenen für den Nachweis von HCMV- oder HHV6-Reaktivierungen zeigen bei immunsupprimierten Patienten zurückliegende Infektionen bzw. Reaktivierungen an. Kommerzielle Western Blots für den Nachweis von IgG-Antikörpern gegen „late antigens“ der Zytomegalieviren sind verfügbar, werden aber nur in Speziallaboratorien eingesetzt. Weiterhin ist eine Differenzierung der Subtypen HHV6 A und HHV6 B mit den kommerziell erhältlichen Methoden wie ELISA und IFT nicht möglich. Eine Unterscheidung der Subtypen HHV6 A und HHV6 B wäre aber auf Grund der Unterschiede in der Infektionsfähigkeit, im Replikationsmuster, in der Epidemiologie und der Pathogenität wünschenswert. Im Rahmen des BMBF-Projektes Bioresponse (Projektträger Jülich: Förderkennzahl beim BMBF: 03WKR03E) und der nachfolgenden Stipendiatenförderung durch die Jürgen-Manchot-Stiftung wurden für eine differenzierte ß-Herpesvirusdiagnostik auf Basis des Mikroblots je zehn HCMV- und HHV6-Antigene exprimiert und evaluiert. Die Mikroblottechnologie - eine an Mikrowellplatten angepasste und miniaturisierte Form der Streifentesttechnologie - ermöglicht den simultanen Nachweis von bis zu zehn Antigen-spezifischen IgG Antikörpern bei geringem Proben- und Reagenzienverbrauch. Von in der Literatur als antigen beschriebenen Strukturproteinen und Nichtstrukturproteinen der Betaherpesviren wurden Proteinbereiche mit und ohne bekannten Epitopen ausgewählt und als Fusionsproteine in BL-21 Zellen exprimiert. Jeweils zehn über die Ni-NTA-Agarose-Säule aufgereinigte virusspezifische Fusionsantigene wurden zur Herstellung der Mikroblots eingesetzt. Der HCMV-IgG-Mikroblot und der HHV6-IgG-Mikroblot wiesen zu den kommerziell erhältlichen serologischen Testsystemen (HHV6 IgG-IFT von Euroimmun, Lübeck, HCMV-IgG-ELISA von Dade Behring, Marburg, HCMV IgG recom Blot von Mikrogen, Neuried) vergleichbare Sensitivitäten auf. Im Vergleich zum HHV6-IgG-ELISA (Panbio, Rüsselsheim) ist der HHV6 IgG-Mikroblot die empfindlichere Nachweismethode. Die Spezifität des HHV6 IgG-Mikroblots ist mit den HHV6-Testsystemen (HHV6-IgG-IFT von Euroimmun, Lübeck, HHV6-IgG-ELISA von Panbio, Rüsselsheim) vergleichbar. Weiterhin wies der HCMV-IgG-Mikroblot im Vergleich zum kommerziell erhältlichen HCMV-IgG-ELISA (Dade Behring, Marburg) und zum HCMV-IgG-recom Blot (Mikrogen, Neuried) eine Spezifität von 80% bzw. 83% auf. Der Mikroblot hat sich als ein geeignetes diagnostisches Instrument erwiesen, um neben der Entwicklung des IgG-Antikörpertiters auch differenziert die Antigen-spezifischen IgG Antikörperantworten unter bestimmten Fragestellungen zu untersuchen. So ermöglicht der HHV6 IgG-Mikroblot erstmals eine serologische Unterscheidung von HHV6 A und HHV6 B monovalenten Seren und den Nachweis von HHV6 A/ B polyvalenten Seren. Die Mikroblottechnologie wurde primär für die serologische Testung von Seren und Plasmen etabliert. Mit dem HCMV-IgG-Mikroblot wäre aber auch eine Liquordiagnostik möglich. Jedoch konnte mit dem HHV6-IgG-Mikroblot vermutlich auf Grund nicht ausreichender Sensitivität eine Einsatzmöglichkeit in der Liquordiagnostik anhand dieser Arbeit wegen zu geringer Probenzahlen nicht gezeigt werden. In einer anschließenden Studie sollte dennoch die Eignung der HHV6-Antigene für die HHV6-Liquordiagnostik mit einem größeren Umfang an Liquores geprüft werden. Stabilitätstestungen zeigten, dass die Messergebnisse von am gleichen Tag wiederholt gemessenen Seren oder Plasmen reproduzierbar waren. An verschiedenen Tagen gemessene Seren und Plasmen wiesen jedoch unterschiedliche Messergebnisse auf. Mögliche Ursachen für die geringe Reproduzierbarkeit der Messergebnisse im Mikroblot sind die unterschiedlichen Epitopdichten ein und desselben Antigens in den Mikroblots, die unspezifische Hintergrundfärbung in den Mikroblots sowie die nicht konstante bivalente Gleichgewichts- und Bindungskonstante der IgG-Antikörper im Mikroblot. In folgenden Studien sollte durch eine Optimierung des Proteintransfers der Antigene auf die Nitrozellulosemembran eine gleiche Epitopdichte gewährleistet werden. Gleichzeitig muss der Algorithmus der Software dahingehend verbessert werden, dass dieser trotz einer möglichen Verunreinigung der Mikroblots oder schwacher Hintergrundfärbung die Markerbande erkennt und eine Auswertung gewährleistet werden kann. Die unspezifische Hintergrundfärbung in den Mikroblots sollte nach Absprache mit dem Hersteller durch den Einsatz alternativer Blockreagenzien weitgehend reduziert werden. Weiterhin muss die Cutoff-Grenze so definiert werden, dass eine bestmögliche Sensitivität bei optimaler Spezifität der Mikroblotmethode ermöglicht wird. Dieser Cutoff kann sowohl durch die Anzahl der reaktiven Antigene als auch durch die Färbungsstärke der Antigen-Antikörperreaktion mit einem spezifischen Antigen definiert werden. In einem zweiten klinisch orientierten Teil dieser Arbeit wurden mit der Mikroblottechnologie die HCMV- und HHV6-Antikörperantworten nach hämatopoetischer Stammzell-transplantation (HSZT) untersucht. Die HCMV- und HHV6-Antikörperverläufe der Patienten nach HSZT wiesen keinen Zusammenhang zwischen nachgewiesener Reaktivierung und IgG-Antikörperentwicklung auf. Der Nachweis einer HCMV- bzw. HHV6-Reaktivierung bzw. -Infektion nur auf Grundlage des IgG-Antikörpertiters ist bei immunsupprimierten Patienten daher nicht möglich. Es konnte nicht nach jeder positiven HCMV- bzw. HHV6 PCR ein IgG-Antikörperanstieg beobachtet werden, was vermutlich durch die Immunsuppression der Patienten bedingt war. Weiterhin konnten HCMV- bzw. HHV6 IgG Antikörperanstiege selten zeitnah zu positiven HCMV- bzw. HHV6-PCR-Nachweisen gezeigt werden. Im Gegensatz dazu wurden bei weiteren Patienten mit HCMV- bzw. HHV6-positiven Transplantatspendern trotz negativer PCR frühe HCMV- bzw. HHV6-IgG-Antikörperanstiege bis zu 180 Tage nach der HSZT nachgewiesen. Diese frühen IgG-Antikörperanstiege sind wahrscheinlich durch die mit dem Stammzelltransplantat übertragenen B Gedächtniszellen sowie Plasmazellen verursacht und tragen zur frühen Immunrekonstitution des Patienten bei. Chemoradioresistente langlebige Plasmazellen können ebenfalls eine Ursache für frühe IgG Antikörperanstiege bis zu 180 Tage nach der HSZT bei HCMV-positiven Patienten mit negativen HCMV- bzw. HHV6-Transplantatspendern oder bei Patienten mit positiven HCMV bzw. HHV6-Transplantatspendern darstellen. Während die HCMV-IgG-Antikörperverläufe der Patienten nach der HSZT unabhängig von den positiven HCMV-PCR-Nachweisen durch mehrere HCMV-IgG-Antikörperanstiege und abfälle gekennzeichnet waren, wiesen die HHV6-IgG-Antikörperverläufe unabhängig von den positiven HHV6-PCR-Nachweisen nur einen HHV6-IgG-Antikörperanstieg auf, der von einem HHV6-Antikörperabfall gefolgt wurde. Da HHV6-Reaktivierungen mit 14-28 Tagen kurz nach der HSZT und im Gegensatz zu HCMV-Reaktivierungen nur in einem kurzen Zeitfenster nachgewiesen wurden, ist vermutlich nur für diesen begrenzten Zeitraum HHV6-Antigen als Trigger für die Antikörper produzierenden Plasmazellen verfügbar. Ob gesunde Probanden nach einer HHV6-Infektion oder HHV6-Reaktivierung eine ähnliche Antikörperkinetik wie HSZT-Patienten aufweisen, sollte in einer Folgestudie untersucht werden. Mit der Mikroblottechnologie konnte ein Einfluss des HCMV-Serostatus vom Transplantatspender auf die HCMV-IgG-Antikörperentwicklung nach HSZT gezeigt werden. Überwiegend nur HCMV-positive Patienten mit positiven HCMV-Transplantatspendern wiesen unabhängig von der HCMV-Reaktivierung frühe IgG-Antikörperanstiege bis zu 180 Tage nach der HSZT auf. Diese frühen IgG-Antikörperanstiege sind durch die mit dem Stammzelltransplantat übertragenen B-Gedächtniszellen oder Plasmazellen sowie seltener durch chemoradioresistente Plasmazellen verursacht und können zu einer frühen Immunrekonstitution beitragen. Im Gegensatz zu der kommerziell erhältlichen ELISA-Technik kann mit dem Mikroblot neben der Antikörperkinetik auch differenziert die Entwicklung der Antigen-spezifischen IgG-Antikörperreaktionen untersucht werden. So konnte bei sieben von 22 Patienten trotz Abfall des HCMV-Antikörpertiters bzw. stabilem HCMV-Antikörpertiter eine Zunahme von einzelnen HCMV Antigen spezifischen IgG Antikörpern nach hämatopoetischer Stammzell-transplantation beobachtet werden. Diese einzelen IgG-Antikörperanstiege könnten serologisch auf eine HCMV-Reaktivierung hinweisen. Weiterhin konnte bei drei von zehn Patienten mit HCMV-negativen Transplantatspendern unabhängig vom HCMV-IgG-Antikörpertiter ein Wechsel der HCMV Antigen-spezifischen IgG Antikörpermuster ab dem 6. Monat beobachtet werden. Der Wechsel der HCMV Antigen-spezifischen IgG-Antikörpermuster verweist auf die Bildung von neuen IgG-Antikörper sezernierenden B-Lymphozyten und vermutlich auf einen Wechsel der B Lymphozytenpopulation vom Empfänger zum Spender. Der Wechsel der B Lymphozytenpopulation vom Empfänger zum Spender ist für den Patienten ein wichtiger Schritt für die Rekonstitution der B Lymphozyten nach HSZT. Mit dem HHV6-IgG-Mikroblot hingegen konnte ein Wechsel der Antigen-spezifischen IgG-Antikörper nicht beobachtet werden. Eine Unterscheidung der HHV6-Subtypen auf serologischer Basis nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation wurde neu etabliert. Alle sieben mit dem HHV6-IgG-Mikroblot nachgewiesenen HHV6-IgG-Antikörperanstiege zeigten sowohl HHV6 A Antigen-spezifische, als auch HHV6 B Antigen-spezifische IgG-Antikörperreaktionen. Jedoch zeigten vier von sieben Antikörperverläufen überwiegend HHV6 B Antigen-spezifische IgG-Antikörperreaktionen. Weiterhin konnten HHV6 B Antigen-spezifische IgG Antikörper früher als HHV6 A Antigen-spezifische IgG-Antikörper nachgewiesen werden. Auf Grund dieser Beobachtungen ist zu vermuten, dass der HHV6 B-Subtyp zu einem früheren Zeitpunkt und häufiger nach der HSZT als der HHV6 A-Subtyp reaktiviert.

Glycosphingolipide sind eine Gruppe von amphiphatischen Membran- und Strukturlipiden, welche aus einem Molekül des Aminoalkohols Sphingosin oder einem seiner Derivate, einer langkettigen Fettsäure und einem Kohlenhydratrest als polare Kopfgruppe zusammengesetzt sind. Eine Subgruppe dieser Substanzen stellen die Ganglioside dar, welche durch das Vorkommen von Sialinsäure als Bestandteil ihrer Glykankette charakterisiert sind. Das Gangliosid GD3 ist als tumorassoziiertes Antigen auf der Oberfläche neuroektodermaler Tumore sowie als proapoptotisch wirkender Lipidmediator beschrieben. Seine biologischen Funktionen und der genaue Wirkmechanismus im Rahmen der Apoptose sind bisher aber unbekannt. Es gibt jedoch Hinweise, dass nicht GD3 selbst, sondern sein oxidiertes Derivat das eigentliche Effektormolekül darstellt. Eine minimale Veränderung des GD3-Moleküls, die 9-O-Acetylierung der Seitenkette der terminalen Sialinsäure, hebt die proapoptotische Wirkung des Gangliosids auf. Tumorzellen, in denen das Enzym 9-O-Acetyltransferase aktiv ist, können der Apoptose auf diese Weise entgehen. Das Anliegen dieser Arbeit war es, Vorkommen und Funktion des bis dahin nur artifiziell generierten oxidierten GD3-Derivates zu untersuchen. Es war zu analysieren, welche Auswirkungen oxidiertes GD3 auf das Überleben von GD3-resistenten Tumorzellen hat. Es sollte geprüft werden, ob GD3-7-Aldehyd in Primärzellen und Geweben auftritt. Dabei war zu klären, ob das Molekül unter Bedingungen des oxidativen Stresses entstehen und auf der Zelloberfläche oder intrazellulär induziert werden kann. Daraus folgernd sollte betrachtet werden, welche neuen immunologischen Therapieansätze zur Behandlung resistenter Tumore unter Nutzung von GD3-7-Aldehyd möglich wären. Voraussetzungen für die Experimente dieser Arbeit und für nachfolgende Forschungsfragen sind zuverlässige Nachweismöglichkeiten der Metabolite GD3, 9 O-acetyl-GD3 und GD3-7-Aldehyd. Während für den Nachweis von GD3 und 9 O acetyl-GD3 bereits monoklonale Antikörper zur Verfügung standen, war für die Detektion von GD3-7-Aldehyd im Rahmen dieser Arbeit erstmals ein monoklonaler Antikörper gegen ein oxidiertes Gangliosid zu generieren und zu charakterisieren. Für die Selektion antikörperproduzierender Zellen musste dafür zunächst eine neue Screeningmethode etabliert werden. Für die Überprüfung des Bindungsverhaltens der gangliosidspezifischen Antikörper und für die Durchführung der Inkubationsversuche waren die Ganglioside GD3 und 9-O-acetyl-GD3 über mehrere Chromatographieschritte aus lyophilisierter Buttermilch zu isolieren und das oxidierte Derivat herzustellen. Dabei wurde erstmals die Reinigung von GD3-7-Aldehyd mit der HPLC durchgeführt. Der im Rahmen dieser Arbeit generierte monoklonale Antikörper 10C6 gehört der Immunglobulin-Subklasse IgG2a an und bindet an die oxidierte Form des Gangliosids GD3. Das von 10C6 erkannte Antigen ist eine Glycankette der Struktur Neu5Ac-8Neu5Ac-3Gal mit oxidierter terminaler Sialinsäure. Der Antikörper reagiert nicht mit reduzierten oder 9-O-acetylierten Gangliosidvarianten und weist eine höhere Sensitivität auf als die etablierten Antikörper zum Nachweis der beiden anderen GD3-Derivate. In der Arbeit wurde in vitro gezeigt, dass die oxidative Modifikation von GD3 zu GD3 7-Aldehyd unter Bedingungen des oxidativen Stresses entstehen kann. In der GD3-resistenten Zelllinie Molt-4 induziert die Substanz Apoptose. GD3-7-Aldehyd kommt daher als proapoptotisches Effektormolekül in Frage. Das von 10C6 erkannte Antigen kommt auf der Oberfläche von Monozyten einzelner Spender vor. Außerdem kann es auf der Oberfläche eines Teils der Blasten bei akuter myeloischer Leukämie gefunden werden. Andere Leukozyten des peripheren Blutes tragen diese Struktur nicht. GD3-7-Aldehyd kommt in den Tumorzelllinien HEp-2, HL60 und T47D vor. In Gewebeschnitten von humanem Mammakarzinom sowie fötaler Milz und fötalem Darm von Primaten fanden sich Hinweise auf Strukturen mit oxidativ modifizierter Sialinsäure, in Geweben adulter Primaten wurden diese nicht gefunden. Auf der Oberfläche von Melanomzelllinien wie Ma-Mel-11, Ma-Mel-95 und SK-Mel-23 vorkommendes GD3 kann durch Natriumperjodatbehandlung zu GD3-7-Aldehyd oxidiert werden. Durch UV-Bestrahlung kann auf der Oberfläche von HEp-2- und SK-Mel-23-Zellen eine mit dem Antikörper 10C6 detektierbare Struktur induziert werden. HL60-Zellen lassen sich durch extern zugeführten GD3-7-Aldehyd dekorieren, es bleibt auf ihrer Oberfläche bis zu 48 Stunden nachweisbar. Für einen immunologischen Tumortherapieansatz könnten sowohl das geringe Vorkommen des Antigens in gesunden Geweben als auch die Induzierbarkeit auf der Oberfläche bestimmter Tumorzellen nach lokaler Vorbehandlung sowie die Toxizität der Substanz von Nutzen sein. Ein passender spezifischer Antikörper liegt nun vor. Die im Rahmen dieser Arbeit etablierten Detektionssysteme können für weitere Untersuchungen auf dem Gebiet der Glycolipidforschung eingesetzt werden. / Glycosphingolipids are a group of amphiphatic membrane and structure lipids consisting of one molecule of the aminoalcohol Sphingosin or one of its derivatives, a long chain fatty acid, and a carbohydrate moiety as polar side chain. One subgroup of these substances are gangliosides, which are characterized by sialic acid as a component of their glycan chain. The ganglioside GD3 is described as tumor associated antigen on the surface of neuroectodermal tumors and as proapoptotic lipid mediator. Its biological functions as well as its mode of operation in the context of apoptosis still remain unclear. There are hints, that not GD3 itself, but an oxidized derivative represents the actual effector molecule. A minimal change in the GD3 molecule, the 9-O-acetylation of the side chain of the terminal sialic acid, abolishes the proapoptotic effect completely. Tumor cells with activity of the enzyme 9-O-acetyltransferase can escape from apoptosis like that. The request of this work was to investigate the occurrence and function of this so far solely artificially generated oxidized GD3 derivative. The impact of oxidized GD3 on the survival of GD3-resistant tumor cells had to be analyzed. It had to be examined, whether GD3-7-aldehyde occurs in primary cells and tissues. Withal it was to clarify, if the molecule occurs under conditions of oxidative stress and if it can be induced on the surface of cells or intracellularly. Following that, it was to contemplate which novel approaches of immunological therapies for the treatment of resistant tumors could be possible under the use of GD3-7-aldehyde. Prerequisite to all experiments of this work and for following research are reliable detection methods of the metabolites GD3, and GD3-7-aldehyde. Whereas for the detection of GD3 and 9-O-acetyl-GD3 monoclonal antibodies were already existing, for the detection of GD3-7-aldehyde a novel monoclonal antibody directed against an oxidized ganglioside had to be generated for the first time and had to be characterized. For the selection of antibody producing cells, a new screening method had to be established. For the examination of the binding behavior of the ganglioside specific antibodies and for the performance of the incubation assays the gangliosides GD3 and 9-O-acetyl-GD3 had to be isolated from lyophilized bovine buttermilk via several chromatography steps and the oxidized derivative had to be produced. In doing so, GD3-7-al was purified by HPLC for the first time. The monoclonal antibody 10C6 generated in the framework of this study is member of immunoglobulin subclass IgG2a and binds to the oxidized form of the ganglioside GD3. The antigen detected by 10C6 is a glycan chain with structure Neu5Ac-8Neu5Ac-3Gal with oxidized terminal sialic acid. The antibody does not react with reduced or 9-O-acetylated forms of the ganglioside GD3 and possesses a higher sensitivity than the antibodies, established for the detection of both other GD3 derivatives. In this work it is shown in vitro, that the oxidative modification of GD3 to GD3-7-aldehyde can arise under conditions of oxidative stress. In GD3-resistant Molt-4-cells this substance induces apoptosis. Therefore GD3-7-aldehyde comes into consideration to be a proapoptotic effector molecule. The antigen detected by 10C6 occurs on the surface of monocytes of particular donors. Further, it can be found on the surface of a portion of the blasts of acute myeloic leukemia. Other leucocytes of the peripheral blood do not show this structure. GD3-7-aldehyde occurs in tumor cell lines HEp-2, HL60, and T47D. Hints for the existence of structures with oxidatively modified sialic acid were found in tissue slides of human mamma carcinoma and fetal gut. In tissues of adult primates this was not the case. On the surface of melanoma cell lines like Ma-Mel-11, Ma-Mel-95, and SK-Mel-23, existing GD3 can be converted into GD3-7-aldehyde by sodium periodate treatment. UV radiation can induce a structure detectable by 10C6 on the surface of HEp-2- and SK-Mel-23-cells. HL60-cells can be decorated by externally administered GD3-7-aldehyde. It is detectable on their surface for up to 48 hours. For an immunological approach of tumor therapy, the sparsely incidence of this antigen in healthy tissues as well as the inducibility on the surface of distinct tumor cells after pretreatment and the toxicity of this substance could be advantageous. A fitting antibody is now available. The detection methods established in the context of this work can be applied for further investigations in glycolipid research.