Submitted by Verônica Esteves (vevenesteves@gmail.com) on 2017-09-28T19:45:14Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação Ivna Magalhaes.pdf: 932225 bytes, checksum: 07383e11561ba6f20949ba2d3f6b996b (MD5) / Approved for entry into archive by Verônica Esteves (vevenesteves@gmail.com) on 2017-09-28T19:46:42Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação Ivna Magalhaes.pdf: 932225 bytes, checksum: 07383e11561ba6f20949ba2d3f6b996b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-28T19:46:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação Ivna Magalhaes.pdf: 932225 bytes, checksum: 07383e11561ba6f20949ba2d3f6b996b (MD5) Previous issue date: 2010 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Universidade Federal de Juiz de Fora / A infecção pelo herpesvirus humano do tipo 6 (HHV-6) é amplamente distribuída acomentendo em torno de 90% das crianças com até dois anos de idade. Este vírus possui duas variantes distintas: HHV-6A e HHV-6B. O HHV-6A não está associado a qualquer patologia específica. Já o HHV-6B é o agente causador do exantema súbito em crianças, e, assim como o herpesvírus humano tipo 7 (HHV-7), permanece latente nas células do hospedeiro após a infecção primária podendo ser excretado continuamente na saliva. Existem vários métodos de diagnóstico da infecção primária pelo HHV-6, dentre eles, a imunofluorescência indireta (IFI) para a pesquisa de IgG de baixa avidez para o HHV-6, que é considerado o padrão ouro. Porém, são relatados casos de reatividade cruzada entre o HHV-6 e o HHV-7 e esta técnica não permite a diferenciação das variantes A e B do HHV-6. O objetivo do nosso estudo foi a padronização de uma técnica de nested PCR multiplex para a evidenciação e diferenciação das infecções ocasionadas pelo HHV-6A, HHV-6B e HHV-7 e a avaliação de sua utilização no diagnóstico de infecção primária pelo HHV-6 em crianças. Para tanto, foram incluídas no estudo, crianças de até quatro anos de idade apresentando doença exantemática e com diagnóstico de infecção primária pelo HHV-6 obtido através da técnica de IFI para a pesquisa de IgG de baixa avidez. Foram selecionadas 138 amostras de saliva e 125 amostras de soro que foram separadas em grupo casos e grupo controles de acordo com o resultado da técnica de IFI. Através da realização da técnica de PCR, foi observada uma frequência de detecção dos vírus nas amostras de saliva do grupo casos de 4,8% para o HHV-6B, 3,2% para o HHV-6A e 4,8% para o HHV-7, já no grupo controle foi evidenciada uma frequência de 1,3%, 2,6% e 5,3% para a detecção do HHV-6B, HHV-6A e HHV-7, respectivamente. Após a análise das amostras de soro do grupo casos, foi observada uma frequência de 1,7% tanto para o HHV-6A como HHV-7, entretanto, o HHV-6B não pode ser detectado. Já no grupo controle, também não foi possível detectar o DNA do HHV-6B, mas foi encontrada uma frequência de detecção de 1,5% para o HHV-6A e 5,9% para o HHV-7. A avaliação da sensibilidade e acurácia da técnica de PCR demonstrou que esta não é adequada para o diagnóstico de infecção primária pelo HHV-6B, em contraposição a vários estudos publicados na literatura. É importante ressaltar que foi observada uma frequência de 25% na detecção do HHV-7 em amostras de soro com resultado inconclusivo na IFI sugerindo que a técnica de PCR pode ser útil para a evidenciação de infecções ocasionadas pelo HHV-7. Assim, a técnica de PCR não substitui a técnica de IFI para a pesquisa de IgG de baixa avidez como método de diagnóstico de infecção primária pelo HHV-6. / The human herpesvirus 6 (HHV-6) infections are widespread in all populations. Over 90% of children under two years of age are seropositive for HHV-6. This virus has two distinct variants: HHV-6A and HHV-6B. HHV-6 variant A is not associated with any disease. The HHV-6 variant B cause exanthema subitum in young child and like HHV-7, remains latent in host cells after primary infection and is shed in saliva chronically. There are several methods for diagnosing of HHV-6 primary infection, among them, the indirect immunofluorescence assay (IFA) for the detection of low avidity IgG, which is accepted as the gold standard. However, there are reports showing cross-reactivity between HHV-6 and HHV-7 and this technique does not differentiate HHV-6 variants. The aim of our study was to implement a technique of nested multiplex PCR for the diagnosis and differentiation of infections caused by HHV-6A, HHV-6B and HHV-7 and its usefulness in the diagnosis of HHV-6 primary infection in children. In our study, were included children younger than four years old presenting rash and diagnosed with HHV-6 primary infection by the technique of IFI for the detection of low avidity IgG. 138 saliva samples and 125 serum samples were selected. The samples were separated into case group and control group according to the results of the IFA technique. After performing the PCR technique, we observed the frequency of viral DNA detection. In the saliva samples from case group, 4.8% had HHV-6B, 3.2% had HHV-6A and 4.8% had HHV-7, while away in the saliva samples from control group, we observed frequency of 1.3%, 2.6% and 5.3% for the detection of HHV-6B, HHV-6A and HHV-7, respectively. When we analyzed the serum samples from the case group, we found a frequency of 1.7% for HHV-6A and HHV-7, however, HHV-6B could not be detected. In the control group, the HHV-6B DNA was not detected, but we found a frequency of 1.5% for detection of HHV-6A DNA and 5.9% for HHV-7 DNA. The evaluation of sensitivity (4,8%) and accuracy (56%) of the PCR technique were pointing out that this is not adequate for the diagnosis of primary infection by HHV-6B, in contrast to several studies published in the literature. It is interesting to notice that 25% of serum samples with inconclusive results after used IFA, presented HHV-7 DNA, suggesting that the PCR technique can be useful for the diagnosis of infections caused by HHV-7. In conclusion, the PCR technique does not substitute the indirect immunofluorescence assay (IFA) for diagnosis of HHV-6 primary infection.

Análise: Estudos recentes têm sugerido que os herpesvírus podem estar envolvidos na ocorrência e progressão de diferentes formas de doença periodontal. Objetivos: O objetivo do presente estudo foi investigar a presença de herpesvírus HHV-6 em biópsias gengivais de pacientes afetados por periodontite crônica e verificar a variabilidade genética das amostras positivas para HHV-6 (HHV-6 A e HHV-6 B). Como controle, biópsias gengivais de sujeitos periodontalmente saudáveis foram analisadas. Materiais e Métodos: Biópsias gengivais foram colhidas de 60 voluntários: 30 casos afetados por periodontite crônica e 30 casos periodontalmente saudáveis. Cada caso contribuiu com 1 biópsia envolvendo o epitélio e tecido conjuntivo da bolsa periodontal contendo profundidade a 5mm e apresentando sangramento à sondagem após o exame clínico; a outra biópsia controle foi concedida de local com profundidade clínica de sondagem a 3mm não apresentando sangramento. Para extração e purificação do DNA viral foi utilizado o kit da Invitrogen® (Charges Switch®g DNA Mini Tissue kit). O DNA extraído foi amplificado utilizando as técnicas de PCR e nested-PCR. Os produtos amplificados foram seqüenciados utilizando o kit Big Dye Terminator (Applied Biosystems). As seqüencias obtidas foram alinhadas com o auxílio do Programa Sequence Navigator e comparadas com amostras padrão do gene bank. Resultados: Após a análise de 60 amostras, seqüências de DNA de HHV-6 foram detectadas em locais periodontalmente saudáveis 4/30 (13,3 %), e em locais com doença periodontal 2/30 (6,7 %); seis produtos positivos da nested-PCR foram seqüenciados e apresentaram homologia para a variante B. Conclusões: O presente estudo demonstrou que o tecido gengival pode agir como reservatório para HHV-6. Nossos dados sugerem que estudos adicionais sejam realizados a fim de consolidar uma associação entre os subtipos de herpesvírus investigados com a doença periodontal destrutiva. / Analysis: Recent studies have suggested that the herpesvirus may be involved in the occurrence and progression of different forms of periodontal disease. Objectives: The purpose of this study was to investigate the HHV-6 herpesvirus presence in gingival biopsies of patients affected by chronic periodontitis and to ascertain the positive samples genetic variability for HHV-6 (HHV-6A and HHV-6B). As a control, biopsies of gingival periodontally healthy subjects were examined. Materials and Methods: gingival biopsies were taken from 60 volunteers: 30 cases affected by chronic periodontitis and 30 cases periodontally healthy. Each case contributed with 1 biopsy involving the epithelium and connective tissue of periodontal pocket depth containing 5mm and stating the bleeding on probing after the clinical examination; the other control biopsy was granted from local with clinical survey depth of 3mm showed no bleeding. For extraction and purification of viral DNA was used the Invitrogen® kit (Charges Switch ® g Mini Tissue DNA kit). The extracted DNA was amplified using the techniques of PCR and nested-PCR. The amplified products were sequenced using the Big Dye Terminator kit (Applied Biosystems). The sequences obtained were aligned with the aid of the Sequence Navigator Program and compared with standard samples of gene bank. Results: After the analysis of 60 samples, DNA sequences of HHV-6 were found in places periodontally healthy 4/30 (13,3%), and in places with periodontal disease 2/30 (6,7%); six positive products of nested-PCR were sequenced and showed homology for variant B. Conclusions: This study has demonstrated that the gingival tissue may act as a reservoir for HHV-6. Our data suggest that additional studies must be conducted to consolidate an association between subtypes of herpesvirus investigated and the destructive periodontal disease.

Análise: Estudos recentes têm sugerido que os herpesvírus podem estar envolvidos na ocorrência e progressão de diferentes formas de doença periodontal. Objetivos: O objetivo do presente estudo foi investigar a presença de herpesvírus HHV-6 em biópsias gengivais de pacientes afetados por periodontite crônica e verificar a variabilidade genética das amostras positivas para HHV-6 (HHV-6 A e HHV-6 B). Como controle, biópsias gengivais de sujeitos periodontalmente saudáveis foram analisadas. Materiais e Métodos: Biópsias gengivais foram colhidas de 60 voluntários: 30 casos afetados por periodontite crônica e 30 casos periodontalmente saudáveis. Cada caso contribuiu com 1 biópsia envolvendo o epitélio e tecido conjuntivo da bolsa periodontal contendo profundidade a 5mm e apresentando sangramento à sondagem após o exame clínico; a outra biópsia controle foi concedida de local com profundidade clínica de sondagem a 3mm não apresentando sangramento. Para extração e purificação do DNA viral foi utilizado o kit da Invitrogen® (Charges Switch®g DNA Mini Tissue kit). O DNA extraído foi amplificado utilizando as técnicas de PCR e nested-PCR. Os produtos amplificados foram seqüenciados utilizando o kit Big Dye Terminator (Applied Biosystems). As seqüencias obtidas foram alinhadas com o auxílio do Programa Sequence Navigator e comparadas com amostras padrão do gene bank. Resultados: Após a análise de 60 amostras, seqüências de DNA de HHV-6 foram detectadas em locais periodontalmente saudáveis 4/30 (13,3 %), e em locais com doença periodontal 2/30 (6,7 %); seis produtos positivos da nested-PCR foram seqüenciados e apresentaram homologia para a variante B. Conclusões: O presente estudo demonstrou que o tecido gengival pode agir como reservatório para HHV-6. Nossos dados sugerem que estudos adicionais sejam realizados a fim de consolidar uma associação entre os subtipos de herpesvírus investigados com a doença periodontal destrutiva. / Analysis: Recent studies have suggested that the herpesvirus may be involved in the occurrence and progression of different forms of periodontal disease. Objectives: The purpose of this study was to investigate the HHV-6 herpesvirus presence in gingival biopsies of patients affected by chronic periodontitis and to ascertain the positive samples genetic variability for HHV-6 (HHV-6A and HHV-6B). As a control, biopsies of gingival periodontally healthy subjects were examined. Materials and Methods: gingival biopsies were taken from 60 volunteers: 30 cases affected by chronic periodontitis and 30 cases periodontally healthy. Each case contributed with 1 biopsy involving the epithelium and connective tissue of periodontal pocket depth containing 5mm and stating the bleeding on probing after the clinical examination; the other control biopsy was granted from local with clinical survey depth of 3mm showed no bleeding. For extraction and purification of viral DNA was used the Invitrogen® kit (Charges Switch ® g Mini Tissue DNA kit). The extracted DNA was amplified using the techniques of PCR and nested-PCR. The amplified products were sequenced using the Big Dye Terminator kit (Applied Biosystems). The sequences obtained were aligned with the aid of the Sequence Navigator Program and compared with standard samples of gene bank. Results: After the analysis of 60 samples, DNA sequences of HHV-6 were found in places periodontally healthy 4/30 (13,3%), and in places with periodontal disease 2/30 (6,7%); six positive products of nested-PCR were sequenced and showed homology for variant B. Conclusions: This study has demonstrated that the gingival tissue may act as a reservoir for HHV-6. Our data suggest that additional studies must be conducted to consolidate an association between subtypes of herpesvirus investigated and the destructive periodontal disease.