Le chrome (Cr) est un métal largement distribué sur la croûte terrestre. Les formes les plus couramment rencontrées sont le Cr (III), longtemps considéré comme un nutriment essentiel à la vie et le Cr(VI), cancérigène avéré pour l’homme. La source majeure d’exposition de la population au chrome total étant l’alimentation, des données en spéciation sont nécessaires afin d’évaluer le risque relatif à l’ingestion de chrome. La première partie de ce mémoire présente de façon générale la problématique du chrome. La deuxième partie a été consacrée à l’optimisation d’une méthode de séparation des espèces du chrome. La méthodologie des plans d’expériences a permis en un minimum d’essais d’évaluer l’influence des différentes facteurs et de leurs interactions afin de déterminer les conditions de séparation optimales. La troisième partie porte sur la mise au point d’une méthode d’extraction sélective du Cr(VI) dans les produits laitiers et céréaliers, par plan d’expériences également. Une étude de la correction des interférences et des inter conversions a également été réalisée démontrant de la justesse de la méthode. La méthode a ensuite été validée selon l’approche du profil d’exactitude et appliquée à l’analyse de 65 échantillons de produits laitiers et céréaliers ; aucune trace de Cr(VI) n’a été détectée. La quatrième partie présente le développement d’une méthode d’analyse sélective du Cr(III) dans les produits laitiers. Les performances de la méthode ont ensuite été évaluées avant son application à des échantillons réels. Les résultats confirment que le chrome total présent dans ces matrices serait bien sous forme de Cr(III). Il serait nécessaire de poursuivre ces travaux sur d’autres matrices afin de pouvoir estimer l’ensemble de l’exposition des consommateurs et de mieux évaluer les risques inhérents à la présence de chrome dans les aliments, selon sa forme présente / Chromium (Cr) is a metal widely distributed throughout the Earth’s crust. Most commonly forms found are Cr(III), which has long been considered as an essential nutrient for human health, and Cr(VI) which is carcinogenic to humans. The most important contribution to the overall exposure of total chromium in general population is through food. To improve risk assessment on the presence of chromium, there is a need to accurately determine the content of Cr(III) and Cr(VI) in food. The first part of this work focuses on the issue of chromium. The second part deals about the optimization of a separation method for chromium species. Experimental design allowed us to study effects of factors and their interactions in order to determine the best analytical conditions. Third part is the development and validation of selective alkaline extraction for Cr(VI) in dairy and cereal products, also using experimental design. A study of the correction of the interferences and of interconversions is also presented showing the accuracy of the method. Analytical performances were assessed by the accuracy profile method and the method was used to determine Cr(VI) in 65 samples of dairy and cereal products ; Cr(VI) was not detected in these samples. The last part is devoted to develop a selective determination method for Cr(III) in dairy products. Analytical performances of the method were assessed before its use to determine Cr(III) in dairy products samples. Results confirm that chromium in those matrices will be Cr(III). It would be interesting to continue this work in order to study other matrices to better assess consumer exposure and to improve risk assessment related to the presence of chromium in food, depending on its speciation

In dieser Arbeit wurde die Funktionsweise der sauren Histidin-Phosphatasen (HAPs) an zwei Vertretern, der PhyK (Phytase) aus Klebsiella sp. ASR1 und der AgpE (Glukose-1-Phosphatase) aus Enterobacter cloacae, untersucht. Neben den biochemischen Charakterisierungen der beiden Enzyme und deren Substitutionsmutanten konnten die Proteinstrukturen aufgeklärt werden. Die Kokristallisationen mit Phytat bzw. myo-Inositolhexasulfat ermöglichten die Modellierungen der Substratbindungen in den aktiven Zentren. Es konnten für die Glukose-1-Phosphatase AgpE zum ersten Mal zwei Konformationszustände, eine offene und eine geschlossene Form, ähnlich der E. coli Phytase (AppA) gezeigt werden. Ungeachtet deutlicher funktioneller Unterschiede wiesen die AgpE und AppA starke strukturelle Ähnlichkeiten auf. Deshalb wurden gezielte Aminosäuren-Substitutionen im aktiven Zentrum der AgpE durchgeführt, um deren Eigenschaften zu modifizieren. Bereits der Austausch von nur zwei Aminosäuren führte zu einem deutlich veränderten Substratspektrum der AgpE und bewirkte einen weiteren, hier zum ersten Mal gezeigten, Phytatabbau durch eine Glukose-1-Phosphatase. Die PhyK aus Klebsiella sp. ASR1 wurde ebenfalls verschiedenen Substitutionsmutagenesen unterzogen. Hierbei wurden Phytasevarianten erzeugt, die bis zu 20 % höhere spezifische Aktivitäten und damit einen effizienteren Phytatabbau aufwiesen sowie eine deutlich verringerte Substrathemmung zeigten. Aus den “High Performance Ion Chromatography” Analysen (HPIC) des Phytatabbaus der nativen Klebsiella-Phytase und der Mutanten konnten Rückschlüsse auf die Bedeutung einzelner Aminosäuren für die Substratbindung und daher auch auf den Hydrolysemechanismus gezogen werden. Ausserdem konnte auch gezeigt werden, dass der kombinierte Einsatz der effizienteren Phytasemutante mit der nativen AppA aus E. coli eine deutlich schnellere, vollständige Phytathydrolyse bewirkte und somit einen interessanten Aspekt für die Anwendung in der Tierernährung darstellt. / This work presents the analysis of the enzymatic function of histidine acid phosphatases (HAPs) exemplary studied on two enzymes: the phytase of Klebsiella sp. ASR1 (PhyK) and the glucose-1-phosphatse (AgpE) of Enterobacter cloacae. The AgpE belongs to the HAPs and shows lower catalytic activity for phytate. Besides biochemical analysis the structure of these two enzymes were solved. Binding of phytate and the inhibitor myo-inositolhexa sulfate at the active site of these enzymes were fitted according to the date obtained by co-crystallisations experiments. For the first time two district conformational states could be observed for a glucose-1-phosphatase (AgpE). The open and closed conformations as well as the structures were very similar to the well characterized AppA phytase of E. coli however bothe enzymes showed differences in catalytic efficiency. For this reason substitutions of amino acid within the active site were performed to change substrate spectra and specific activities. The substitutions of only two amino acids strongly changed the substrate spectrum and affected the further phytate hydrolysis by the AgpE. Extensive amino acid substitutions were performed for the phytase of Klebsiella sp. ASR1 as well. In this case phytase mutants with 20% higher specific phytase activities were generated. Besides that, the observed strong substrate-induced inhibitory effect on the phytase activity was lower in these mutants. The biochemical characterizations and high performance ion chromatography analysis (HIPC) of these phytase mutants allowed drawing conclusions of the importance of particular amino acid residues for substrate binding and substrate hydrolysis. Furthermore the combination of Klebsiella phytase mutant and AppA resulted in a more efficient phytate hydrolysis. This aspect offers an interesting possibility for usage of the Klebsiella phytase in livestock breading and animal feeding.