O presente trabalho avaliou índices reprodutivos e características de desempenho em fêmeas bovinas de corte, infectadas e não infectadas pelo HVB-1, criadas sob manejo extensivo, em uma fazenda na região norte do Estado de São Paulo, Brasil. Animais das raças Gir, Guzerá, Nelore e Caracu foram avaliados no início da estação de monta e a ocorrência de touros e fêmeas reagentes ao HVB-1 pelo teste ELISA foi, respectivamente, 92,5% (37/40) e 54,2% (386/712), sendo o número de touros reagentes maior do que o de fêmeas (p < 0,0001). Foi verificado um aumento na proporção de fêmeas reagentes nas diferentes faixas etárias: 23,2% (32/138) de 2 a 3 anos; 45,2% (57/126) de 3 a 4 anos; 54,6% (59/108) de 4 a 5 anos e 70,0% (238/340) para &#61619; 5 anos (p < 0,0001). O número de matrizes que soroconverteram no período de um ano foi igual a 10,3% (58/561). O HVB-1 não reduziu o índice de prenhez de matrizes reagentes - 80,3% (310/386) e não reagentes - 74,5% (243/326) (p > 0,05) e nem a taxa de parição de matrizes reagentes - 97,7% (300/307) e não reagentes - 93,8% (225/240) (p < 0,05). O índice de prenhez e parição de fêmeas reagentes não diferiu segundo a raça, soroconversão, grupo genético do rebanho Nelore e faixa etária (p > 0,05). O coeficiente de natimortalidade de matrizes reagentes ao HVB-1 - 1,3% (4/300) não diferiu da encontrada para as não reagentes - 2,2% (5/225) (p > 0,05) e não foram observados efeitos de raça, soroconversão, grupo genético do rebanho Nelore e faixa etária (p > 0,05). O HVB-1 não afetou a média de algumas características de desempenho de fêmeas reagentes e não reagentes (p > 0,05), respectivamente, como ganho de peso médio diário durante a estação de monta (459,90 &#61617; 2,82 g e 466,63 &#61617; 2,87 g), condição corporal na entrada da estação de monta (6,89 &#61617; 0,08 e 6,99 &#61617; 0,08), condição corporal na saída da estação de monta (7,73 &#61617; 0,06 e 7,71 &#61617; 0,06) e peso à parição (419,17 &#61617; 3,34 kg e 425,97 &#61617; 3,22 kg). Concluiu-se que matrizes de corte infectadas pelo HVB-1 e não vacinadas, criadas sob condições adequadas de manejo zootécnico, apresentaram bons índices de prenhez, parição e natalidade, independente da raça, grupo genético e faixa etária. / This work evaluated reproductive rates and performance traits in beef cattle females, infected and non infected by BHV-1, bred under extensive management conditions, in a farm in the northern region of São Paulo State, Brazil. Gir, Guzerá, Nelore and Caracu purebred animals were monitorated at the beginning of the breeding season and the occurrence of bulls and females reagent to BHV-1 by ELISA test was, respectively, 92.5% (37/40) and 54.2% (386/712), with positive cases among bulls higher than among females (p < 0.0001). There was an increase in the proportion of reagent females in the different ages analyzed: 23.2% (32/138) from 2 to 3 years old; 45.2% (57/126) from 3 to 4 years old; 54.6% (59/108) from 4 to 5 years old and 70.0% (238/340) above 5 years old (p < 0.0001). The rate of females that seroconverted was 10,3% (58/561). BHV-1 did not interfere in the pregnancy rates of both reagent - 80.3% (310/386) and non-reagent - 74.5% (243/326) females (p > 0.05). It did not reduce the parturition rate of both reagent - 97.7% (300/307) and non-reagent - 93.8% (225/240) females, either (p < 0.05). The pregnancy and parturition rates of reagent females did not differ according to breed, seroconversion, Nelore herd genetic group and age (p > 0.05). Total rate of stillbirths in BHV-1 reagent females - 1.3% (4/300) did not differ from that found in non-reagent females - 2.2%(5/225) (p > 0.05) and did not differ acording to breed, seroconversion, Nelore herd genetic group and age (p > 0.05). BHV-1 did not affect performance traits for reagent and non-reagent females (p > 0.05), respectivelly, to daily weight gain during the breeding season (459.90 &#61617; 2.82 g and 466.63 &#61617; 2.87 g), body condition score at the beginning of the breeding season (6.89 &#61617; 0.08 and 6.99 &#61617; 0.08), body condition score at the end of the breeding season (7.73 &#61617; 0.06 and 7.71 &#61617; 0.06), weight at parturition (419.17 &#61617; 3.34 kg and 425.97 &#61617; 3.22 kg). It was concluded that non-vaccinated beef cattle females infected by BHV-1 and bred under adequate management conditions, presented good pregnancy, parturition and birth rates, no matter the breed, genetic group and age.

A capacidade dos vírus em inibir a resposta imune inata é uma condição que os permite manterem-se na natureza. O vírus parainfluenza 5 (PIV5), por exemplo, expressa a proteína V, a qual é descrita como uma inibidora da sinalização de interferon (IFN), assim antagonizando seu efeito antiviral. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos do bloqueio do receptor de IFN-I no crescimento de herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) in vitro e elucidar as relações entre a replicação viral e a resposta de IFN-I pela célula infectada. Para isso, foi modificada uma linhagem celular de bovinos (CRIB) que expressa de forma permanente a proteína V do PIV5. Esta linhagem celular foi denominada CRIB/V. Foram, então, realizados ensaios de penetração, tamanhos de placas virais e curvas de crescimento usando as amostras de BoHV-1 e BoHV-5 em células CRIB e CRIB/V. A análise com BoHV-1 não mostrou diferenças significativas nas cinéticas de penetração e crescimento. Entretanto os tamanhos de placa foram maiores em CRIB/V do que em CRIB. Para o BoHV-5, a penetração foi um pouco mais rápida em CRIB/V. Mesmo que os títulos finais não tenham sido diferentes nas duas células, o BoHV-5 alcançou títulos mais altos em CRIB/V do que em CRIB em períodos iniciais da curva de crescimento em CRIB/V em comparação a CRIB. Além disso, a média do tamanho de placa para BoHV-5 foi maior em CRIB/V do que nas células CRIB. Diferentemente das observações com BoHV-1, nossos resultados sugerem que o bloqueio do receptor de IFN-I pela proteína V facilitou a penetração, liberação e disseminação célula-célula do BoHV-5 nas células bovinas, suprimindo uma resposta antiviral, pelo menos, durante os estágios iniciais da infecção. / The ability of viruses to inhibit innate immune responses dictates a possibility to maintain in nature. For instance, Parainfluenza virus 5 (PIV5) expresses the V protein, which is described to inhibit type I interferon (IFN-I) signaling , then, antagonizing its antiviral effects. The aim of this work was to study the effect of blocking the IFN-I receptor signaling by this V protein on the growth properties of bovine herpesviruses types 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) in vitro. A plasmid expressing the V protein of PIV5 was transfected into CRIB cells. We performed penetration kinetics, measured viral plaque sizes and determined one step growth curves using BoHV-1 and BoHV-5 strains in both CRIB and CRIB/V cells. The analysis on BoHV-1 showed no significant difference in penetration and growth kinetics. However the BoHV-5 viral plaques were bigger in CRIB/V than CRIB. The penetration of BoHV-5 in CRIB/V cells was slightly faster than in CRIB cells. Even though the final titers did not differ in both cells, BoHV-5 reached higher titers in CRIB/V than in CRIB at earlier time points of its growth. Moreover, the mean plaque size caused by BoHV-5 in CRIB/V cells was spectacularly bigger in CRIB/V than in CRIB cells. Unlike the observations with BoHV-1, our results suggest that blocking the signaling via the IFN-I receptor by the V protein facilitated penetration, release and cell-to-cell spread of BoHV-5 in bovine cells, counteracting an antiviral response, at least, during the early stages of infection.

Herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) são importantes patógenos que podem afetar os tratos respiratório e genital e o sistema nervoso central de bovinos. Visando iniciar um estudo sobre a distribuição destes vírus em sêmen de bovinos no Brasil, foi realizada a detecção de BoHV-1 e 5 em amostras de sêmen através de duas reações em cadeia da polimerase do tipo nested (nPCRs) espécie-específicas. Foram testadas 53 amostras de sêmen fresco e 23 amostras de sêmen em palheta coletados de touros de dois estados brasileiros. DNA de BoHV-5 foi detectado em todas as amostras e 34 dessas também foram positivas para BoHV-1. Em cinco amostras de sêmen fresco e em 13 amostras de sêmen em palheta foi possível isolar BoHV-1 e/ou BoHV-5 infeccioso. Demonstramos, assim, que ambos os tipos virais foram detectados em amostras de sêmen de bovinos brasileiros, destacando a importância de se monitorar a presença desses agentes em sêmen de touros, para reduzir o risco de transmissão dessas viroses. Além disso, com o objetivo de contribuir com o controle destas infecções no território brasileiro, nesse estudo também se propôs a construção de um vírus recombinante com deleção do gene UL49.5, que codifica uma proteína de evasão imune, a partir de uma amostra de BoHV-5 gE-, gI- e US9-. Para isso, foi construído um cassete de deleção contendo o gene UL49.5 mutado que foi co-transfectado com DNA viral em células eucarióticas de bovinos. Até o momento não foi possível isolar vírus recombinantes, entretanto, vários parâmetros de transfecção foram aqui otimizados, o que facilitará a futura obtenção deste recombinante. / Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) are important pathogens of the respiratory and genital tract of cattle and may also affect the central nervous system. Aiming begin the study of the distribution of these viruses in semen of Brazilian bulls, it was performed here the detection of BoHV-1 and 5 in semen samples by two species-specific nested polymerase chain reactions (nPCRs). Fifty three fresh semen samples and 23 frozen semen samples from two Brazilian states were tested. DNA of BoHV-5 was detected in all samples and 34 of these were positive for BoHV-1 as well. In addition, in 5 fresh semen samples and 13 frozen semen samples infectious BoHV-1 and /or BoHV-5 was isolated. Thus, we demonstrated that both viruses are detected in Brazilian semen samples, highlighting the importance of search for these agents in bull semen to reduce the risk of transmitting these viruses. Moreover, in order to contribute with control of these infections in Brazilian territory, this study also aims to make a recombinant virus with a deletion in the UL49.5 gene, which codes for an immune evasion protein, in a BoHV-5 gE-, gI- and US9- sample. To achieve this, a deletion cassette with a mutated UL49.5 gene was built and co-transfected with viral DNA in eukaryotic bovine cells. Hitherto no recombinant virus was isolated; however, many transfection parameters were optimized, favoring the achievement of the recombinant.

Infecções pelos herpesvírus bovinos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) têm sido sistematicamente detectadas em rebanhos bovinos brasileiros. Entretanto, por causa da alta similaridade antigênica entre estes dois vírus e a falta de testes sorológicos específicos, a prevalência de cada um deles é atualmente desconhecida. Com o objetivo de detectar e diferenciar infecções latentes causadas por BoHV-1 e/ou BoHV-5, gânglios trigêmeos de 200 bovinos foram coletados e analisados para a presença de DNA viral. As amostras foram coletadas em um frigorífico localizado no município de Capão do Leão, Rio Grande do Sul. Uma PCR semi quantitativa foi desenvolvida, otimizada e utilizada para detectar o DNA viral em gânglios. Para diferenciar entre infecções por BoHV-1 e BoHV-5, duas nested PCR tipo-específicas foram desenvolvidas e utilizadas. Além disto, as amostras de soros obtidas foram submetidas a testes de neutralização viral (VN) para detecção de anticorpos. O DNA de BoHV-1 e/ou BoHV-5 foi detectado em 87% dos animais. Os resultados das nested PCRs revelaram que 82,8% dos animais positivos estavam latentemente infectados com BoHV-1 e 93,1%, com BoHV-5. Além disto, foi detectada uma alta proporção de animais co-infectados com os dois vírus (75,9 %). Por outro lado, os resultados das VN mostraram que somente 49,5% dos animais apresentaram anticorpos anti-virais. Este é o primeiro estudo que utiliza testes moleculares para detectar infecções latentes por BoHV-1 e/ou BoHV-5 em gânglios de um grande número de animais e mostra uma alta proporção de co-infecções por estes dois vírus em bovinos. / Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) infections have been consistently detected in Brazilian bovine herds. However, mainly because of their high antigenic similarity and the lack of specific serologic tests for both viruses, the prevalence of each of these viruses is currently unknown. Aiming the detection and differentiation of latent infections caused by BoHV-1 and/or BoHV-5, we collected trigeminal ganglia of 200 bovines and analyzed them for the presence of viral DNA. The samples were collected in an abattoir located in Capão do Leão, Rio Grande do Sul. A semi quantitative PCR was developed, optimized and used to detect the viral DNA in ganglia. To differentiate between BoHV-1 and BoHV-5 infections, two type-specific nested PCR were developed and performed. In addition, for the detection of anti-viral antibodies, serum samples were submitted to the virus neutralizing test (VNT). DNA of BoHV-1 and/or BoHV-5 was detected in 87% of the animals. The results of the nested PCRs reveled that 82.8% of the bovines were latently infected with BoHV-1 and 93.1%, with BoHV-5. Moreover, we detected a high proportion of co-infected animals (75.9 %). On the other hand, the results of the VNT indicated that only 49.5% of the animals had anti-viral antibodies. This is the first study that applies molecular tests to detect latent infection by either BoHV-1 and/or BoHV-5 in ganglia of a high number of animals and shows such a high proportion of coinfections of these two viruses in bovines.

O presente estudo foi conduzido com o objetivo de determinar se a sensibilidade do teste de Soroneutralização (SN) seria afetada quando utilizados distintos subtipos de herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5). Dessa forma, soros de bovinos, coletados randomicamente (n= 287) foram testados por SN frente a três amostras de BoHV-1 (BoHV-1.1: EVI123/98 e Los Angeles (LA); BoHV-1.2a: SV265/96) e três amostras de BoHV-5 (BoHV-5a: EVI88/95; BoHV-5b: A663 e BoHV-5c: ISO 97/95), utilizando um período de incubação soro-vírus de 24 horas. A sensibilidade da SN variou significativamente dependendo da amostra viral utilizada. Esta variação foi de 77% (80/104 soros positivos) até 91% (95/104) com as amostras ISO 97/95 e LA, respectivamente, quando cada vírus foi considerado individualmente. A sensibilidade máxima (104/104) foi obtida quando os resultados positivos de uma combinação particular de quatro vírus (LA + EVI123 + SV265 + A663), algumas combinações de cinco vírus, ou ainda, todos os seis vírus foram adicionados. Estes resultados evidenciaram que quando a SN é realizada frente a uma única amostra viral, a sensibilidade pode variar significativamente, podendo comprometer programas de controle e erradicação das infecções por estes agentes. Além disso, a realização de SN frente a diferentes isolados virais mostrou aumentar significativamente a sensibilidade do teste. Com isso, a caracterização de novos isolados de campo pode favorecer futuras avaliações de diferentes subtipos de BoHV-1 e BoHV-5 e contribuir com a escolha de amostra e/ou combinação de amostras mais sensíveis. Deste modo, buscou-se caracterizar isolados de campo de BoHV-1 e BoHV-5 com base na análise molecular da região carboxi-terminal do gene que codifica a glicoproteína C (gC) e na análise com enzima de restrição (REA) do genoma viral. Para tanto, a multiplicação de 24 isolados da América do Sul foi realizada em células CRIB para posterior extração do DNA viral, PCR e sequenciamento. As seqüências foram alinhadas utilizando o programa ClustalX2 para uma inferência filogenética pelo método de Neighbor-Joining (Mega 4.0), Kimura 2-parâmetros. O alinhamento das seqüências de nucleotídeos revelou níveis de identidade variando de 70 a 99,6% entre os isolados de BoHV-1; de 66,9 a 100% entre os isolados de BoHV-5 e de 62,9 a 92,8% entre os isolados BoHV-1 e BoHV-5. A árvore filogenética mostrou o agrupamento dos vírus de acordo com o tipo (BoHV-1 e BoHV-5) e subtipo de BoHV-1 (BoHV-1.1 e BoHV-1.2). No entanto, essa técnica não permitiu a diferenciação dos isolados em diferentes subtipos de BoHV-5. Do mesmo modo, a análise por restrição enzimática não proporcionou uma clara diferenciação dos isolados em subtipos devido à presença de variações nos padrões de restrição. Somente um isolado (ISO 94/232) pode ser diferenciado como subtipo 5a. Todavia, este estudo mostrou que a análise filogenética utilizada representa uma potencial ferramenta para a diferenciação e classificação dos vírus em BoHV-1.1, BoHV-1.2 e BoHV-5. No entanto, ambas as técnicas podem ser empregadas, de maneira complementar, quando maiores informações sobre estes vírus forem requeridas. Além disso, com o presente estudo, foi possível expandir o número de amostras caracterizadas, fornecendo subsídios para estudos futuros. / This study was carried out to determine whether the sensitivity of serum neutralization (SN) tests would be affected by the use of distinct subtypes of bovine herpesvirus 1 (BoHV- 1) and 5 (BoHV-5) as test challenge viruses. Bovine sera collected from a randomized sample (n = 287) were tested in a 24 hour incubation SN against three type 1 viruses (BoHV-1.1 strains „„Los Angeles‟‟ (LA) and „„EVI 123‟‟; BoHV-1.2a strain „„SV 265‟‟) and three type 5 viruses (BoHV-5a strain „„EVI 88‟‟; BoHV-5b strain „„A 663‟‟ and BoHV-5c „„ISO 97‟‟). SN sensitivity varied greatly depending on the challenge virus used in the test, particularly when results against each virus were considered individually, where it ranged from 77% (detecting 80 out of 104 antibody-positive sera) to 91% (95/104) with ISO 97/95 and LA strain, respectively. Maximum sensitivity (104/104) was achieved when positive results to a particular combination of four of the challenge viruses (LA + EVI 123 + SV 265 + A 663) or some combinations of five viruses (or all six viruses) were added cumulatively. These results clearly shown that when SN is performed with single test challenge viruses, sensitivity could vary significantly that might compromise control or eradication efforts. Performing SN against a number of different viruses demonstrated to improve significantly the test‟s sensitivity. Thus, news field isolates characterization could aid future evaluations of different BoHV-1 and BoHV-5 subtypes and also provide the better strain and/or strains combination choice. In such case, this study aimed to characterize field isolates of BoHV-1 and BoHV-5 by molecular analyses of glycoprotein C (gC) carboxy-terminal region and viral genome restriction enzymatic analysis (REA). The 24 isolates from South America were propagated in CRIB cells for viral DNA extraction, PCR and sequencing. The sequences were aligned in ClustalX2 to perform a distance–based phylogenetic analysis by Neighbor-Joining method in MEGA 4.0 software under de Kimura 2-parameter. The nucleotide sequence alignments revealed levels of genomic similarity ranging from 70% to 99.6% between BoHV-1 isolates; from 67% to 100% among BoHV-5 isolates and from 63% to 93% between BoHV-1 and BoHV-5 isolates. The phylogenetic tree clustered the viruses according to types (BoHV-1 and BoHV-5) and BoHV-1 subtypes (BoHV-1.1, -1.2). However, this method did not allow clearly differentiated in BoHV-5 subtypes. Likewise, REA did not clear showed differentiation in subtypes due presence variation in restriction pattern. Only one isolate (ISO 94/232) could be differentiated in subtype 5a. The results suggest that the phylogenetic analysis performed could be an important tool for differentiation and classification of such viruses in BoHV-1.1, BoHV-1.2, BoHV-5. However, when adiccional informations were resquested both techniques should be performed. Furthermore, with this work it was possible to expand the number of samples characterized to support future investigation of these viruses.

O presente estudo foi conduzido com o objetivo de determinar se a sensibilidade do teste de Soroneutralização (SN) seria afetada quando utilizados distintos subtipos de herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5). Dessa forma, soros de bovinos, coletados randomicamente (n= 287) foram testados por SN frente a três amostras de BoHV-1 (BoHV-1.1: EVI123/98 e Los Angeles (LA); BoHV-1.2a: SV265/96) e três amostras de BoHV-5 (BoHV-5a: EVI88/95; BoHV-5b: A663 e BoHV-5c: ISO 97/95), utilizando um período de incubação soro-vírus de 24 horas. A sensibilidade da SN variou significativamente dependendo da amostra viral utilizada. Esta variação foi de 77% (80/104 soros positivos) até 91% (95/104) com as amostras ISO 97/95 e LA, respectivamente, quando cada vírus foi considerado individualmente. A sensibilidade máxima (104/104) foi obtida quando os resultados positivos de uma combinação particular de quatro vírus (LA + EVI123 + SV265 + A663), algumas combinações de cinco vírus, ou ainda, todos os seis vírus foram adicionados. Estes resultados evidenciaram que quando a SN é realizada frente a uma única amostra viral, a sensibilidade pode variar significativamente, podendo comprometer programas de controle e erradicação das infecções por estes agentes. Além disso, a realização de SN frente a diferentes isolados virais mostrou aumentar significativamente a sensibilidade do teste. Com isso, a caracterização de novos isolados de campo pode favorecer futuras avaliações de diferentes subtipos de BoHV-1 e BoHV-5 e contribuir com a escolha de amostra e/ou combinação de amostras mais sensíveis. Deste modo, buscou-se caracterizar isolados de campo de BoHV-1 e BoHV-5 com base na análise molecular da região carboxi-terminal do gene que codifica a glicoproteína C (gC) e na análise com enzima de restrição (REA) do genoma viral. Para tanto, a multiplicação de 24 isolados da América do Sul foi realizada em células CRIB para posterior extração do DNA viral, PCR e sequenciamento. As seqüências foram alinhadas utilizando o programa ClustalX2 para uma inferência filogenética pelo método de Neighbor-Joining (Mega 4.0), Kimura 2-parâmetros. O alinhamento das seqüências de nucleotídeos revelou níveis de identidade variando de 70 a 99,6% entre os isolados de BoHV-1; de 66,9 a 100% entre os isolados de BoHV-5 e de 62,9 a 92,8% entre os isolados BoHV-1 e BoHV-5. A árvore filogenética mostrou o agrupamento dos vírus de acordo com o tipo (BoHV-1 e BoHV-5) e subtipo de BoHV-1 (BoHV-1.1 e BoHV-1.2). No entanto, essa técnica não permitiu a diferenciação dos isolados em diferentes subtipos de BoHV-5. Do mesmo modo, a análise por restrição enzimática não proporcionou uma clara diferenciação dos isolados em subtipos devido à presença de variações nos padrões de restrição. Somente um isolado (ISO 94/232) pode ser diferenciado como subtipo 5a. Todavia, este estudo mostrou que a análise filogenética utilizada representa uma potencial ferramenta para a diferenciação e classificação dos vírus em BoHV-1.1, BoHV-1.2 e BoHV-5. No entanto, ambas as técnicas podem ser empregadas, de maneira complementar, quando maiores informações sobre estes vírus forem requeridas. Além disso, com o presente estudo, foi possível expandir o número de amostras caracterizadas, fornecendo subsídios para estudos futuros. / This study was carried out to determine whether the sensitivity of serum neutralization (SN) tests would be affected by the use of distinct subtypes of bovine herpesvirus 1 (BoHV- 1) and 5 (BoHV-5) as test challenge viruses. Bovine sera collected from a randomized sample (n = 287) were tested in a 24 hour incubation SN against three type 1 viruses (BoHV-1.1 strains „„Los Angeles‟‟ (LA) and „„EVI 123‟‟; BoHV-1.2a strain „„SV 265‟‟) and three type 5 viruses (BoHV-5a strain „„EVI 88‟‟; BoHV-5b strain „„A 663‟‟ and BoHV-5c „„ISO 97‟‟). SN sensitivity varied greatly depending on the challenge virus used in the test, particularly when results against each virus were considered individually, where it ranged from 77% (detecting 80 out of 104 antibody-positive sera) to 91% (95/104) with ISO 97/95 and LA strain, respectively. Maximum sensitivity (104/104) was achieved when positive results to a particular combination of four of the challenge viruses (LA + EVI 123 + SV 265 + A 663) or some combinations of five viruses (or all six viruses) were added cumulatively. These results clearly shown that when SN is performed with single test challenge viruses, sensitivity could vary significantly that might compromise control or eradication efforts. Performing SN against a number of different viruses demonstrated to improve significantly the test‟s sensitivity. Thus, news field isolates characterization could aid future evaluations of different BoHV-1 and BoHV-5 subtypes and also provide the better strain and/or strains combination choice. In such case, this study aimed to characterize field isolates of BoHV-1 and BoHV-5 by molecular analyses of glycoprotein C (gC) carboxy-terminal region and viral genome restriction enzymatic analysis (REA). The 24 isolates from South America were propagated in CRIB cells for viral DNA extraction, PCR and sequencing. The sequences were aligned in ClustalX2 to perform a distance–based phylogenetic analysis by Neighbor-Joining method in MEGA 4.0 software under de Kimura 2-parameter. The nucleotide sequence alignments revealed levels of genomic similarity ranging from 70% to 99.6% between BoHV-1 isolates; from 67% to 100% among BoHV-5 isolates and from 63% to 93% between BoHV-1 and BoHV-5 isolates. The phylogenetic tree clustered the viruses according to types (BoHV-1 and BoHV-5) and BoHV-1 subtypes (BoHV-1.1, -1.2). However, this method did not allow clearly differentiated in BoHV-5 subtypes. Likewise, REA did not clear showed differentiation in subtypes due presence variation in restriction pattern. Only one isolate (ISO 94/232) could be differentiated in subtype 5a. The results suggest that the phylogenetic analysis performed could be an important tool for differentiation and classification of such viruses in BoHV-1.1, BoHV-1.2, BoHV-5. However, when adiccional informations were resquested both techniques should be performed. Furthermore, with this work it was possible to expand the number of samples characterized to support future investigation of these viruses.

O presente estudo foi conduzido com o objetivo de determinar se a sensibilidade do teste de Soroneutralização (SN) seria afetada quando utilizados distintos subtipos de herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5). Dessa forma, soros de bovinos, coletados randomicamente (n= 287) foram testados por SN frente a três amostras de BoHV-1 (BoHV-1.1: EVI123/98 e Los Angeles (LA); BoHV-1.2a: SV265/96) e três amostras de BoHV-5 (BoHV-5a: EVI88/95; BoHV-5b: A663 e BoHV-5c: ISO 97/95), utilizando um período de incubação soro-vírus de 24 horas. A sensibilidade da SN variou significativamente dependendo da amostra viral utilizada. Esta variação foi de 77% (80/104 soros positivos) até 91% (95/104) com as amostras ISO 97/95 e LA, respectivamente, quando cada vírus foi considerado individualmente. A sensibilidade máxima (104/104) foi obtida quando os resultados positivos de uma combinação particular de quatro vírus (LA + EVI123 + SV265 + A663), algumas combinações de cinco vírus, ou ainda, todos os seis vírus foram adicionados. Estes resultados evidenciaram que quando a SN é realizada frente a uma única amostra viral, a sensibilidade pode variar significativamente, podendo comprometer programas de controle e erradicação das infecções por estes agentes. Além disso, a realização de SN frente a diferentes isolados virais mostrou aumentar significativamente a sensibilidade do teste. Com isso, a caracterização de novos isolados de campo pode favorecer futuras avaliações de diferentes subtipos de BoHV-1 e BoHV-5 e contribuir com a escolha de amostra e/ou combinação de amostras mais sensíveis. Deste modo, buscou-se caracterizar isolados de campo de BoHV-1 e BoHV-5 com base na análise molecular da região carboxi-terminal do gene que codifica a glicoproteína C (gC) e na análise com enzima de restrição (REA) do genoma viral. Para tanto, a multiplicação de 24 isolados da América do Sul foi realizada em células CRIB para posterior extração do DNA viral, PCR e sequenciamento. As seqüências foram alinhadas utilizando o programa ClustalX2 para uma inferência filogenética pelo método de Neighbor-Joining (Mega 4.0), Kimura 2-parâmetros. O alinhamento das seqüências de nucleotídeos revelou níveis de identidade variando de 70 a 99,6% entre os isolados de BoHV-1; de 66,9 a 100% entre os isolados de BoHV-5 e de 62,9 a 92,8% entre os isolados BoHV-1 e BoHV-5. A árvore filogenética mostrou o agrupamento dos vírus de acordo com o tipo (BoHV-1 e BoHV-5) e subtipo de BoHV-1 (BoHV-1.1 e BoHV-1.2). No entanto, essa técnica não permitiu a diferenciação dos isolados em diferentes subtipos de BoHV-5. Do mesmo modo, a análise por restrição enzimática não proporcionou uma clara diferenciação dos isolados em subtipos devido à presença de variações nos padrões de restrição. Somente um isolado (ISO 94/232) pode ser diferenciado como subtipo 5a. Todavia, este estudo mostrou que a análise filogenética utilizada representa uma potencial ferramenta para a diferenciação e classificação dos vírus em BoHV-1.1, BoHV-1.2 e BoHV-5. No entanto, ambas as técnicas podem ser empregadas, de maneira complementar, quando maiores informações sobre estes vírus forem requeridas. Além disso, com o presente estudo, foi possível expandir o número de amostras caracterizadas, fornecendo subsídios para estudos futuros. / This study was carried out to determine whether the sensitivity of serum neutralization (SN) tests would be affected by the use of distinct subtypes of bovine herpesvirus 1 (BoHV- 1) and 5 (BoHV-5) as test challenge viruses. Bovine sera collected from a randomized sample (n = 287) were tested in a 24 hour incubation SN against three type 1 viruses (BoHV-1.1 strains „„Los Angeles‟‟ (LA) and „„EVI 123‟‟; BoHV-1.2a strain „„SV 265‟‟) and three type 5 viruses (BoHV-5a strain „„EVI 88‟‟; BoHV-5b strain „„A 663‟‟ and BoHV-5c „„ISO 97‟‟). SN sensitivity varied greatly depending on the challenge virus used in the test, particularly when results against each virus were considered individually, where it ranged from 77% (detecting 80 out of 104 antibody-positive sera) to 91% (95/104) with ISO 97/95 and LA strain, respectively. Maximum sensitivity (104/104) was achieved when positive results to a particular combination of four of the challenge viruses (LA + EVI 123 + SV 265 + A 663) or some combinations of five viruses (or all six viruses) were added cumulatively. These results clearly shown that when SN is performed with single test challenge viruses, sensitivity could vary significantly that might compromise control or eradication efforts. Performing SN against a number of different viruses demonstrated to improve significantly the test‟s sensitivity. Thus, news field isolates characterization could aid future evaluations of different BoHV-1 and BoHV-5 subtypes and also provide the better strain and/or strains combination choice. In such case, this study aimed to characterize field isolates of BoHV-1 and BoHV-5 by molecular analyses of glycoprotein C (gC) carboxy-terminal region and viral genome restriction enzymatic analysis (REA). The 24 isolates from South America were propagated in CRIB cells for viral DNA extraction, PCR and sequencing. The sequences were aligned in ClustalX2 to perform a distance–based phylogenetic analysis by Neighbor-Joining method in MEGA 4.0 software under de Kimura 2-parameter. The nucleotide sequence alignments revealed levels of genomic similarity ranging from 70% to 99.6% between BoHV-1 isolates; from 67% to 100% among BoHV-5 isolates and from 63% to 93% between BoHV-1 and BoHV-5 isolates. The phylogenetic tree clustered the viruses according to types (BoHV-1 and BoHV-5) and BoHV-1 subtypes (BoHV-1.1, -1.2). However, this method did not allow clearly differentiated in BoHV-5 subtypes. Likewise, REA did not clear showed differentiation in subtypes due presence variation in restriction pattern. Only one isolate (ISO 94/232) could be differentiated in subtype 5a. The results suggest that the phylogenetic analysis performed could be an important tool for differentiation and classification of such viruses in BoHV-1.1, BoHV-1.2, BoHV-5. However, when adiccional informations were resquested both techniques should be performed. Furthermore, with this work it was possible to expand the number of samples characterized to support future investigation of these viruses.