Les gangliosides représentent une classe de glycosphingolipides porteurs d’un ou plusieurs résidus d’acide sialique. Alors que les tissus sains adultes expriment principalement des gangliosides de la série-a, l’expression des gangliosides complexes des séries b- et c- est limitée au système nerveux central. Une augmentation d’expression de ces gangliosides complexes est cependant observée sous certaines conditions physiopathologiques, notamment dans les cancers d’origine neuro-ectodermique. Ainsi, le GD3 et le GD2 sont des marqueurs oncofœtaux du mélanome et du neuroblastome où ils favorisent la prolifération, la migration et la différenciation cellulaires, ainsi que l’angiogenèse. L’objectif de ma thèse a été de déterminer l’influence des gangliosides complexes dans la progression et l’agressivité du cancer du sein. A cet effet, nous avons établi un modèle dérivant des cellules de cancer du sein MDA-MB-231 qui expriment la GD3 synthétase. Ces cellules expriment des gangliosides des séries b- et c- à leur surface, principalement le GD2, et se caractérisent par une augmentation de la migration et des capacités de prolifération en absence de facteurs de croissance. Ce phénotype prolifératif a été confirmé in vivo par des expériences de xénogreffes chez des souris immunodéficientes. Nous avons pu démontrer que l’expression de la GD3 synthétase renforce l’agressivité des cellules MDA-MB-231 par un mécanisme d’activation spécifique du récepteur c-Met et des voies de signalisation cellulaire MEK/ERK et PI3K/Akt. Les derniers résultats indiquent que le disialoganglioside GD2 joue un rôle essentiel dans la spécificité d’activation du récepteur c-Met dans les cellules MDA-MB-231. / Gangliosides define a class of glycosphingolipids with one or more sialic acid residues. Whereas normal human tissues mainly express a-series gangliosides deriving from GM3, the expression of complex gangliosides from b- and c-series is limited to the central nervous system and developing tissues during embryogenesis. However, an increase of complex gangliosides expression is observed in several pathological conditions including neuro-ectoderm-derived cancers. Thus, GD3 and GD2 are oncofetal markers of melanoma and neuroblastoma where they promote tumor progression by mediating cell proliferation, migration, adhesion and angiogenesis. The goal of my thesis was to determine the effect of complex gangliosides on breast cancer progression and aggressiveness. For that propose, we have established a cellular model deriving from MDA-MB-231 breast cancer cells expressing the GD3 synthase. The GD3 synthase expression induces the accumulation of b- and c-series gangliosides (mainly GD2) at the cell surface together with an increased migration and the acquisition of a proliferative phenotype in absence of growth factors. GD3 synthase expression also induces an increased tumor growth of MDA-MB-231 cells in severe combined immunodeficiency mice. We have clearly demonstrated that GD3 synthase expression induces the specific and constitutive activation of c-Met receptor and subsequent activation of MEK/ERK and PI3K/Akt transduction pathways. Altogether, these results clearly demonstrate the involvement of the disialoganglioside GD2 in MDA-MB-231 cell proliferation via the constitutive activation of c-Met.

La GD3 synthétase (GD3S) est une enzyme capable de synthétiser le ganglioside GD3, contrôlant ainsi la biosynthèse des gangliosides des séries b et c. Ces gangliosides sont principalement exprimés au cours de l’embryogenèse, dans le cerveau adulte, ainsi que dans certaines tumeurs. En particulier, le GD3 et le GD2 sont des marqueurs du mélanome et du neuroblastome, où ils jouent un rôle clef dans la progression tumorale. Une surexpression du gène codant la GD3S a également été observée dans les tumeurs de sein négatives pour le récepteur aux œstrogènes (ER-). Afin de déterminer le rôle de la GD3S dans la progression du cancer du sein, un modèle de cellules de cancer du sein MDA-MB-231 surexprimant la GD3S a été créé au laboratoire. Ces cellules se caractérisent par une prolifération et une migration accrues, dues à l’activation du récepteur c-Met. Dans le cadre de ma thèse, nous avons d’abord montré que le ganglioside GD2 induisait spécifiquement l’activation de c-Met et la prolifération des cellules GD3S+. Ensuite, nous avons étudié les mécanismes moléculaires responsables de la surexpression de ST8SIA1 dans les tumeurs ER-. Nous avons caractérisé le promoteur core essentiel à la transcription de ST8SIA1 dans les cellules de cancer du sein et nous avons montré que l’œstradiol réprime à la fois l’expression des ARNm de la GD3S et le promoteur core uniquement dans les cellules de cancer du sein exprimant le récepteur ERα. Ces résultats suggèrent que la forte expression de ST8SIA1 dans les tumeurs de sein ER-, suite à la perte de signalisation par ERα, pourrait augmenter l’expression des gangliosides tels que le GD2, et ainsi contribuer à l’agressivité de ce sous-type de tumeur. / The GD3 synthase (GD3S) is an enzyme that synthesizes the ganglioside GD3 from GM3. It is therefore the key enzyme for the biosynthesis of b- and c-series gangliosides. Essentially expressed during embryogenesis and in the adult brain, the expression of these gangliosides increases in several diseases including neuro-ectoderm derived cancer. In particular, GD3 and GD2 are oncofetal markers in melanoma and neuroblastoma, where they play a key role in tumor progression. Clinical studies have also showed a high expression of GD3S in Estrogen Receptor negative (ER-) breast tumors. In order to determine the role of GD3S in breast cancer progression, we have previously induced GD3S over-expression in MDA-MB-231 breast cancer cell line. The resulting GD3S+ cells displayed an increased migration and proliferative phenotype that directly proceed from the constitutive activation of c-Met receptor. During my thesis, we first demonstrated that GD2 is directly involved in the constitutive activation of c-Met in absence of the ligand HGF/SF. Secondly, we have undertaken the study of the molecular mechanisms responsible for ST8SIA1 over-expression in ER- tumors. We characterized the core promoter, essential for ST8SIA1 transcription in breast cancer cells and we showed that estradiol represses both GD3S mRNA expression and the core promoter only in ERα expressing breast cancer cells. Altogether, these results suggest that high expression of GD3S in ER negative tumours, due to the loss of ERα signalling, could increase complex gangliosides such as GD2 at the cell surface, and possibly enhance the aggressiveness of this tumour subtype.

Glycosphingolipide sind eine Gruppe von amphiphatischen Membran- und Strukturlipiden, welche aus einem Molekül des Aminoalkohols Sphingosin oder einem seiner Derivate, einer langkettigen Fettsäure und einem Kohlenhydratrest als polare Kopfgruppe zusammengesetzt sind. Eine Subgruppe dieser Substanzen stellen die Ganglioside dar, welche durch das Vorkommen von Sialinsäure als Bestandteil ihrer Glykankette charakterisiert sind. Das Gangliosid GD3 ist als tumorassoziiertes Antigen auf der Oberfläche neuroektodermaler Tumore sowie als proapoptotisch wirkender Lipidmediator beschrieben. Seine biologischen Funktionen und der genaue Wirkmechanismus im Rahmen der Apoptose sind bisher aber unbekannt. Es gibt jedoch Hinweise, dass nicht GD3 selbst, sondern sein oxidiertes Derivat das eigentliche Effektormolekül darstellt. Eine minimale Veränderung des GD3-Moleküls, die 9-O-Acetylierung der Seitenkette der terminalen Sialinsäure, hebt die proapoptotische Wirkung des Gangliosids auf. Tumorzellen, in denen das Enzym 9-O-Acetyltransferase aktiv ist, können der Apoptose auf diese Weise entgehen. Das Anliegen dieser Arbeit war es, Vorkommen und Funktion des bis dahin nur artifiziell generierten oxidierten GD3-Derivates zu untersuchen. Es war zu analysieren, welche Auswirkungen oxidiertes GD3 auf das Überleben von GD3-resistenten Tumorzellen hat. Es sollte geprüft werden, ob GD3-7-Aldehyd in Primärzellen und Geweben auftritt. Dabei war zu klären, ob das Molekül unter Bedingungen des oxidativen Stresses entstehen und auf der Zelloberfläche oder intrazellulär induziert werden kann. Daraus folgernd sollte betrachtet werden, welche neuen immunologischen Therapieansätze zur Behandlung resistenter Tumore unter Nutzung von GD3-7-Aldehyd möglich wären. Voraussetzungen für die Experimente dieser Arbeit und für nachfolgende Forschungsfragen sind zuverlässige Nachweismöglichkeiten der Metabolite GD3, 9 O-acetyl-GD3 und GD3-7-Aldehyd. Während für den Nachweis von GD3 und 9 O acetyl-GD3 bereits monoklonale Antikörper zur Verfügung standen, war für die Detektion von GD3-7-Aldehyd im Rahmen dieser Arbeit erstmals ein monoklonaler Antikörper gegen ein oxidiertes Gangliosid zu generieren und zu charakterisieren. Für die Selektion antikörperproduzierender Zellen musste dafür zunächst eine neue Screeningmethode etabliert werden. Für die Überprüfung des Bindungsverhaltens der gangliosidspezifischen Antikörper und für die Durchführung der Inkubationsversuche waren die Ganglioside GD3 und 9-O-acetyl-GD3 über mehrere Chromatographieschritte aus lyophilisierter Buttermilch zu isolieren und das oxidierte Derivat herzustellen. Dabei wurde erstmals die Reinigung von GD3-7-Aldehyd mit der HPLC durchgeführt. Der im Rahmen dieser Arbeit generierte monoklonale Antikörper 10C6 gehört der Immunglobulin-Subklasse IgG2a an und bindet an die oxidierte Form des Gangliosids GD3. Das von 10C6 erkannte Antigen ist eine Glycankette der Struktur Neu5Ac-8Neu5Ac-3Gal mit oxidierter terminaler Sialinsäure. Der Antikörper reagiert nicht mit reduzierten oder 9-O-acetylierten Gangliosidvarianten und weist eine höhere Sensitivität auf als die etablierten Antikörper zum Nachweis der beiden anderen GD3-Derivate. In der Arbeit wurde in vitro gezeigt, dass die oxidative Modifikation von GD3 zu GD3 7-Aldehyd unter Bedingungen des oxidativen Stresses entstehen kann. In der GD3-resistenten Zelllinie Molt-4 induziert die Substanz Apoptose. GD3-7-Aldehyd kommt daher als proapoptotisches Effektormolekül in Frage. Das von 10C6 erkannte Antigen kommt auf der Oberfläche von Monozyten einzelner Spender vor. Außerdem kann es auf der Oberfläche eines Teils der Blasten bei akuter myeloischer Leukämie gefunden werden. Andere Leukozyten des peripheren Blutes tragen diese Struktur nicht. GD3-7-Aldehyd kommt in den Tumorzelllinien HEp-2, HL60 und T47D vor. In Gewebeschnitten von humanem Mammakarzinom sowie fötaler Milz und fötalem Darm von Primaten fanden sich Hinweise auf Strukturen mit oxidativ modifizierter Sialinsäure, in Geweben adulter Primaten wurden diese nicht gefunden. Auf der Oberfläche von Melanomzelllinien wie Ma-Mel-11, Ma-Mel-95 und SK-Mel-23 vorkommendes GD3 kann durch Natriumperjodatbehandlung zu GD3-7-Aldehyd oxidiert werden. Durch UV-Bestrahlung kann auf der Oberfläche von HEp-2- und SK-Mel-23-Zellen eine mit dem Antikörper 10C6 detektierbare Struktur induziert werden. HL60-Zellen lassen sich durch extern zugeführten GD3-7-Aldehyd dekorieren, es bleibt auf ihrer Oberfläche bis zu 48 Stunden nachweisbar. Für einen immunologischen Tumortherapieansatz könnten sowohl das geringe Vorkommen des Antigens in gesunden Geweben als auch die Induzierbarkeit auf der Oberfläche bestimmter Tumorzellen nach lokaler Vorbehandlung sowie die Toxizität der Substanz von Nutzen sein. Ein passender spezifischer Antikörper liegt nun vor. Die im Rahmen dieser Arbeit etablierten Detektionssysteme können für weitere Untersuchungen auf dem Gebiet der Glycolipidforschung eingesetzt werden. / Glycosphingolipids are a group of amphiphatic membrane and structure lipids consisting of one molecule of the aminoalcohol Sphingosin or one of its derivatives, a long chain fatty acid, and a carbohydrate moiety as polar side chain. One subgroup of these substances are gangliosides, which are characterized by sialic acid as a component of their glycan chain. The ganglioside GD3 is described as tumor associated antigen on the surface of neuroectodermal tumors and as proapoptotic lipid mediator. Its biological functions as well as its mode of operation in the context of apoptosis still remain unclear. There are hints, that not GD3 itself, but an oxidized derivative represents the actual effector molecule. A minimal change in the GD3 molecule, the 9-O-acetylation of the side chain of the terminal sialic acid, abolishes the proapoptotic effect completely. Tumor cells with activity of the enzyme 9-O-acetyltransferase can escape from apoptosis like that. The request of this work was to investigate the occurrence and function of this so far solely artificially generated oxidized GD3 derivative. The impact of oxidized GD3 on the survival of GD3-resistant tumor cells had to be analyzed. It had to be examined, whether GD3-7-aldehyde occurs in primary cells and tissues. Withal it was to clarify, if the molecule occurs under conditions of oxidative stress and if it can be induced on the surface of cells or intracellularly. Following that, it was to contemplate which novel approaches of immunological therapies for the treatment of resistant tumors could be possible under the use of GD3-7-aldehyde. Prerequisite to all experiments of this work and for following research are reliable detection methods of the metabolites GD3, and GD3-7-aldehyde. Whereas for the detection of GD3 and 9-O-acetyl-GD3 monoclonal antibodies were already existing, for the detection of GD3-7-aldehyde a novel monoclonal antibody directed against an oxidized ganglioside had to be generated for the first time and had to be characterized. For the selection of antibody producing cells, a new screening method had to be established. For the examination of the binding behavior of the ganglioside specific antibodies and for the performance of the incubation assays the gangliosides GD3 and 9-O-acetyl-GD3 had to be isolated from lyophilized bovine buttermilk via several chromatography steps and the oxidized derivative had to be produced. In doing so, GD3-7-al was purified by HPLC for the first time. The monoclonal antibody 10C6 generated in the framework of this study is member of immunoglobulin subclass IgG2a and binds to the oxidized form of the ganglioside GD3. The antigen detected by 10C6 is a glycan chain with structure Neu5Ac-8Neu5Ac-3Gal with oxidized terminal sialic acid. The antibody does not react with reduced or 9-O-acetylated forms of the ganglioside GD3 and possesses a higher sensitivity than the antibodies, established for the detection of both other GD3 derivatives. In this work it is shown in vitro, that the oxidative modification of GD3 to GD3-7-aldehyde can arise under conditions of oxidative stress. In GD3-resistant Molt-4-cells this substance induces apoptosis. Therefore GD3-7-aldehyde comes into consideration to be a proapoptotic effector molecule. The antigen detected by 10C6 occurs on the surface of monocytes of particular donors. Further, it can be found on the surface of a portion of the blasts of acute myeloic leukemia. Other leucocytes of the peripheral blood do not show this structure. GD3-7-aldehyde occurs in tumor cell lines HEp-2, HL60, and T47D. Hints for the existence of structures with oxidatively modified sialic acid were found in tissue slides of human mamma carcinoma and fetal gut. In tissues of adult primates this was not the case. On the surface of melanoma cell lines like Ma-Mel-11, Ma-Mel-95, and SK-Mel-23, existing GD3 can be converted into GD3-7-aldehyde by sodium periodate treatment. UV radiation can induce a structure detectable by 10C6 on the surface of HEp-2- and SK-Mel-23-cells. HL60-cells can be decorated by externally administered GD3-7-aldehyde. It is detectable on their surface for up to 48 hours. For an immunological approach of tumor therapy, the sparsely incidence of this antigen in healthy tissues as well as the inducibility on the surface of distinct tumor cells after pretreatment and the toxicity of this substance could be advantageous. A fitting antibody is now available. The detection methods established in the context of this work can be applied for further investigations in glycolipid research.

Le rôle des gangliosides complexes di- ou trisialylés (GD3, GD2, GT3) dans le développement des cancers d’origine neuro-ectodermique (mélanome, neuroblastome) a été clairement démontré. Ces gangliosides sont également surexprimés dans 50% des carcinomes mammaires canalaires infiltrants et l’expression de la GD3 synthétase (GD3S) contrôlant leur biosynthèse, est augmentée dans les tumeurs de sein ER-négatives, avec une diminution de la survie des patientes. Notre laboratoire a montré que l’expression de la GD3S dans les cellules cancéreuses de sein MDA-MB-231 induit une augmentation de la migration et de la prolifération en conditions de sevrage, liée à une activation constitutive du récepteur c-Met et des voies de signalisation intracellulaires Erk/MAPK et PI3K/Akt par le GD2. Nous avons développé un autre modèle cellulaire dérivant des cellules cancéreuses mammaires MCF-7 sur-exprimant la GD3S. Ces cellules accumulent principalement les gangliosides GD1b et GT3. Nous avons pu montrer une augmentation de la migration mais aucun effet sur la prolifération n’a été observé. L’analyse en spectrométrie de masse des glycosphingolipides a montré que les MCF-7 expriment des quantités élevées de globosides et de faibles quantités de gangliosides par rapport aux cellules MDA-MB-231. Dans les cellules MCF7 GD3S+, nous avons démontré que la GD3S était capable de synthétiser du GT3 à partir du GD3, mais également des gangliosides inhabituels tétra- et penta-sialylés. Nos résultats montrent que les cellules cancéreuses mammaires présentent des profils gangliosidiques différents et que la modification du phénotype cellulaire induite par l'expression de la GD3S dépend du type cellulaire. / The role of di- and trisialylated complex gangliosides (GD3, GD2 and GT3) in the development of neuro-ectoderm derived cancers (melanoma, neuroblastoma) has been clearly demonstrated. Complex gangliosides are also over-expressed in 50% of breast invasive ductal carcinomas and the expression of the GD3 synthase (GD3S) that controls their biosynthesis, is increased in ER-negatives breast cancer tumors, associated with a decreased overall survival of the patients. Our lab has previously demonstrated that GD3S expression in MDA-MB-231 breast cancer cells induced an increase of the cell migration and proliferation in serum-free conditions, associated to a constitutive GD2-dependent constitutive activation of c-Met receptor and Erk/MAPK et PI3K/Akt signaling pathways. We have developed another cellular model deriving from MCF-7 breast cancer cells, over-expressing the GD3S. These cells mainly express GD1b and GT3 gangliosides. We have shown the increased migration of MCF7 GD3S+, but no effect on the proliferation was observed. Mass spectrometry analysis of total glycosphingolipids has shown that MCF-7 cells express a high level of globosides and a low level of gangliosides compared to MDA-MB-231 cells. In MCF7 GD3S+ cells, we demonstrated that the GD3S was able to synthesize GT3 from GD3, but also other unusual tetra- and penta-sialylated gangliosides. Our results show that breast cancer cell lines express different gangliosidic profiles and that the modification of the cellular phenotype resulting from the expression of the GD3S is depending on the cell type.

Glycosphingolipide sind eine Gruppe von amphiphatischen Membran- und Strukturlipiden, welche aus einem Molekül des Aminoalkohols Sphingosin oder einem seiner Derivate, einer langkettigen Fettsäure und einem Kohlenhydratrest als polare Kopfgruppe zusammengesetzt sind. Eine Subgruppe dieser Substanzen stellen die Ganglioside dar, welche durch das Vorkommen von Sialinsäure als Bestandteil ihrer Glykankette charakterisiert sind. Das Gangliosid GD3 ist als tumorassoziiertes Antigen auf der Oberfläche neuroektodermaler Tumore sowie als proapoptotisch wirkender Lipidmediator beschrieben. Seine biologischen Funktionen und der genaue Wirkmechanismus im Rahmen der Apoptose sind bisher aber unbekannt. Es gibt jedoch Hinweise, dass nicht GD3 selbst, sondern sein oxidiertes Derivat das eigentliche Effektormolekül darstellt. Eine minimale Veränderung des GD3-Moleküls, die 9-O-Acetylierung der Seitenkette der terminalen Sialinsäure, hebt die proapoptotische Wirkung des Gangliosids auf. Tumorzellen, in denen das Enzym 9-O-Acetyltransferase aktiv ist, können der Apoptose auf diese Weise entgehen. Das Anliegen dieser Arbeit war es, Vorkommen und Funktion des bis dahin nur artifiziell generierten oxidierten GD3-Derivates zu untersuchen. Es war zu analysieren, welche Auswirkungen oxidiertes GD3 auf das Überleben von GD3-resistenten Tumorzellen hat. Es sollte geprüft werden, ob GD3-7-Aldehyd in Primärzellen und Geweben auftritt. Dabei war zu klären, ob das Molekül unter Bedingungen des oxidativen Stresses entstehen und auf der Zelloberfläche oder intrazellulär induziert werden kann. Daraus folgernd sollte betrachtet werden, welche neuen immunologischen Therapieansätze zur Behandlung resistenter Tumore unter Nutzung von GD3-7-Aldehyd möglich wären. Voraussetzungen für die Experimente dieser Arbeit und für nachfolgende Forschungsfragen sind zuverlässige Nachweismöglichkeiten der Metabolite GD3, 9 O-acetyl-GD3 und GD3-7-Aldehyd. Während für den Nachweis von GD3 und 9 O acetyl-GD3 bereits monoklonale Antikörper zur Verfügung standen, war für die Detektion von GD3-7-Aldehyd im Rahmen dieser Arbeit erstmals ein monoklonaler Antikörper gegen ein oxidiertes Gangliosid zu generieren und zu charakterisieren. Für die Selektion antikörperproduzierender Zellen musste dafür zunächst eine neue Screeningmethode etabliert werden. Für die Überprüfung des Bindungsverhaltens der gangliosidspezifischen Antikörper und für die Durchführung der Inkubationsversuche waren die Ganglioside GD3 und 9-O-acetyl-GD3 über mehrere Chromatographieschritte aus lyophilisierter Buttermilch zu isolieren und das oxidierte Derivat herzustellen. Dabei wurde erstmals die Reinigung von GD3-7-Aldehyd mit der HPLC durchgeführt. Der im Rahmen dieser Arbeit generierte monoklonale Antikörper 10C6 gehört der Immunglobulin-Subklasse IgG2a an und bindet an die oxidierte Form des Gangliosids GD3. Das von 10C6 erkannte Antigen ist eine Glycankette der Struktur Neu5Ac-8Neu5Ac-3Gal mit oxidierter terminaler Sialinsäure. Der Antikörper reagiert nicht mit reduzierten oder 9-O-acetylierten Gangliosidvarianten und weist eine höhere Sensitivität auf als die etablierten Antikörper zum Nachweis der beiden anderen GD3-Derivate. In der Arbeit wurde in vitro gezeigt, dass die oxidative Modifikation von GD3 zu GD3 7-Aldehyd unter Bedingungen des oxidativen Stresses entstehen kann. In der GD3-resistenten Zelllinie Molt-4 induziert die Substanz Apoptose. GD3-7-Aldehyd kommt daher als proapoptotisches Effektormolekül in Frage. Das von 10C6 erkannte Antigen kommt auf der Oberfläche von Monozyten einzelner Spender vor. Außerdem kann es auf der Oberfläche eines Teils der Blasten bei akuter myeloischer Leukämie gefunden werden. Andere Leukozyten des peripheren Blutes tragen diese Struktur nicht. GD3-7-Aldehyd kommt in den Tumorzelllinien HEp-2, HL60 und T47D vor. In Gewebeschnitten von humanem Mammakarzinom sowie fötaler Milz und fötalem Darm von Primaten fanden sich Hinweise auf Strukturen mit oxidativ modifizierter Sialinsäure, in Geweben adulter Primaten wurden diese nicht gefunden. Auf der Oberfläche von Melanomzelllinien wie Ma-Mel-11, Ma-Mel-95 und SK-Mel-23 vorkommendes GD3 kann durch Natriumperjodatbehandlung zu GD3-7-Aldehyd oxidiert werden. Durch UV-Bestrahlung kann auf der Oberfläche von HEp-2- und SK-Mel-23-Zellen eine mit dem Antikörper 10C6 detektierbare Struktur induziert werden. HL60-Zellen lassen sich durch extern zugeführten GD3-7-Aldehyd dekorieren, es bleibt auf ihrer Oberfläche bis zu 48 Stunden nachweisbar. Für einen immunologischen Tumortherapieansatz könnten sowohl das geringe Vorkommen des Antigens in gesunden Geweben als auch die Induzierbarkeit auf der Oberfläche bestimmter Tumorzellen nach lokaler Vorbehandlung sowie die Toxizität der Substanz von Nutzen sein. Ein passender spezifischer Antikörper liegt nun vor. Die im Rahmen dieser Arbeit etablierten Detektionssysteme können für weitere Untersuchungen auf dem Gebiet der Glycolipidforschung eingesetzt werden.:1 EINLEITUNG 1 1.1 Sphingolipide, Glycosphingolipide und Ganglioside 1 1.1.1 Biosynthese und Transport der Ganglioside 5 1.1.2 Biologische Funktionen und pathophysiologische Bedeutung der Ganglioside 10 1.2 Sialinsäuren 12 1.3 Das Disialogangliosid GD3 16 1.3.1 Vorkommen von GD3 16 1.3.2 Biologische Wirkungen von GD3 17 1.3.3 GD3 als Zielstruktur in der Tumortherapie 20 1.3.4 Modifikationen der Sialinsäure von GD3 23 1.3.4.1 9-O-Acetylierung der terminalen Sialinsäure von GD3 23 1.3.4.2 Oxidation der terminalen Sialinsäure von GD3 25 1.4 Zielstellung 27 2 MATERIAL UND METHODEN 28 2.1 Materialien 28 2.1.1 Biologische Materialien 28 2.1.1.1 Patientenproben 28 2.1.1.2 Versuchstiere 28 2.1.1.3 Zelllinien und Hybridome 28 2.1.2 Reagenzien, Antikörper und Enzyme 29 2.1.3 Chemikalien 31 2.1.4 Geräte und Hilfsmittel 32 2.2 Methoden 34 2.2.1 Zellkultur 34 2.2.1.1 Kulturmedien 34 2.2.1.2 Zellkulturtechnik 35 2.2.1.3 Zellernte der Suspensionszellen 35 2.2.1.4 Zellernte der adhärenten Zelllinien 35 2.2.1.5 Bestimmung der Zellzahl 36 2.2.1.6 Kryokonservierung 36 2.2.1.7 Auftauen 37 2.2.1.8 Hybridomkultivierung 37 2.2.1.9 Kultur von AML Blasten 37 2.2.2 Durchflusszytometrie 37 2.2.2.1 Oberflächenfärbung von Zelllinien 38 2.2.2.2 Oberflächenfärbung von PBMC und Granulozyten 39 2.2.2.3 Intrazelluläre Färbung 39 2.2.2.4 Detektion reaktiver Sauerstoffspezies mittels DCFDA-Färbung 39 2.2.2.5 SubG1-Analyse 41 2.2.3 Aufarbeitung von Gangliosiden aus Zellen 41 2.2.3.1 Herstellung des Rohextraktes 42 2.2.3.2 Entsalzung des Extraktes an einer Reversed Phase Chromatographie-Säule 43 2.2.4 Dünnschichtchromatographie - HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatographie) 44 2.2.4.1 Detektion mit Orcinfärbung 44 2.2.4.2 Detektion mit Primulin - Färbung 45 2.2.4.3 Detektion mit Overlay - Immunfärbung 45 2.2.5 Isolation von Glycolipiden aus lyophilisierter Buttermilch 47 2.2.5.1 Herstellung des Rohextraktes 48 2.2.5.2 Entsalzung mittels Dialyse 49 2.2.5.3 Si60-Kieselgel-Chromatographie 49 2.2.5.4 DEAE-Ionenaustauschchromatographie 50 2.2.5.5. Entsalzung mit RP-Säule 51 2.2.5.6 HPLC (High Performance Liquid Chromatographie) 51 2.2.6 Herstellung von GD3-7-Aldehyd aus GD3 52 2.2.6.1 Oxidation von Gangliosiden in situ auf HPTLC-Platten 52 2.2.6.2 Darstellung von GD3-7-Aldehyd unter Verwendung von Wasserstoffperoxid und Eisen-II-clorid (Fenton Reaktion) 53 2.2.7 Herstellung monoklonaler Antikörper gegen GD3-7-Aldehyd 53 2.2.7.1 Immunisierung der Mäuse 54 2.2.7.2 Vorbereitung der Myelomzellen 54 2.2.7.3 Präparation der Milzzellen 55 2.2.7.4 Fusion der Milz- und Myelomzellen 55 2.2.7.5 Selektion und Klonierung 56 2.2.7.5.1 Screening 56 2.2.7.5.2 Ermittlung der Spezifität 57 2.2.7.5.3 Bestimmung der Immunglobulinklasse und des Subtyps 57 2.2.8 Separation mononukleärer Zellen (PBMCs) und Granulozyten aus Vollblut 57 2.2.8.1 Isolation einzelner Leukozytenpopulationen mittels MACS Technologie 58 2.2.8.1.1 Positivselektion von Monozyten 58 2.2.8.1.2 Positivselektion von Slan-DCs mit M-DC8 58 2.2.9 Generierung und Maturierung von Dendritischen Zellen aus Monozyten 59 2.2.10 Indirekte Immunfluoreszenz 60 2.2.10.1 Aufzentrifugieren von Suspensionszellen auf Objektträger 60 2.2.10.2 Fixierung und Permeabilisierung der Zellen auf Objektträgern 60 2.2.10.3 Fluoreszenzfärbung von Zellen und Geweben auf Objektträgern 60 2.2.11 Immunhistochemische Färbung mit modifizierter ABC-Methode 61 2.2.12 Behandlung von HL60 mit GD3-7-Aldehyd 62 2.2.13 Inkubationsversuche von Molt-4 mit unterschiedlichen GD3-Derivaten 63 2.2.14 Induktion reaktiver Sauerstoffspezies in HEp-2 durch UV-Bestrahlung 63 3 ERGEBNISSE 64 3.1 Darstellung der Glycolipidantigene GD3, 9-O-acetyl-GD3 und GD3-7-Aldehyd 65 3.1.1 Isolation von GD3 und 9-O-acetyl-GD3 aus lyophilisierter Buttermilch 65 3.1.1.1 Reinigung des Rohextraktes über Si60-Kieselgelchromatographie 65 3.1.1.2 Reinigung des Glycolipidgemisches über DEAE-Sepharose-Ionenaustauschchromatographie 66 3.1.1.3 Reinigung der Ganglioside GD3 und 9-O-acetyl-GD3 mittels High Performance Liquid Chromatographie (HPLC) 67 3.1.1.4 Quantifizierung des gewonnenen Gangliosids GD3 69 3.1.1.5 Aufarbeitung von Gangliosidproben zur Gewinnung von 9-O-acetyl-GD3 70 3.1.2 Darstellung von GD3-7-al aus GD3 unter Verwendung von Natriumperjodat 71 3.2 Herstellung eines GD3-7-Aldehyd-spezifischen monoklonalen Antikörpers 73 3.2.1 Milzpräparation und Fusion 75 3.2.2 Entwicklung einer Screening-Methode für Hybridoma-Überstände 75 3.2.3 Vermehrung und Klonierung der produzierenden Zellen 77 3.2.4 Spezifität der Klone 77 3.2.5 Sensitivität der glycolipidspezifischen monoklonalen Antikörper 82 3.2.6 Nutzbarkeit des Antikörpers 10C6 für die Durchflusszytometrie 85 3.3 Apoptoseinduktion mit unterschiedlichen GD3-Derivaten an Molt-4-Zellen 86 3.4 Darstellung von GD3-7-al in vitro unter Bedingungen des oxidativen Stresses 88 3.5 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd in biologischen Materialien 89 3.5.1 Indirekte Immunfluoreszenz mit den Antikörpern R24, M-T6004 und 10C6 auf verschiedenen Primatengeweben 89 3.5.2 Immunhistochemie mit den Antikörpern R24, M-T6004 und 10C6 auf humanem Darmgewebe 92 3.5.3 GD3-Metabolite im Lipidextrakt verschiedener Tumorzelllinien 93 3.5.4 GD3-Metabolite in Tumorgeweben 95 3.5.5 Nachweis von GD3-7-Aldehyd in peripheren mononukleären Blutzellen 97 3.5.5.1 Identifizierung der GD3-7-Aldehyd-haltigen Zellpopulation mittels Durchflusszytometrie 98 3.5.5.2 Untersuchung 6-Sulfo-LacNAc-dendritischer Zellen aus peripherem Blut auf das Vorkommen von GD3-7-Aldehyd 100 3.5.5.3 Untersuchung der von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDCs) 101 3.5.5.4 Untersuchung von Granulozyten 103 3.5.5.5 Vorkommen von GD3 und GD3-7-Aldehyd auf der Oberfläche von AML-Blasten 105 3.6 Untersuchung der Eignung von GD3-7-Aldehyd als mögliche Zielstruktur für eine immunologische Tumortherapie 107 3.6.1 Auswirkung von Bestrahlung und Wasserstoffperoxidinkubation auf die Ausprägung des 10C6 - Antigens auf der Oberfläche von AML-Blasten 107 3.6.2 Oxidation des Gangliosides GD3 auf der Oberfläche von Melanomzellen 108 3.6.3 Untersuchung der Ausprägung des 10C6-Antigens auf der Oberfläche von HEp-2-Zellen in Abhängigkeit vom Auftreten reaktiver Sauerstoffspezies 109 3.6.4 Untersuchung der Ausprägung von GD3-7-Aldehyd auf der Oberfläche von SK-Mel-23-Zellen in Abhängigkeit vom Auftreten reaktiver Sauerstoffspezies 112 3.6.5 Nachweis der Einlagerung von GD3-7-Aldehyd in die Zellmembran von HL60-Zellen 114 3.6.5.1 Nachweis des integrierten GD3-7-Aldehyd in Abhängigkeit von der Zeit 115 4 DISKUSSION 117 4.1 Untersuchung von GD3-7-Aldehyd – der Weg vom Apoptosemediator zum Tumortarget 117 4.2 Darstellung der Glycolipidantigene GD3, 9-O-acetyl-GD3 und GD3-7-Aldehyd 118 4.3 GD3-7-Aldehyd als Effektormolekül der mitochondrial vermittelten Apoptose 120 4.4 Gangliosidspezifische Antikörper 124 4.4.1 Immunogenität von nativen und modifizierten Gangliosiden 124 4.4.2 Auswahl antikörperproduzierender Zellklone mit neuem Screeningverfahren 127 4.4.3 Bindungsverhalten des monoklonalen Antikörpers 10C6 127 4.4.4 Bindungsverhalten des monoklonalen Antikörpers R24 128 4.4.5 Bindungsverhalten des monoklonalen Antikörpers M-T6004 129 4.4.6 Nutzbarkeit des monoklonalen Antikörpers 10C6 für die Durchflusszytometrie und die indirekte Immunfluoreszenz 129 4.5 Reaktive Sauerstoffspezies in biologischen Systemen 129 4.5.1 Darstellung von GD3-7-al in vitro unter Bedingungen des oxidativen Stresses 130 4.6 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd in biologischen Systemen 131 4.6.1 Gewebefärbungen 131 4.6.2 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd in Tumorzellen 132 4.6.3 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd auf peripheren mononukleären Blutzellen 135 4.7 Tumortargeting mit GD3-7-Aldehyd 137 4.7.1 Untersuchung des Vorkommens von GD3-7-Aldehyd in Abhängigkeit vom Auftreten reaktiver Sauerstoffspezies 137 4.7.2 Dekorationsversuche HL60 138 4.7.3 Einbau veränderter Sialinsäuren als Therapiemodell 138 4.8 Ausblick 141 5 ZUSAMMENFASSUNG 143 6 LITERATURVERZEICHNIS 147 ANHANG 159 Abkürzungen 159 Abbildungen 162 Tabellen 166 Danksagung 167 THESEN 168 ANLAGE 1 169 ANLAGE 2 170 / Glycosphingolipids are a group of amphiphatic membrane and structure lipids consisting of one molecule of the aminoalcohol Sphingosin or one of its derivatives, a long chain fatty acid, and a carbohydrate moiety as polar side chain. One subgroup of these substances are gangliosides, which are characterized by sialic acid as a component of their glycan chain. The ganglioside GD3 is described as tumor associated antigen on the surface of neuroectodermal tumors and as proapoptotic lipid mediator. Its biological functions as well as its mode of operation in the context of apoptosis still remain unclear. There are hints, that not GD3 itself, but an oxidized derivative represents the actual effector molecule. A minimal change in the GD3 molecule, the 9-O-acetylation of the side chain of the terminal sialic acid, abolishes the proapoptotic effect completely. Tumor cells with activity of the enzyme 9-O-acetyltransferase can escape from apoptosis like that. The request of this work was to investigate the occurrence and function of this so far solely artificially generated oxidized GD3 derivative. The impact of oxidized GD3 on the survival of GD3-resistant tumor cells had to be analyzed. It had to be examined, whether GD3-7-aldehyde occurs in primary cells and tissues. Withal it was to clarify, if the molecule occurs under conditions of oxidative stress and if it can be induced on the surface of cells or intracellularly. Following that, it was to contemplate which novel approaches of immunological therapies for the treatment of resistant tumors could be possible under the use of GD3-7-aldehyde. Prerequisite to all experiments of this work and for following research are reliable detection methods of the metabolites GD3, and GD3-7-aldehyde. Whereas for the detection of GD3 and 9-O-acetyl-GD3 monoclonal antibodies were already existing, for the detection of GD3-7-aldehyde a novel monoclonal antibody directed against an oxidized ganglioside had to be generated for the first time and had to be characterized. For the selection of antibody producing cells, a new screening method had to be established. For the examination of the binding behavior of the ganglioside specific antibodies and for the performance of the incubation assays the gangliosides GD3 and 9-O-acetyl-GD3 had to be isolated from lyophilized bovine buttermilk via several chromatography steps and the oxidized derivative had to be produced. In doing so, GD3-7-al was purified by HPLC for the first time. The monoclonal antibody 10C6 generated in the framework of this study is member of immunoglobulin subclass IgG2a and binds to the oxidized form of the ganglioside GD3. The antigen detected by 10C6 is a glycan chain with structure Neu5Ac-8Neu5Ac-3Gal with oxidized terminal sialic acid. The antibody does not react with reduced or 9-O-acetylated forms of the ganglioside GD3 and possesses a higher sensitivity than the antibodies, established for the detection of both other GD3 derivatives. In this work it is shown in vitro, that the oxidative modification of GD3 to GD3-7-aldehyde can arise under conditions of oxidative stress. In GD3-resistant Molt-4-cells this substance induces apoptosis. Therefore GD3-7-aldehyde comes into consideration to be a proapoptotic effector molecule. The antigen detected by 10C6 occurs on the surface of monocytes of particular donors. Further, it can be found on the surface of a portion of the blasts of acute myeloic leukemia. Other leucocytes of the peripheral blood do not show this structure. GD3-7-aldehyde occurs in tumor cell lines HEp-2, HL60, and T47D. Hints for the existence of structures with oxidatively modified sialic acid were found in tissue slides of human mamma carcinoma and fetal gut. In tissues of adult primates this was not the case. On the surface of melanoma cell lines like Ma-Mel-11, Ma-Mel-95, and SK-Mel-23, existing GD3 can be converted into GD3-7-aldehyde by sodium periodate treatment. UV radiation can induce a structure detectable by 10C6 on the surface of HEp-2- and SK-Mel-23-cells. HL60-cells can be decorated by externally administered GD3-7-aldehyde. It is detectable on their surface for up to 48 hours. For an immunological approach of tumor therapy, the sparsely incidence of this antigen in healthy tissues as well as the inducibility on the surface of distinct tumor cells after pretreatment and the toxicity of this substance could be advantageous. A fitting antibody is now available. The detection methods established in the context of this work can be applied for further investigations in glycolipid research.:1 EINLEITUNG 1 1.1 Sphingolipide, Glycosphingolipide und Ganglioside 1 1.1.1 Biosynthese und Transport der Ganglioside 5 1.1.2 Biologische Funktionen und pathophysiologische Bedeutung der Ganglioside 10 1.2 Sialinsäuren 12 1.3 Das Disialogangliosid GD3 16 1.3.1 Vorkommen von GD3 16 1.3.2 Biologische Wirkungen von GD3 17 1.3.3 GD3 als Zielstruktur in der Tumortherapie 20 1.3.4 Modifikationen der Sialinsäure von GD3 23 1.3.4.1 9-O-Acetylierung der terminalen Sialinsäure von GD3 23 1.3.4.2 Oxidation der terminalen Sialinsäure von GD3 25 1.4 Zielstellung 27 2 MATERIAL UND METHODEN 28 2.1 Materialien 28 2.1.1 Biologische Materialien 28 2.1.1.1 Patientenproben 28 2.1.1.2 Versuchstiere 28 2.1.1.3 Zelllinien und Hybridome 28 2.1.2 Reagenzien, Antikörper und Enzyme 29 2.1.3 Chemikalien 31 2.1.4 Geräte und Hilfsmittel 32 2.2 Methoden 34 2.2.1 Zellkultur 34 2.2.1.1 Kulturmedien 34 2.2.1.2 Zellkulturtechnik 35 2.2.1.3 Zellernte der Suspensionszellen 35 2.2.1.4 Zellernte der adhärenten Zelllinien 35 2.2.1.5 Bestimmung der Zellzahl 36 2.2.1.6 Kryokonservierung 36 2.2.1.7 Auftauen 37 2.2.1.8 Hybridomkultivierung 37 2.2.1.9 Kultur von AML Blasten 37 2.2.2 Durchflusszytometrie 37 2.2.2.1 Oberflächenfärbung von Zelllinien 38 2.2.2.2 Oberflächenfärbung von PBMC und Granulozyten 39 2.2.2.3 Intrazelluläre Färbung 39 2.2.2.4 Detektion reaktiver Sauerstoffspezies mittels DCFDA-Färbung 39 2.2.2.5 SubG1-Analyse 41 2.2.3 Aufarbeitung von Gangliosiden aus Zellen 41 2.2.3.1 Herstellung des Rohextraktes 42 2.2.3.2 Entsalzung des Extraktes an einer Reversed Phase Chromatographie-Säule 43 2.2.4 Dünnschichtchromatographie - HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatographie) 44 2.2.4.1 Detektion mit Orcinfärbung 44 2.2.4.2 Detektion mit Primulin - Färbung 45 2.2.4.3 Detektion mit Overlay - Immunfärbung 45 2.2.5 Isolation von Glycolipiden aus lyophilisierter Buttermilch 47 2.2.5.1 Herstellung des Rohextraktes 48 2.2.5.2 Entsalzung mittels Dialyse 49 2.2.5.3 Si60-Kieselgel-Chromatographie 49 2.2.5.4 DEAE-Ionenaustauschchromatographie 50 2.2.5.5. Entsalzung mit RP-Säule 51 2.2.5.6 HPLC (High Performance Liquid Chromatographie) 51 2.2.6 Herstellung von GD3-7-Aldehyd aus GD3 52 2.2.6.1 Oxidation von Gangliosiden in situ auf HPTLC-Platten 52 2.2.6.2 Darstellung von GD3-7-Aldehyd unter Verwendung von Wasserstoffperoxid und Eisen-II-clorid (Fenton Reaktion) 53 2.2.7 Herstellung monoklonaler Antikörper gegen GD3-7-Aldehyd 53 2.2.7.1 Immunisierung der Mäuse 54 2.2.7.2 Vorbereitung der Myelomzellen 54 2.2.7.3 Präparation der Milzzellen 55 2.2.7.4 Fusion der Milz- und Myelomzellen 55 2.2.7.5 Selektion und Klonierung 56 2.2.7.5.1 Screening 56 2.2.7.5.2 Ermittlung der Spezifität 57 2.2.7.5.3 Bestimmung der Immunglobulinklasse und des Subtyps 57 2.2.8 Separation mononukleärer Zellen (PBMCs) und Granulozyten aus Vollblut 57 2.2.8.1 Isolation einzelner Leukozytenpopulationen mittels MACS Technologie 58 2.2.8.1.1 Positivselektion von Monozyten 58 2.2.8.1.2 Positivselektion von Slan-DCs mit M-DC8 58 2.2.9 Generierung und Maturierung von Dendritischen Zellen aus Monozyten 59 2.2.10 Indirekte Immunfluoreszenz 60 2.2.10.1 Aufzentrifugieren von Suspensionszellen auf Objektträger 60 2.2.10.2 Fixierung und Permeabilisierung der Zellen auf Objektträgern 60 2.2.10.3 Fluoreszenzfärbung von Zellen und Geweben auf Objektträgern 60 2.2.11 Immunhistochemische Färbung mit modifizierter ABC-Methode 61 2.2.12 Behandlung von HL60 mit GD3-7-Aldehyd 62 2.2.13 Inkubationsversuche von Molt-4 mit unterschiedlichen GD3-Derivaten 63 2.2.14 Induktion reaktiver Sauerstoffspezies in HEp-2 durch UV-Bestrahlung 63 3 ERGEBNISSE 64 3.1 Darstellung der Glycolipidantigene GD3, 9-O-acetyl-GD3 und GD3-7-Aldehyd 65 3.1.1 Isolation von GD3 und 9-O-acetyl-GD3 aus lyophilisierter Buttermilch 65 3.1.1.1 Reinigung des Rohextraktes über Si60-Kieselgelchromatographie 65 3.1.1.2 Reinigung des Glycolipidgemisches über DEAE-Sepharose-Ionenaustauschchromatographie 66 3.1.1.3 Reinigung der Ganglioside GD3 und 9-O-acetyl-GD3 mittels High Performance Liquid Chromatographie (HPLC) 67 3.1.1.4 Quantifizierung des gewonnenen Gangliosids GD3 69 3.1.1.5 Aufarbeitung von Gangliosidproben zur Gewinnung von 9-O-acetyl-GD3 70 3.1.2 Darstellung von GD3-7-al aus GD3 unter Verwendung von Natriumperjodat 71 3.2 Herstellung eines GD3-7-Aldehyd-spezifischen monoklonalen Antikörpers 73 3.2.1 Milzpräparation und Fusion 75 3.2.2 Entwicklung einer Screening-Methode für Hybridoma-Überstände 75 3.2.3 Vermehrung und Klonierung der produzierenden Zellen 77 3.2.4 Spezifität der Klone 77 3.2.5 Sensitivität der glycolipidspezifischen monoklonalen Antikörper 82 3.2.6 Nutzbarkeit des Antikörpers 10C6 für die Durchflusszytometrie 85 3.3 Apoptoseinduktion mit unterschiedlichen GD3-Derivaten an Molt-4-Zellen 86 3.4 Darstellung von GD3-7-al in vitro unter Bedingungen des oxidativen Stresses 88 3.5 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd in biologischen Materialien 89 3.5.1 Indirekte Immunfluoreszenz mit den Antikörpern R24, M-T6004 und 10C6 auf verschiedenen Primatengeweben 89 3.5.2 Immunhistochemie mit den Antikörpern R24, M-T6004 und 10C6 auf humanem Darmgewebe 92 3.5.3 GD3-Metabolite im Lipidextrakt verschiedener Tumorzelllinien 93 3.5.4 GD3-Metabolite in Tumorgeweben 95 3.5.5 Nachweis von GD3-7-Aldehyd in peripheren mononukleären Blutzellen 97 3.5.5.1 Identifizierung der GD3-7-Aldehyd-haltigen Zellpopulation mittels Durchflusszytometrie 98 3.5.5.2 Untersuchung 6-Sulfo-LacNAc-dendritischer Zellen aus peripherem Blut auf das Vorkommen von GD3-7-Aldehyd 100 3.5.5.3 Untersuchung der von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDCs) 101 3.5.5.4 Untersuchung von Granulozyten 103 3.5.5.5 Vorkommen von GD3 und GD3-7-Aldehyd auf der Oberfläche von AML-Blasten 105 3.6 Untersuchung der Eignung von GD3-7-Aldehyd als mögliche Zielstruktur für eine immunologische Tumortherapie 107 3.6.1 Auswirkung von Bestrahlung und Wasserstoffperoxidinkubation auf die Ausprägung des 10C6 - Antigens auf der Oberfläche von AML-Blasten 107 3.6.2 Oxidation des Gangliosides GD3 auf der Oberfläche von Melanomzellen 108 3.6.3 Untersuchung der Ausprägung des 10C6-Antigens auf der Oberfläche von HEp-2-Zellen in Abhängigkeit vom Auftreten reaktiver Sauerstoffspezies 109 3.6.4 Untersuchung der Ausprägung von GD3-7-Aldehyd auf der Oberfläche von SK-Mel-23-Zellen in Abhängigkeit vom Auftreten reaktiver Sauerstoffspezies 112 3.6.5 Nachweis der Einlagerung von GD3-7-Aldehyd in die Zellmembran von HL60-Zellen 114 3.6.5.1 Nachweis des integrierten GD3-7-Aldehyd in Abhängigkeit von der Zeit 115 4 DISKUSSION 117 4.1 Untersuchung von GD3-7-Aldehyd – der Weg vom Apoptosemediator zum Tumortarget 117 4.2 Darstellung der Glycolipidantigene GD3, 9-O-acetyl-GD3 und GD3-7-Aldehyd 118 4.3 GD3-7-Aldehyd als Effektormolekül der mitochondrial vermittelten Apoptose 120 4.4 Gangliosidspezifische Antikörper 124 4.4.1 Immunogenität von nativen und modifizierten Gangliosiden 124 4.4.2 Auswahl antikörperproduzierender Zellklone mit neuem Screeningverfahren 127 4.4.3 Bindungsverhalten des monoklonalen Antikörpers 10C6 127 4.4.4 Bindungsverhalten des monoklonalen Antikörpers R24 128 4.4.5 Bindungsverhalten des monoklonalen Antikörpers M-T6004 129 4.4.6 Nutzbarkeit des monoklonalen Antikörpers 10C6 für die Durchflusszytometrie und die indirekte Immunfluoreszenz 129 4.5 Reaktive Sauerstoffspezies in biologischen Systemen 129 4.5.1 Darstellung von GD3-7-al in vitro unter Bedingungen des oxidativen Stresses 130 4.6 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd in biologischen Systemen 131 4.6.1 Gewebefärbungen 131 4.6.2 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd in Tumorzellen 132 4.6.3 Vorkommen von GD3-7-Aldehyd auf peripheren mononukleären Blutzellen 135 4.7 Tumortargeting mit GD3-7-Aldehyd 137 4.7.1 Untersuchung des Vorkommens von GD3-7-Aldehyd in Abhängigkeit vom Auftreten reaktiver Sauerstoffspezies 137 4.7.2 Dekorationsversuche HL60 138 4.7.3 Einbau veränderter Sialinsäuren als Therapiemodell 138 4.8 Ausblick 141 5 ZUSAMMENFASSUNG 143 6 LITERATURVERZEICHNIS 147 ANHANG 159 Abkürzungen 159 Abbildungen 162 Tabellen 166 Danksagung 167 THESEN 168 ANLAGE 1 169 ANLAGE 2 170

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Une nouvelle stratégie oncologique, basée sur l’intégration de la radiothérapie nanovectorisée et l’administration loco-régionale, a été évaluée pour le traitement et l’imagerie du glioblastome, le type le plus commun des tumeurs cérébrales primaires. Les dendrimères Gallic Acid-Triethylène Glycol (GATG) sont des nanovecteurs de choix pour délivrer simultanément l’agent thérapeutique (le radioisotope 188Re par son rayonnement béta a été retenu) et l’agent diagnostique (le gadolinium est un agent paramagnétique utilisé en Imagerie par Résonance Magnétique (IRM)). Leur évaluation a été réalisée par administration locorégionale par stéréotaxie sur un modèle de rat F 98. Les données pharmaco-cinétiques ont été également obtenues après injection intraveineuse permettant d’apprécier les propriétés des différents dendrimères synthétisés. Leur apport en terme de confinement au site d’injection représente un avantage majeur de ce nouveau type de radiopharmaceutiques. / A new oncologic strategy, based on the integration of nanovectorized radiotherapy and locoregional delivery, was evaluated for the treatment and imaging of glioblastomas, the most common and lethal type of primary brain tumors. Gallic acidtriethylene glycol (GATG) dendrimers were the nanovectors of choice to deliver the radiotherapeutic 188Re and paramagnetic nuclei Gd3+, with a minimally invasive stereotactic injection, directly depositing the radiotherapeutic dose to the tumor site in a F98 rat glioma model. Intravenous injection was used to further investigate the pharmacokinetics, throughout body distribution and clearance profiles of these dendrimers. Molecular weight and architecture had an important role on the in vivo behavior of the dendrimers. Their use as nanovectors prevented the fast brain clearance of the radionuclide alone, and prolonged the confinement of the internal radiation at the tumor site.

Melanoma is the most deadly form of skin cancers, with an incidence increasing more rapidly than any other malignant cancer in the past 40 years. Metastatic melanoma is resistant to conventional treatments, such as chemotherapy and radiation therapy. Our lab has previously demonstrated that Mcl-1 is a key contributor in protecting melanoma from therapy-induced cell death. RNAi therapeutics was employed as a novel way to silence the anti-apoptotic protein by using Mcl-1 mRNA sequence-specific siRNAs in vitro. In our hands, passive non-targeted delivery of RNAi therapy into melanoma tumours has been shown to be neither effective, nor selective in vitro and in vivo. Consequently, in this study, siRNA was linked to a delivery system which expressed a ligand specifically targeting melanoma cells. Previously shown, melanoma overexpresses the cell surface ganglioside GD3, thus it is my belief that the anti-GD3 R24 monoclonal antibody can function as a targeting molecule. The antibody was linked to coated cationic liposomes (CCLs) carrying siRNA molecules. Our first step was to confirm R24 ligation to CCLs. Untargeted CCLs showed insignificant values of antibody, whereas antibody-conjugated CCLs presented approximately 30 antibodies per liposome. I also confirmed that siRNA was internalized within CCLs using spectrometry, with an encapsulation efficiency of approximately 80%. Since liposomes need to be small to be effective in vitro and in vivo, CCLs were confirmed to be less than 100nm in diameter. In vitro studies using fluorescent microscopy demonstrated greater binding to melanoma cells with antibody-conjugated CCLs as compared to untargeted CCLs. In vivo experiments showed specific localization of targeted CCLs to induced subcutaneous mouse xenograft tumours. Western blotting demonstrated greater Mcl-1 knockdown using GD3-targeted CCLs. Taken together, these results suggest that anti-GD3 antibodies can serve as targeting molecules to deliver siRNA to melanoma cells and furthermore, GD3-targeted CCLs can promote siRNA-mediated gene silencing. / Thesis (Master, Pathology & Molecular Medicine) -- Queen's University, 2010-09-02 10:29:37.944

The structural characteristics associated with the binding of beneficial metals (i.e. - Mg2+, Zn2+ and Ca2+) to natural proteins has typically received more attention than competitive binding by toxic metals (e.g. – Pb2+, Hg2+, Cd2+, La3+, etc.). In this thesis, a statistical analysis of Pb2+-binding in crystallized protein structures indicates that Pb2+ does not bind preferentially with nitrogen, as generally assumed, but binds predominantly with oxygen, and to a lesser degree, sulfur. A comparison of Ca2+ and Pb2+ indicates that Pb2+ binds with a wider range of coordination numbers, with less formal change, and with less defined structure than Ca2+. The Pb2+ ion also appears to displace Ca2+ with little conformational stress in calcium binding proteins (CaBP’s). Experimental data from the binding of metals with engineered fluorescent proteins indicate that both Pb2+ and Gd3+ will occupy grafted calcium-binding sites with greater affinity than Ca2+, and strong evidence is presented to support the hypothesis that Pb2+ and Gd3+ will bind non-specifically on the protein surface. These results suggest that toxicity is associated with two binding mechanisms: displacement of the metal cofactor which disrupts protein function, and non-specific binding which maintains higher solubility of the metal.