Οι Heat Shock Proteins (Hsps) αποτελούν πολλές διαφορετικές οικογένειες που επάγονται προς απάντηση μιας ευρείας σειράς φυσιολογικών και περιβαλλοντικών ερεθισμάτων. Μια τέτοια πρωτεΐνη, η οποία επάγεται ιδιαίτερα κατά τη διάρκεια της απάντησης σε stress, είναι η Hsp27, με ΜΒ:27kDa, της οποίας η έκφραση φαίνεται να σχετίζεται με αυξημένη επιβίωση των κυττάρων όταν επιδρούν σε αυτά κυτταροτοξικά ερεθίσματα. Έχει φανεί ότι εμποδίζει τον κυτταρικό θάνατο μέσω αλληλεπίδρασης με ποικιλία παραγόντων που προκαλούν απόπτωση. Η Hsp27 είναι μια μοριακή πρωτεΐνη chaperone με ικανότητα να αλληλεπιδρά με μεγάλο αριθμό πρωτεϊνών. Πρόσφατα στοιχεία έχουν δείξει ότι η Hsp27 ρυθμίζει την απόπτωση, χάρη στην ικανότητα που έχει να διαντιδρά με μόρια ¨κλειδιά¨ στο μονοπάτι μεταβίβασης σημάτων της απόπτωσης και ιδιαίτερα, με εκείνα που ενέχονται στην ενεργοποίηση των κασπασών. Οι άλλοι δυο ρόλοι της Hsp27 κατά τη διάρκεια του stress που αποσκοπούν στην κυτταροπροστασία, είναι αφενός να αλληλεπιδρά και να σταθεροποιεί τον κυτταροσκελετό, αφετέρου να ρυθμίζει το ενδοκυττάριο επίπεδο των τοξικών ριζών οξυγόνου. Όταν τα κύτταρα βρίσκονται σε stress τα επίπεδα της Hsp27 είναι γενικώς χαμηλά και αυτή υπάρχει κυρίως με τη μορφή μεγάλων ολιγομερών. Κατά τη διάρκεια της απάντησης στο stress έχουμε αύξηση στα επίπεδα έκφρασης της Hsp27, που συνδυάζεται με μια αναδιοργάνωσή της λόγω φωσφορυλίωσης. Η φωσφορυλίωση μπορεί να συμβεί σε τρεις διαφορετικές θέσεις που εντοπίζονται σερίνες (Ser15, Ser78, Ser82). Η φωσφορυλίωση της Hsp27 καταλήγει σε ανακατανομή των μεγάλων ολιγομερών σε μικρότερα σύμπλοκα. ΣΚΟΠΟΣ: Αντικείμενο της μελέτης μας είναι ακριβώς η έκφραση των φωσφορυλιωμένων μορφών της Hsp27 με μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος φυσιολογικών ενηλίκων και οι διαφορές που εμφανίζονται όταν τα κύτταρα βρίσκονται in vitro σε βασικές συνθήκες, σε συνθήκες επίδρασης θερμικού stress και σε συνθήκες επίδρασης του παράγοντα TNF-a. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Εφαρμόστηκε η τεχνική της SDS-PAGE ηλεκτροφόρησης και επακόλουθα της WESTERN BLOTTING για την ανίχνευση των πρωτεϊνών. Τα πρώτα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα της κυτταρικής σειράς λευχαιμικών κυττάρων U937 με και χωρίς τη χορήγηση Doxorubicin.Τα επόμενα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε εκχύλισμα πρωτεϊνών μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος προελεύσεως από ένα τυχαίο δείγμα 6 ενηλίκων ανδρών-γυναικών ηλικίας από 20-30 ετών. Τα τελευταία πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος, το οποίο προερχόταν από ένα τυχαίο δείγμα 7 φυσιολογικών ανδρών-γυναικών ηλικίας 20-30 ετών. Τα κύτταρα αυτά είχαν χωριστεί σε τρεις υποπληθυσμούς ανάλογα με τις συνθήκες που είχαν υποβληθεί: βασικές συνθήκες, συνθήκες επίδρασης θερμικού stress και συνθήκες επίδρασης TNF-a. Ο αρχικός διαχωρισμός των μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος έγινε με Ficoll. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Τα πρώτα πειράματα έγιναν σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα κυττάρων της σειράς U937 τα οποία είχαν δεχθεί την επίδραση TNF-a. Η Western Blotting ανάλυση ανέδειξε την παρουσία φωσφορυλιωμένης Hsp27 για τη θέση Ser78,αλλά όχι για τις θέσεις Ser15 και Ser 82. Όταν όμως η ίδια μελέτη πραγματοποιήθηκε σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα της ίδιας σειράς που είχαν δεχθεί την επίδραση Doxorubicin αναδείχθηκε η παρουσία φωσφορυλιωμένης Hsp27 για τις θέσεις Ser15 και Ser82. Τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα μονοπύρηνων κυττάρων υγιών ενηλίκων, τα οποία δεν είχαν υποστεί απολύτως καμμία επίδραση, ανέδειξαν την παρουσία και των τριών μορφών φωσφορυλιωμένης Hsp27 καθώς και της ολικής μη φωσφορυλιωμένης μορφής σε όλα τα δείγματα. Στα τελευταία πειράματα που έγιναν σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος -που είχαν διαιρεθεί σε τρεις πληθυσμούς ανάλογα με τις συνθήκες που είχαν επιδράσει- ανέδειξαν τα εξής: Η φωσφορυλιωμένη μορφή της Hsp27 για τη θέση Ser78 και τη θέση Ser82 επαγόταν και στους τρεις υποπληθυσμούς κυττάρων, δηλαδή όταν αυτά βρισκόντουσαν υπό βασικές συνθήκες, υπό συνθήκες θερμικού shock και υπό συνθήκες επίδρασης TNF-a. Όσον αφορά τη φωσφορυλιωμένη μορφή της Hsp27 για τη θέση Ser15 διαπιστώθηκε ότι επαγόταν περισσότερο η έκφρασή της σε συνθήκες επίδρασης TNF-a και θερμικού shock από ότι στις βασικές συνθήκες. Η ολική Hsp27, η μη φωσφορυλιωμένη, δεν αναδείχθηκε σε κανέναν από τους τρεις υποπληθυσμούς κυττάρων, σε όσα πειράματα πραγματοποιήθηκαν. ΣΥΖΗΤΗΣΗ: Από τα αποτελέσματα των πρώτων πειραμάτων στα κύτταρα της σειράς U937 προέκυψε η βάσιμη υποψία ότι η επίδραση κάποιου στρεσσογόνου παράγοντα είχε διαφορετική επίδραση στην Hsp27,ανάλογα με το ποιος ήταν αυτός και για πόσο διάστημα επιδρούσε. Επομένως σε διάφορες συνθήκες ανευρίσκονται διαφορετικοί συνδυασμοί της Hsp27, γιατί ακριβώς εξυπηρετούν τις απαιτούμενες διαφορετικές, ενδεχομένως, λειτουργίες αντίστοιχα. Η παρουσία όλων των μορφών της Hsp27 στα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος υγιών ενηλίκων όταν αυτά δεν είχαν υποστεί καμμία εξωγενή επίδραση, οδήγησε στο συμπέρασμα ότι ενδεχομένως όλες αυτές οι μορφές της πρωτεΐνης να βρίσκονται σε μια δυναμική κατάσταση εναλλαγής στα κύτταρα ανάλογα με τις ενδογενείς επιδράσεις που δέχονται ανά πάσα στιγμή. Τέλος ,η παρουσία των φωσφορυλιωμένων μορφών της Hsp27 μόνο για τις θέσεις Ser78 και Ser82 σε βασικές συνθήκες αποτελεί σημαντική ένδειξη ότι σε αυτήν την περίπτωση επάγονται περισσότερο τα μεγάλα ολιγομερή της πρωτεΐνης. Αντίθετα, σε συνθήκες επίδρασης θερμικού shock και TNF-a, επάγονται και τα μικρότερα σύμπλοκα της Hsp27, αφού ανευρίσκεται επιπλέον και η φωσφορυλιωμένη μορφή της και για τη θέση Ser15. / -

Thesis (Ph. D.)--Illinois State University, 1990. / Title from title page screen, viewed November 29, 2005. Dissertation Committee: Arlan Richardson (chair), Marjorie A. Jones, Lynne A. Lucher, Anthony J. Otsuka, Brian J. Wilkinson. Includes bibliographical references (leaves 168-187) and abstract. Also available in print.

Heat shock response (HSR) is an ancient and highly conserved signaling pathway in cells that regulates the expression of heat shock proteins (HSPs) in the presence of thermal and other environmental stresses. HSPs function to prevent the formation of non-specific protein aggregates and to assist proteins in acquiring their native structures. Although HSR has been extensively studied, key aspects of this pathway remain a mystery. In particular, how HSR is activated and regulated by the master transcription factor HSF1 is not well understood. The broad goal of this thesis is to develop a quantitative framework aimed at elucidating the HSF1-mediated activation of HSR in yeast cells. Understanding this process has important implications for development, physiology and disease. Indeed, HSF1 is conserved from yeast to human, has been shown to play an important role in stress resistance, health and disease, and is a therapeutic target for neurodegenerative diseases. Broadly, there are two putative (not mutually exclusive) models for activation in response to heat shock: (1) HSF1 dissociation from chaperone proteins and (2) hyper-phosphorylation and the subsequent activation of HSF1. However the relative contribution of each of these events in the activation process is not characterized. Thus far, there is no direct evidence linking either of these two events to activation, and the relative contribution of each mechanism to the activation process has not been quantitatively characterized. To address these issues, we develop a quantitative model of HSR in yeast cells. We use the model to make a series of quantitative predictions and, in a collaborative effort, experimentally test these predictions in a yeast model of HSR. Critically, we provide the first direct evidence for chaperone dissociation of HSF1 in response to heat shock. Moreover, we find that HSF1 phosphorylation is dispensable for activation of HSR, but is able to modulate its activity. Taken together, our work leads to a model for two “orthogonal” mechanisms regulating HSR in yeast, in which chaperone dissociation acts as an ON/OFF switch, whereas phosphorylation functions to tune the gain of the response. Finally, to complement and further test this quantitative model, we develop a novel microfluidic system to explore in more depth the behavior of individual cells in the presence of heat shock inputs. This includes (1) a microfluidic device with microscale on-chip heaters enabling programmable thermal perturbations and (2) a custom image analysis platform to follow single cells through heat shock time courses. In preliminary single-cell studies, we find a relationship between HSF1 phosphorylation state and cell-to-cell variability in HSR activation level (as measured by a transcriptional reporter). These preliminary results suggest that HSF1 phosphorylation may be generating and tuning noise in the HSR in order to promote phenotypic plasticity and increased survivability of a cell population in the face of stress.

The molecular chaperone process of assisted protein folding, characteristic of members of the Heat Shock Protein 70 kDa (Hsp70) and Heat Shock Protein 40kDa (Hsp40) families, is essential for cytoprotection in stressful cellular conditions. Examples of such conditions are heat shock or invasion by pathogens. The Hsp70/Hsp40 process of assisted protein folding is dependent on ATP (governed by the intrinsic ATPase activity of Hsp70) and the ability of molecular chaperones to recognise and bind non-native protein conformations. Here, we analyse and attempt to characterise the molecular chaperone activity of an inducible, cytoplasmic Hsp70 (TcHsp70) from Trypanosoma cruzi and its interactions with its potential partner Hsp40s, Tcj 1, Tcj2, Tcj3 and Tcj4. A bioinformatic analyses of the primary sequences of the trypanosomal proteins revealed that they all contained the canonical domains that define other members of the Hsp70 and Hsp40 family. Tcj2 and Tcj4 showed deviations from the consensus sequence in their substrate binding regions, which may have implications for their substrate binding specificities. TcHsp70, Tcj 1, Tcj2, Tcj3 and Tcj4 were over-expressed recombinantly as 6xHis-tag fusion proteins in Escherichia coli. His-TcHsp70, Tcjl-His and His-Tcj2 were successfully purified by Nickel-affinity chromatography for functional analyses to assess the molecular chaperone activity of His-TcHsp70 in terms of its ATPase activity and substrate binding ability. The basal ATPase activity of His-TcHsp70 was determined as 40 nmol Pi/min/mg, significantly higher than that reported for other Hsp70s. This basal ATPase activity was stimulated to a maximal level of 60 nmol Pi/min/mg in the presence of His-Tcj2 and a model non-native substrate, reduced carboxymethylated αx-lactalbumin (RCMLA). Using native polyacrylamide gel electrophoresis and Western analysis, His-TcHsp70 was shown to form discrete complexes when in the presence of Tcj 1- His, His-Tcj2 and/or RCMLA. These complexes potentially represent His-TcHsp70 - RCMLA or His-TcHsp70 - Tcj interactions, that may be indicative of chaperone activity. In vivo complementation assays showed that Tcj2, but not Tcj3, was able to overcome the temperature sensitivity of the ydjJ mutant Saccharomyces cerevisiae strain JJ160, suggesting that Tcj2 may be functionally equivalent to the yeast Hsp40 Ydj1.

published_or_final_version / abstract / Biochemistry / Master / Master of Philosophy

published_or_final_version / abstract / Ecology and Biodiversity / Master / Master of Philosophy

published_or_final_version / Surgery / Master / Master of Medical Sciences

No description available.

No description available.

No description available.