La nicotine est considérée comme étant la « molécule » addictogène de la cigarette et du tabac. Mais différentes études cliniques, utilisant notamment des substituts nicotiniques, débouchent pratiquement toutes sur une même conclusion : efficacité ne dépassant que de peu celle d’un placebo, et très limitée dans le temps, contrastant avec le pouvoir hautement addictif du tabac, qu'il soit chiqué, prisé ou fumé. Dans ce travail de thèse, nous avons essayé de mettre en évidence le rôle que pourraient avoir certains des autres composés présents dans le tabac ou produits par pyrolyse. Nous avons d’abord utilisé des extraits aqueux de fumée et de tabac pour approcher un aspect global de ce que les fumeurs absorbent chaque fois qu’ils fument une cigarette, nous rapprochant ainsi des conditions physiologiques du fumeur. Puis nous avons choisi un certain nombre de substances. La cotinine, métabolite de la nicotine. L’harmane, une ß-carboline, synthétisée au cours de la combustion et dans l’organisme des fumeurs. La norharmane, une ß-carboline, présente en partie dans le tabac et synthétisée dans la fumée par pyrolyse. La technique utilisée tout au long de ce travail est l’enregistrement électrophysiologique. Cette technique s’applique très bien à l’étude in vivo de différents systèmes neuronaux y compris le système dopaminergique. Nous l’avons utilisée chez le rat, la souris WT et la souris Knockout ß2 (ß2KO). Nous nous sommes intéressés à deux aspects de l’activité cellulaire des neurones dopaminergiques de l’aire tegmentale ventrale : la fréquence de décharge (le firing) et les bouffées (bursts). En parallèle, nous avons conduit des expériences de liaison (binding) sur des cultures de cellules exprimant le récepteur nicotinique α4ß2. Nos résultats les plus significatifs ont montré que : Les bursts sont le plus souvent absents après les injections d’extraits de tabac et de fumée. Cela pourrait, entre autres, impliquer qu’il existe dans le tabac et la fumée des composés autres que la nicotine qui bloquent les effets de la nicotine sur les bursts. Les effets des extraits de tabac et de fumée sur le firing et les bursts ne sont plus présents chez les souris ß2 KO, ce qui implique que l’ensemble des composés du tabac agit essentiellement sur les récepteurs nicotiniques porteurs de la chaine ß2, même si des hypothèses alternatives existent. L’harmane a des effets activateurs très puissants sur le firing des neurones dopaminergiques, et ces effets sont bloqués à 80% par la mécamylamine, ce qui démontre qu’un des principaux composés du tabac et de la fumée autre que la nicotine agit par un mécanisme essentiellement nicotinique. Les expériences de binding confirment que les effets du tabac et de la fumée impliquent les récepteurs nicotiniques d’une façon majeure, mais d’une façon qui diffère légèrement de celle de la nicotine.Les résultats que nous avons obtenus montrent que les effets pharmacologiques du tabac ne se résument pas à ceux de la seule nicotine. Ils peuvent constituer un point de départ pour d’autres travaux, notamment pour étudier de plus près les effets des ß-carbolines. Il est nécessaire d’identifier les types de récepteurs sur lesquels elles se fixent, en utilisant des agonistes et antagonistes de récepteurs aux neurotransmetteurs contrôlant l’activité des neurones dopaminergiques. Des expériences sur des souris transgéniques chez lesquelles différents types de sous-unités de récepteurs nicotiniques ont été supprimés doivent également être envisagées, pour déterminer les mécanismes d’action des composants autres que la nicotine contenus dans le tabac et sa fumée sur les neurones dopaminergiques / Nicotine is generally considered as the sole tobacco addictive compound. However, nicotine replacement therapy studies almost all end with the same conclusion: the effectiveness of nicotine replacement is very limited on the short-term, and hardly exceeds that of placebo on the long-term. In addition, studies dealing with the effects of denicotinized cigarettes have provided evidence that these cigarettes have an addictive potential. In the present work, we tried to determine the behavioral role of some tobacco or smoke compounds other than nicotine at the neuronal level. We first compared the effects of nicotine with those of whole tobacco and smoke extracts, given that these preparations closer mimic the smoking situation than nicotine alone. We then examined the effects of a number of selected tobacco or smoke compounds. Cotinine, a major nicotine metabolite. Harmane and norharmane, two ß-carbolines synthesized in smoke as well as in the body of smokers. The technique used consists in the in vivo recording of the firing rate and bursts of dopamine neurons in the ventral tegmental area after intravenous injections of compounds in rats and mice. This electrophysiological technique is known to be a useful way to investigate the properties of selected compounds. In the case of mice, we used wild type and ß2 KO mice. We also made a series of in vitro experiments investigating the binding properties of the compounds on cells expressing high densities of α4ß2 nicotinic receptors. The main results of our studies are the following: Bursts are absent most of the times after the injection of the extracts. These results suggest that tobacco and smoke extracts contain compounds that inhibit the burst-promoting effects of nicotine. Increased firing is no longer present in ß2 KO mice treated with tobacco or smoke extracts, indicating that tobacco and smoke components, as a whole, primarily acts on nicotinic receptors that carry the ß2 chain, although alternative hypotheses may exist. Harmane very strongly activates the firing of dopaminergic neurons. Up to 80% of this effect is blocked by mecamylamine, demonstrating that that a major component of tobacco and smoke other than nicotine acts primarily through a nicotinic mechanism. The binding experiments confirm that the effects of tobacco and smoke involve nicotinic receptors in a major way, but in a way that slightly differs from that of nicotine. Our results may constitute a new starting point for further work, especially for a closer look at the effects of ß-carbolines. Attempts to identify the types of receptors involved in these effects are needed, using agonists and antagonists of neurotransmitter receptors that control the activity of dopamine neurons. Experiments on transgenic mice with deletion of different types of subunits of nicotinic receptors should also be made, to determine the different mechanisms of action of tobacco and smoke compounds other than nicotine on dopaminergic neurons

La nicotine est considérée comme étant la « molécule » addictogène de la cigarette et du tabac. Mais différentes études cliniques, utilisant notamment des substituts nicotiniques, débouchent pratiquement toutes sur une même conclusion : efficacité ne dépassant que de peu celle d'un placebo, et très limitée dans le temps, contrastant avec le pouvoir hautement addictif du tabac, qu'il soit chiqué, prisé ou fumé. Dans ce travail de thèse, nous avons essayé de mettre en évidence le rôle que pourraient avoir certains des autres composés présents dans le tabac ou produits par pyrolyse. Nous avons d'abord utilisé des extraits aqueux de fumée et de tabac pour approcher un aspect global de ce que les fumeurs absorbent chaque fois qu'ils fument une cigarette, nous rapprochant ainsi des conditions physiologiques du fumeur. Puis nous avons choisi un certain nombre de substances. La cotinine, métabolite de la nicotine. L'harmane, une ß-carboline, synthétisée au cours de la combustion et dans l'organisme des fumeurs. La norharmane, une ß-carboline, présente en partie dans le tabac et synthétisée dans la fumée par pyrolyse. La technique utilisée tout au long de ce travail est l'enregistrement électrophysiologique. Cette technique s'applique très bien à l'étude in vivo de différents systèmes neuronaux y compris le système dopaminergique. Nous l'avons utilisée chez le rat, la souris WT et la souris Knockout ß2 (ß2KO). Nous nous sommes intéressés à deux aspects de l'activité cellulaire des neurones dopaminergiques de l'aire tegmentale ventrale : la fréquence de décharge (le firing) et les bouffées (bursts). En parallèle, nous avons conduit des expériences de liaison (binding) sur des cultures de cellules exprimant le récepteur nicotinique α4ß2. Nos résultats les plus significatifs ont montré que : Les bursts sont le plus souvent absents après les injections d'extraits de tabac et de fumée. Cela pourrait, entre autres, impliquer qu'il existe dans le tabac et la fumée des composés autres que la nicotine qui bloquent les effets de la nicotine sur les bursts. Les effets des extraits de tabac et de fumée sur le firing et les bursts ne sont plus présents chez les souris ß2 KO, ce qui implique que l'ensemble des composés du tabac agit essentiellement sur les récepteurs nicotiniques porteurs de la chaine ß2, même si des hypothèses alternatives existent. L'harmane a des effets activateurs très puissants sur le firing des neurones dopaminergiques, et ces effets sont bloqués à 80% par la mécamylamine, ce qui démontre qu'un des principaux composés du tabac et de la fumée autre que la nicotine agit par un mécanisme essentiellement nicotinique. Les expériences de binding confirment que les effets du tabac et de la fumée impliquent les récepteurs nicotiniques d'une façon majeure, mais d'une façon qui diffère légèrement de celle de la nicotine.Les résultats que nous avons obtenus montrent que les effets pharmacologiques du tabac ne se résument pas à ceux de la seule nicotine. Ils peuvent constituer un point de départ pour d'autres travaux, notamment pour étudier de plus près les effets des ß-carbolines. Il est nécessaire d'identifier les types de récepteurs sur lesquels elles se fixent, en utilisant des agonistes et antagonistes de récepteurs aux neurotransmetteurs contrôlant l'activité des neurones dopaminergiques. Des expériences sur des souris transgéniques chez lesquelles différents types de sous-unités de récepteurs nicotiniques ont été supprimés doivent également être envisagées, pour déterminer les mécanismes d'action des composants autres que la nicotine contenus dans le tabac et sa fumée sur les neurones dopaminergiques

[pt] Neste trabalho foi avaliado o uso da Fosforimetria na Temperatura Ambiente em Substrato Sólido (FTASS) como técnica analítica aplicável na determinação de dois derivados da β-carbolina (harmane e harmine). Como suporte sólido foi utilizado o papel de filtro de baixo sinal de fundo. As características fosforescentes dos analitos foram estudadas em função de diversos parâmetros experimentais, que foram posteriormente otimizados visando a maximização do sinal fosforescente. Estes parâmetros foram: efeito de íons de átomos pesados; uso de surfactante como modificador de superfície; pH e volume de tampão; sistema de solventes e irradiação prévia das β-carbolinas com UV. As melhores situações para ambos os analitos foram obtidas em pH natural com a adição de Tl+ e em pH básico na presença de Ag+. Após a otimização das condições experimentais relevantes, os parâmetros analíticos de mérito foram obtidos. Para o harmane, faixas lineares dinâmicas (a partir do limite de quantificação, LQ) de 0,39 - 456 ng (Ag+/pH=12) e de 8,10 - 911 ng (Tl+/pH=7,7) foram obtidas. Para o harmine, a faixa linear dinâmica, partindo do LQ, foi de 0,59 - 1244 ng (dividido em duas faixas distintas) quando Ag+/pH=9 foi empregado. Com o uso de Tl+/pH=5,1, a faixa obtida foi de 0,53 a 249 ng. A precisão do método para as duas substâncias ficou dentro do esperado para esta técnica. Também foi estudado o potencial interferente de algumas substâncias (AZT, talidomida e outros) e da matriz urina. O desempenho do método foi testado através de testes de recuperação em formulações farmacêuticas simuladas e em urina enriquecida com o(s) analito(s), sendo as recuperações encontradas dentro da faixa recomendada de 90 a 110 %. Estudos envolvendo a determinação seletiva em misturas contendo ambos os derivados da β-carbolina mostraram a viabilidade da determinação seletiva de harmine na presença de harmane usando apenas um ajuste de pH. / [en] In the present work a Solid Surface Room-Temperature Phosphorimetry (SSRTP) based analytical method was developed aiming the determination of two â-carbolines derivatives (harmane and harmine). A low background filter paper was employed as solid support. The phosforimetric characteristics of the analytes were studied as function of several parameter, afterwards optimized aiming the maximization of phosphorescence. Among the studied parameters were the effect of heavy atom ions; the use of surfactants as substrate surface modifier; pH and volume of buffer; solvent system and the previuos UV irradiation of the analytes. The best results for both analytes were achieved using Tl+ in natural pH and using Ag+ in basic pH. After optimization of the relevant experimental conditions, the analytical figures of merit were obtained. For harmane, linear dynamic ranges (starting from the limit of quantification, LQ) from 0.39 to 456 ng (Ag+/pH=12) and from 8.10 to 911 ng (Tl+/pH=7.7) were achieved. For harmine, the linear dynamic ranges, stating from LQ, were from 0.59 to 1244 ng (divided in two linear ranges) when Ag+/pH=9 was used. When Tl+/pH=5.1 was employed, linear ranges were from 0.53 to 249 ng. The precision of the method was in accordance with the values expected for this technique. The potential interferent effect of some substances (AZT, thalidomide and others) as well as the effect of urine matrix were also studied. The performance of the method was evaluated by recovery tests using simulated pharmaceutical formulations and analyte spiked urine samples. In both cases, recoveries within the recomended range (from 90 to 110 %) were achieved. Studies involving the selective determination of â-carbolines derivatives have indicated that the determination of harmine in the presence of harmane is feasable only by a simple sample pH adjustment.