Primary Immunodeficiencies (PIDs) are defined as inherent defects in the immune system. Over 200 PIDs have been described; many in recent years with improvements in detection and increasing awareness. Multiple paradigm shifts have occurred in our understanding of PIDs. The literature review of this thesis seeks to highlight these shifts with suitable examples. One such paradigm shift occurring is the understanding that these diseases can also affect adults in a broader context. To date, there have been few exclusive analyses of cohorts of adults patients with PIDs. This manuscript-based thesis describes the clinical spectrum of diseases observed in 381 patients referred to the Immune Deficiency Treatment Centre with suspected PIDs. Of these, 196 were diagnosed with PID. This manuscript is in the process of being submitted, and represents Canada's first description of a cohort of patients with adult PIDs, and the largest cohort of exclusively adult PID patients. / L'Immunodéficience Primaire (IDP) est définie comme étant un défaut génétique du système immunitaire. Plus de 200 types d'IDPs ont été découverts; entre autre grâce à la prise de conscience de l'incidence de ces maladies et au perfectionnement des techniques de détection. Plusieurs changements de paradigme sont survenus dans le domaine des IDPs. Cette revue de littérature tente à mettre en évidence ces changements de paradigme par le biais d'exemples pertinents. Par exemple, il a été démontré que les adultes peuvent aussi être affectés par ces maladies plus que reconnu précédemment. Jusqu'à ce jour, peu d'analyses ont été effectuées exclusivement sur des cohortes de patients adultes souffrant d'IDPs. Cette thèse décrit le spectre clinique des maladies observées chez 381 patients référés au Centre de Traitement de l'Immunodéficience de l'Hôpital Général de Montréal, et chez qui la présence d'une IDP a été suspectée. Parmi les 381 patients référés, 196 ont été diagnostiqués avec une IDP. Ce manuscrit est en train d' d'être soumis, et représente la première description d'une cohorte de patients adultes souffrant d'IDPs ainsi que la plus large cohorte de ces mêmes patients au Canada.

To understand why remyelination fails in diseases such as multiple sclerosis (MS), I studied the cells and molecules involved in remyelination. I examined the cellular response to cuprizone-induced demyelination in C57B1/6 female mice. In response to the toxin cuprizone, microglia, macrophages, T cells and oligodendrocyte precursor cells (OPCs), accumulated in the corpus callosum. I have identified a novel population of CD11c-expressing microglia with potent antigen presenting capacity, which localized to the demyelinated corpus callosum following cuprizone treatment. A broad panel of chemokines were upregulated as early as 1 week following cuprizone treatment. Administration of one of them, an oligodendrocyte precursor cell growth factor, CXCL1, via adenoviral gene delivery to the CNS, did not affect OPC dynamics in the demyelinated corpus callosum. Insight into cells and molecules produced during demyelination/remyelination will be of use in designing new therapies for MS.

The ontogeny of the immune system is orchestrated by a highly organized cell signaling network that ensures the development of multiple hematopoietic lineages and allows them to transduce information from their environment in order to mount appropriate responses to prevent disease. The phosphotyrosine signaling network has developed in higher organisms and is undeniably central to the immune system; alterations in components of this network, such as protein tyrosine phosphatases (PTP), can lead to immunodeficiency, autoimmune disease, and hematopoietic malignancy. The T cell protein tyrosine phosphatase (TC-PTP; gene name PTPN2) is highly expressed in hematopoietic tissues, and is involved in the development of several hematopoietic lineages. This thesis addresses the role of TC-PTP in immune system development and disease through the study of a TC-PTP knockout mouse model system. While TC-PTP contains a highly conserved catalytic PTP motif and shares high homology with its family member PTP1B, I have found that these two PTPs are complementary yet non-redundant during embryogenesis as well as myelopoiesis and T cell lymphopoiesis, and thus TC-PTP has a unique function in these processes. Next, I demonstrate that TC-PTP deficiency in mice leads to severe subchondral bone resorption and synovitis. These manifestations resemble early arthritis, and support recent genome wide association studies that identify SNPs in the PTPN2 locus. Finally, I identify the cell autonomous defect involved in the block of B cell development in TC-PTP-/- mice. B cells lacking TC-PTP have increased basal levels of apoptosis as well as increased sensitivity to DNA damage; in addition, these cells have defective V(D)J recombination, suggesting that the apoptosis in TC-PTP-/- progenitor B cells may arise from sensitivity to V(D)J recombination at this stage of development. Such observations elicit interest to study TC-PTP in leukemia development, therefore I also describe the analysis of TC-PTP expression levels in human B cell acute lymphoblastic leukemia in order to address these questions. The research presented herein provides valuable information on the role of TC-PTP in immune system development as well as its role in human immune disease. / L'ontogénie du système immunitaire est assurée par un réseau de signalisation complexe qui permet le développement des lignées cellulaire hématopoïétiques, la traduction d'information provenant de l'environnement de la cellule ainsi que la production d'une réponse prévenant tout apparition d'anormalité. Le réseau de phosphorylation protéique des résidues tyrosines, est présent chez les organismes développés et joue un rôle primordiale au niveau du système immunitaire. Les altérations affectant les membres de ce réseau, incluant les protéines tyrosine phosphatases (PTPs), peuvent mener à une déficience immunitaire, des maladies auto-immunes ainsi que des malignités hématopoïétiques. La PTP des cellules T (TC-PTP, nom de gène PTPN2) est une tyrosine phosphatase ubiquitairement exprimée, mais prédominante dans les tissues hématopoïétiques chez lesquels elle assure une fonction primordiale, particulièrement durant leur croissance. Cette thèse adresse le rôle particulier de TC-PTP dans le développement du système immunitaire et ses maladies en utilisant un modèle de souris knock-out (KO) de cette phosphatase. TC-PTP est reconnue pour son homologie avec la protéine tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) et toutes deux possèdent un domaine catalytique similaire qui est conservé chez les PTPs. Malgré ces homologies, j'ai pu démontrer que ces deux PTPs ont des fonctions complémentaires et non redondantes au niveau du développement embryonnaire, de la myélopoïèse et de la lymphopoïèse des cellules T. Ainsi, TC-PTP possède un rôle unique dans les processus précédemment énumérés. Par la suite, j'ai démontré qu'une déficience de TC-PTP chez la souris mène à une résorption osseuse sous-chondrale ainsi qu'une synovite, deux phénotypes ressemblant aux symptômes observés durant les premiers stages de développement de l'arthrite. Ces découvertes supportent de récentes études génomiques associant plusieurs polymorphismes situés dans le locus de PTPN2 à différentes maladies auto-immunes. Finalement, j'ai pu identifier chez la souris TC-PTP-/- le défaut spécifique à la cellule en-soi et non son environnement qui est responsable du blocage observé durant le développement des cellules B. Ces dernières n'exprimant pas TC-PTP ont un niveau basal plus élevé de mort cellulaire ainsi qu'une grande sensibilité au dommage à l'ADN. De plus, ces cellules présentent plusieurs défauts au niveau de leur recombinaison V(D)J. Ainsi, la mort cellulaire observée chez les cellules progénitrices B de la souris TC-PTP-/- pourrait donc être expliquée par une anomalie au niveau de la recombinaison V(D)J durant le développement des lymphocytes. Ces multiples observations liant TC-PTP à la lymphopoïèse des cellules B ont menées à l'étude de l'implication de la protéine dans le développement de la leucémie. Par conséquent, une étude de cette phosphatase chez les patients atteints de la leucémie aïgue lymphoblastique des cellules B ont été entamés et sont adressés dans cette thèse. Le projet de recherche présenté procure d'importantes informations concernant le rôle de TC-PTP dans le développement du système immunitaire ainsi que sa fonction dans les maladies auto-immunes affectant la population.

Majority of anti-cancer drugs have been reported as chromophores that can transfer the energy of absorbed light to neighboring metabolites. This group of drugs has been categorized as conventional photosensitizers (PS); while the tumor therapy modality that combines the use of PS with light to generate toxic reactive oxygen species (ROS) has been termed photodynamic therapy (PDT). Moreover, recent researches and clinical studies have been reported to be currently investigating optimal combinations of PS, light sources and ligands for the efficient treatment of various cancers. On the one hand, clinical advantages of conventional PS such as the achievement of localized effects have been reported during PDT of various cancers, unlike the limited specificity of chemotherapeutic and other anti-cancer drugs. However, a number of unmet needs have also been identified in PDT based on the conventional PS agents, despite of the achieved specificity and clinical results. On the other hand, quantum dot (QD) nanocrystals have received considerable interest as PS in recent years due to improved properties such as strong absorption, durable fluorescence and cumulative yield of ROS. Indeed, the exploitation of QD unique optical properties has been the basis of their examination as PDT agents, in addition to various biological applications. Thus, this thesis addressed the improvement of tumor PDT through the development of multifunctional QD-based conjugates with tumor-specific pattern of internalization and enhanced photosensitization-mediated toxicity. Specifically, the conjugated PS complexes consisted of indium phosphide (InP) or cadmium selenide (CdSe) QDs coupled to either anticancer doxorubicin (Dox) or receptor-targeting ligands such as dopamine (DA) and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). Conjugation was assessed by Electophoretic mobility shift assay (EMSA) and spectroscopic methods, whereas conjugate uptake was examined by confocal microscopy. In addition, the photosensitization-mediated toxicity was evaluated through determination of the conjugate Effective Concentration at half maximum effect (EC50) on melanoma cell lines, using Sulfo-Rhodamine B (SRB) colorimetric assays. Interestingly, QD-based PS conjugates revealed distinctive electrophoretic or spectroscopic profiles, specific uptake pattern as well as ECs50 about four to five or two times more efficient, by comparison to respective free QDs or Dox. Overall, the conjugation of QDs, to molecules that initially were or were not conventional PS, generated anti-cancer complexes that simultaneously combined efficient absorption, receptor-induced endocytosis and photosensitization-mediated toxicity, unlike conventional organic PS 1. Thus, the use of QDs, as either donors or acceptors of fluorescence resonance energy transfer (FRET) 2 within multifunctional PS conjugates, has constituted an excellent approach that would lead to the enhancement of PDT efficacy during the treatment of deep tumors, with an additional advantage of further reduced dosage of PS. / Diverses études ont rapporté nombre d'anticancéreux comme des chromophores capables de transférer l'énergie lumineuse absorbée aux métabolites environnants. Ce groupe de médicaments est classé dans la catégorie des photosensibilisateurs (PS) conventionnels; cependant le type de thérapie combinant l'usage des PS à la lumière en vue de générer des espèces réactives oxygénées (ROS) toxiques est dit thérapie photodynamique (TPD). Par ailleurs, des recherches et études cliniques examinent actuellement les combinaisons optimales des PS, sources lumineuses et ligands, devant traiter de façon efficace divers cancers. D'une part, les avantages cliniques des PS conventionnels tels que des effets thérapeutiques localisés ont été rapportés lors de la TPD de diverses tumeurs malignes, à l'opposé de la spécificité restreinte de la chimiothérapie et d'autres traitements anti-tumoraux. Toutefois, certains besoins thérapeutiques insatisfaits ont été rapportés lors de l'usage des PS conventionnels, nonobstant les résultats cliniques accomplis. D'autre part, les nanocristaux de points quantiques (PQ) ont récemment fait l'objet d'une grande attention en tant que PS grâce à leurs propriétés innovantes telles une forte absorption, une fluorescence durable et un rendement cumulatif en ROS. En effet, l'exploitation des caractéristiques optiques uniques des PQ a été la base de leur récente étude comme agents de TPD, en plus de diverses applications biologiques. Ainsi, la présente thèse a adressé l'amélioration de la TPD des néoplasmes malins à travers le développement des conjugués multifonctionnels à base des PQ possédant un profil d'internalisation spécifique aux cellules cancéreuses et une toxicité induite par photosensibilisation. De façon plus spécifique, les conjugués PS ont été composés de PQ de phosphure d'indium (InP) ou de séléniure de cadmium (CdSe) couplés soit a l'anticancéreux doxorubicine (Dox) ou aux ligands à récepteurs spécifiques tels que la dopamine (DA) ou le factor de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF). La conjugaison fut évaluée par le test de retard sur gel d'électrophorèse (EMSA) et par des méthodes spectroscopiques, tandis que l'internalisation des conjugués fut examinée par microscopie confocale. De façon additionnelle, la toxicité induite par photosensibilisation fut pour sa part évaluée grâce à la détermination de la concentration efficace des conjugués à 50% de leur effet maximal (EC50) sur des lignées cellulaires de mélanome, au moyen des tests colorimétriques à la Sulfo-Rhodamine B (SRB). De façon intéressante, les conjugués PS à base de PQ ont révélé des profiles électrophorétique ou spectroscopique distincts, une internalisation caractéristique ainsi que des ECs50 environ quatre-cinq ou deux fois plus effectives comparativement aux PQs ou Dox libres correspondants. De façon globale, la conjugaison des PQ aux molécules ayant préalablement été ou non des PS conventionnels, a généré des complexes anticancéreux combinant simultanément absorption efficace, endocytose médiée par récepteurs ainsi que toxicité induite par photosensibilisation, à l'opposé des PS organiques conventionnels 1. Ainsi, l'usage des PQ, en tant que donneurs ou receveurs du transfert d'énergie de résonnance fluorescente (FRET) 2 au sein du conjugué multifonctionnel de PS, a constitué une excellente approche qui conduirait à rehausser l'efficacité de la TPD lors du traitement des tumeurs profondes, en plus de l'avantage additionnel d'une réduction considérable en dose de PS.

The hepatitis C virus polymerase NS5b is required for replication of the viral genome, making it an attractive target for antiviral development. The polymerase contains no proof-reading activity and generates viral variants during replication with a high degree of genetic heterogeneity, complicating the development of effective antiviral therapies since resistance mutations are readily selected under drug pressure. A successful treatment regimen will likely require a combination therapy that can suppress the emergence of resistance. Here, we have described the mechanism of action of a novel class of polymerase active site inhibitors, pyrophosphate analogues. We studied interactions between these compounds and NS5b in the presence of the resistance mutations G152E and P156L and have identified interactions leading to resistance. Additionally, we have combined the pyrophosphate analogues with a second class of polymerase active site inhibitors, nucleoside analogue inhibitors (NIs). We found that the combination can interfere with excision, a potential mechanism of resistance to NIs. We have also examined fidelity of the polymerase to better understand its contribution to variability in the viral genome. Our biochemical findings suggest that the efficiency of nucleotide mismatch formation during replication influences the prevalence of resistance mutations within the viral quasispecies population. This is supported by deep-sequencing data from an HCV-infected patient cohort. Based on these findings, we have developed a mathematical model showing that combining inhibitors selecting for resistance mutations generated through difficult-to-form nucleotide mismatches could delay the onset of resistance.We extended this study by performing transient kinetic assays to characterize incorporation of NIs by NS5b and compared this to the efficiency of mismatched nucleotide incorporation. These studies demonstrate that current NIs incorporate more efficiently than mismatched nucleotides. The incorporation efficiency of the guanosine analogue ribavirin was low as compared to other NIs tested and also as compared to G:U and U:G mismatches examined in our fidelity study, suggesting its incorporation during RNA synthesis does not cause error catastrophe. Overall, these studies provide a greater understanding of the mechanism of action of polymerase inhibitors, and of the role of the polymerase in the development of antiviral resistance. / La polymérase NS5b du virus de l'hépatite C est nécessaire pour la réplication du génome viral et représente donc une cible importante pour la découverte et le développement de nouveaux médicaments. La polymérase contient aucune activité de relecture et génère des variantes du virus avec un haut degré d'hétérogénéité génétique lors de sa réplication. Ceci nuit au développement de traitements antiviraux efficaces puisque les mutations de résistance sont facilement sélectionnées sous pression de médicaments. Un traitement efficace exigera probablement une combinaison thérapeutique qui pourrait empêcher la résistance. Ici, nous avons décrit le mécanisme d'action d'une nouvelle classe d'inhibiteurs du site actif de la polymérase, les analogues du pyrophosphate. Nous avons étudié les interactions entre ces inhibiteurs et NS5b, en présence des mutations de résistance G152E et P156L en plus d'identifier des interactions conduisant à la résistance. De plus, nous avons combiné les analogues du pyrophosphate avec une deuxième classe d'inhibiteurs du site actif de la polymérase, les inhibiteurs nucléotidiques (INs). Nous avons constaté que la combinaison peut interférer avec l'excision, un mécanisme potentiel de résistance aux INs. Nous avons également examiné la fidélité de la polymérase pour mieux comprendre sa contribution à la variabilité du génome viral. Nos résultats biochimiques suggèrent que l'efficacité de la formation de décalage lors de la réplication influence la prévalence des mutations de résistance au sein de la population virale quasi-espèces. Ceci est soutenu par les données obtenues suite au séquençage à très haut débit d'une cohorte de patients infectés par le VHC. Basé sur ces résultats, nous avons développé un modèle mathématique démontrant que la combinaison d'inhibiteurs qui sélectionnent des mutations de résistance générées par des mésappariements nucléotidiques difficiles à former pourrait retarder l'apparition de la résistance. Nous avons poursuivi cette étude en caractérisant l'incorporation des INs par NS5b et en comparant cela à l'efficacité de l'incorporation de nucléotides dépareillés. Ces études démontrent que les INs actuelles sont incorporées avec plus d'efficacité que les nucléotides dépareillés. L'efficacité d'incorporation de l'analogue ribavirine était faible par rapport aux autres INs testés et aussi par rapport aux mésappariements G: U et U: G examinés dans notre étude de fidélité. Ceci suggère que l'incorporation de la ribavirine lors de la synthèse d'ARN ne provoque pas d'erreur catastrophique. Globalement, ces études nous mènent à une meilleure compréhension du mécanisme d'action des inhibiteurs de la polymérase NS5b, et du rôle de la polymérase dans le développement de la résistance aux antiviraux.

tRNALys3 is selectively packaged into HIV-1 during viral assembly, and is placed upon the primer binding site (PBS) of the viral genome where it acts as the primer for reverse transcriptase. This Ph.D. project involved studying the factors involved in the regulation of tRNALys packaging, as well as the effect of overexpression of tRNALys3 in the virion.

DNA vaccination is based on in vivo delivery of plasmids encoding an antigen, leading to antigen synthesis and specific immunity. This technology is still in its infancy but has advantages over conventional vaccination, such as the stimulation of all arms of the immune response, i.e., humoral immunity, T-helper (17h) cells and cytotoxic T lymphocytes (CTLs). We studied DNA vaccination against human carcinoembryonic antigen (CEA) in mice. Our hypothesis was that codelivery of cytokine- and CEA-encoding plasmids could regulate responses, and allow polarization of Th responses to either type 1 (Th1) or type 2 (Th2). We found that intramuscular injection of the CEA plasmid alone induced antibodies, Th1 cells and CTLs reactive to CEA. These mice had increased immunity against transplanted syngeneic CEA+ stably transfected tumor cell lines, but always developed lethal tumors. Coinjection of the CEA plasmid with a vector encoding either IL-12 or interferon gamma (IFNgamma) markedly enhanced IgG2a production (IFNgamma-dependent), IFNgamma secretion by spleen cells (a Th1 cytokine) and CTL-mediated tumor cell lysis, in a CEA-specific way. Moreover, resistance to a tumor challenge was greatly improved, such that up to 80% of mice survived tumor free. In contrast, coinjection of CEA and IL-4 genes increased CEA-specific IgG1 levels (IL-4-dependent) and IL-4 secretion by lymphocytes (a Th2 cytokine), but decreased both CTL activity and tumor resistance. Thus, we could readily enhance or polarize immunity. The IL-12 cDNA had the strongest adjuvant effect, which was only observed when it was injected at the same site as the CEA gene. To analyze effector components, we studied IL-12-plasmid-enhanced DNA vaccination in gene knockout mice, lacking either CD3, CD4, CD8. IFNgamma, perforin or Fas ligand (FasL). Only mice expressing all of CD3, CD4, IFNgamma, CD8 and perforin, and inoculated with both the CEA and IL-12 genes, could fully resist a tumor challenge. The Fas/FasL lytic

The CD45 protein tyrosine phosphatase (PTP) is a large transmembrane glycoprotein abundantly expressed on all nucleated cells of the hematopoietic system. CD45 plays an essential role in signal transduction through the antigen receptor in T and B lymphocytes, mainly through the regulation of Src-family tyrosine kinase activity. Previous work has shown that cross-linking CD45 with monoclonal antibodies can induce caspase-independent apoptosis in murine immature T cells. The exact mechanism whereby CD45 cross-linking can lead to cell death, and whether the PTP activity of CD45 is involved in this process have not been determined. In this study, a CD45-deficient T-cell line was transduced with either wild-type or phosphatase-dead CD45 retroviral constructs, to show that the PTP activity of CD45 was totally dispensable for apoptosis triggering after cross-linking of the molecule. Noteworthy, a T-cell line expressing a truncated form of CD45, lacking most of the cytoplasmic domain, could readily be killed by CD45 cross-linking. It was also demonstrated that LPAP, a protein of undefined function interacting specifically with the transmembrane domain of CD45, does not play an essential role in CD45-triggered apoptosis. Taken together, these results suggest that the extracellular and/or transmembrane domains of CD45 are endowed with unique properties in apoptosis signaling. To our knowledge, apoptosis induction is the only function reported to date for CD45 for which PTP activity is not required. Sensitivity towards CD45-mediated cell death had been shown to be modulated during T cell differentiation in the thymus. Hence, a parallel in the susceptibility towards CD45-induced apoptosis was found for the various stages of T and B cell development in primary lymphoid organs. Moreover, it was also demonstrated that mature T-cells from peripheral lymphoid organs readily underwent cell death upon CD45 engagement, whereas peripheral B-cells showed to be resistant to this treatm

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Clinical studies have suggested that the anti-CEA antiserum directed against purified CEA reacts with a variety of constituents. This phenomenon may account for the lack of tumor-specificity seen in the clinical radioimmunoassays in use. / The object of the experiments presented here was to see if anti-CEA antisera could be made more specific to the tumor portion of the CEA molecule. The method of approach was by the use of affinity chromatography. Normal bowel material was coupled to glass beads and used as a matrix though which anti-CEA antisera was recycled. Both a single column with sequential passages and separate columns with successive passages were employed. / The results obtained indicate that the anti-CEA antiserum is indeed heterogeneous. It reacts primarily with normal bowel constituents and contains little, if any, tumor-specific reactivity.