Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2004Bitstream added on 2014-06-13T20:41:36Z : No. of bitstreams: 1 lara_vm_dr_botfmvz.pdf: 525605 bytes, checksum: 677d688fc01b9f020a8258be406beba7 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O presente trabalho objetivou determinar a freqüência do vírus da imunodeficiência felina, correlacioná-la a dados epidemiológicos, identificar os diferentes sorotipos das amostras positivas e realizar a análise filogenética das mesmas. Para tanto, foram colhidas 519 amostras de sangue total de gatos domésticos oriundos de diferentes cidades do estado de São Paulo submetidas à técnica de PCR-nested para identificação do vírus. Dessas amostras, 81 (15,6%) apresentaram-se positivas ao teste, das quais 45 (55,5%) pertenciam a gatos com sinais clínicos de alguma enfermidade, sendo 21 fêmeas e 24 machos. Vinte e duas amostras (27,2%) foram provenientes de animais aparentemente normais, com duas fêmeas e 20 machos, e outras 14 (17,3%) a gatos sem histórico clínico definido, com três fêmeas e 11 machos. Foram submetidas ao seqüenciamento genético 50 (61,7%) amostras positivas. Entretanto, em somente 32 destas (64%) realizou-se a inferência filogenética. A análise genética foi baseada em um segmento do gene gag de 459 pb. As relações genealógicas foram realizadas através dos métodos da máxima parcimônia, da evolução mínima e de agrupamento de vizinhos. Os resultados obtidos revelaram uma ampla similaridade entre as três árvores construídas e em todas elas, as 32 amostras estudadas foram agrupadas dentro do mesmo sorotipo, que foi o sorotipo B. / The present work aimed to determine the feline immunodeficiency virus frequency, to correlate it to epidemiologic data, to identify different FIV subtypes of positive samples and also to accomplish its phylogenetic analysis. For that, it was collected 519 blood samples of domestic cats from different cities of the São Paulo state, submitting them by PCR-nested for virus identification. Eighty one samples (15.6%) were positive to the test, which 45 (55.5%) of them were from animals with clinical signs of some illness. Those samples, 21 were from female and 24 from male cats. Twenty-two of the positive samples (27.2%) were from healthy cats (2 females and 20 males), and 14 of them (17.3%) from cats without clinical history (3 females and 11 males). Fifty positive samples (61.7%) were submitted to DNA sequencing, but only in 32 of them the phylogenetic inference was done. The genetic analysis was based on a segment of the gag gene with 459pb. The genealogical relationships were established through maximum parcimony, minimum evolution and neighbor-joining methods. The results revealed a wide similarity among the three built trees and, in all of them, the 32 studied samples were allocated inside of the same subtype, that was the subtype B.

A parvovirose suína está mundialmente distribuída tornando-se responsável por expressivas perdas econômicas devido aos problemas reprodutivos. O presente trabalho teve como objetivo realizar a padronização da PCR em tempo real (qPCR) utilizando sonda TaqMan para detecção e quantificação de parvovirus suíno 1 (PPV1) em amostras de soro, baseado na região do gene NS1. A especificidade, sensibilidade, reprodutibilidade e quantificação da qPCR foram avaliadas e a casuística foi comparada com a nested PCR (nPCR). A curva padrão da qPCR apresentou linearidade de 6 x 106 cópias genômicas/mL (gce/mL) a 2 x 103 gce/mL, com um coeficiente de correlação (R2) de 0,98. No teste de especificidade, a qPCR não apresentou valores de Cycle threshold (Ct) nos patógenos do grupo de exclusão (circovirus suíno tipo 2, parvovirus canino, vírus da panleucopenia felina, , Erisipela e Leptospirose). Todas as cepas de PPV1 testadas apresentaram fluorescência, demonstrando uma especificidade de 100%. Comparando as duas técnicas, 11 amostras foram positivas em ambos os testes e a nPCR detectou quatro amostras a mais do que a qPCR. A concordância, sensibilidade e especificidade entre as técnicas foi de 98%, 73% e 100%, respectivamente. Portanto, a nPCR apresentou maior sensibilidade, no entanto, a qPCR poderá ser utilizada no diagnóstico e quantificação de PPV1, podendo auxiliar em estudos de viremia, epidemiologia e monitoramento do vírus nas granjas. No segundo estudo, foi realizada a detecção por PCR de circovírus suíno tipo 2 (PCV2), PPV1, parvovírus suíno tipo 2, torque teno vírus suíno 1 e 2 (TTV1 e TTV2) e hokovirus suíno (PHoV) em pools de órgãos (linfonodos, pulmões, fígado, baço e rim) de leitões apresentando a Sídrome Multissistêmica do Definhamento Suíno (PMWS). Todas as amostras foram PCR positivas para PCV2 e os outros vírus foram detectados em todos os rebanhos, com exceção do TTV1. As amostras também foram positivas na PCR para PPV1 (81,6%), PPV2 (73,7%), TTV1 (5,3%), TTV2 (86,8%) e PHoV (55,3%). Os resultados indicam que leitões com PMWS e infectados com PCV2 apresentaram co-infecções com outras espécies de parvovirus e anelovirus, que podem estar envolvidos na apresentação da PMWS. Devido às poucas informações sobre a variabilidade genética do PHoV, oito fragmentos sobrepostos da região VP1/VP2 de quatro amostras foram amplificados e sequenciados. Na análise filogenética, as amostras brasileiras de PHoV apresentaram-se mais estreitamente relacionadas às amostras européias. O presente trabalho relata a primeira detecção de PPV2 e PHoV em co-infecções com PCV2 e a primeira caracterização genética de amostras de PHoV no Brasil. / Porcine parvovirus 1 (PPV1) has worldwide distribution and causes an important reproductive losses. The present dissertation was performed to develop a real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) using a TaqMan probe based on NS1 gene to detect and quantify PPV1 in serum samples. The specificity, sensitivity, reproducibility and quantitative range of the real time PCR were evaluated and compared with conventional nested PCR (nPCR). The standard curve of real-time PCR was linear ranging from 6 x 106 genome copies equivalent/mL (gce/mL) to 2 x 103 gce/mL with a square of the correlation coefficient (R2 value) of 0.98. No cross-reactivity was detected with closely related parvovirus or with viruses that causes similar symptoms and all PPV1 strains showed fluorescence in the assay. Comparing these techniques, 11 samples were positive in both tests and nPCR detected four additional samples. The concordance, sensitivity and specificity between the techniques were 98%, 73% and 100%, respectively. In conclusion, nPCR showed more sensitivity, however, real-time PCR could be a useful tool for diagnosis and quantification of PPV1 in serum samples and can be used for viremia studies, epidemiology and monitoring PPV1 infection in swine herds. The second study was performed in order to detect porcine circovirus 2 (PCV2), PPV1, porcine parvovirus 2, torque teno virus 1 and 2 (TTV1 and TTV2) and porcine hokovirus (PHoV) in different pooled tissues (lymph nodes, lungs, liver, spleen and kidneys) of piglets displaying Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) by PCR. All the samples were PCR positive for PCV2 and the other viruses were detected in all herds, with the exception of TTV1. The samples were positive for TTV2 (86.8%), PPV1 (81.6%), PPV2 (73.7%), PHoV (55.3%) and TTV1 (5.3%). These results showed that piglets displaying PMWS and infected with PCV2 presented co-infections with other virus, which could be involved in the syndrome. Since there are few data about genetic variability of PHoV, eight overlapping fragments of VP1/VP2 region of PHoV were amplified and. In phylogenetic analysis, Brazilian PHoV sequences were more closely related to European sequences. The results indicate that piglets displaying PMWS are PCV2 infected and can be co-infected with different parvovirus and circovirus species.

A presente dissertação versou sobre o parvovírus suíno (PPV) onde, em um primeiro trabalho foi realizado o diagnóstico do PPV em leitões (saudáveis e refugos) e em fêmeas (de distintas ordens de parto) através de nested-PCR do soro. Os títulos de anticorpos das fêmeas foram determinados por Inibição da Hemaglutinação (HI) e comparados com os resultados da nested-PCR. A nested-PCR obteve resultados positivos em amostras de todas as categorias analisadas: leitões saudáveis (15,7% de animais positivos), leitões refugos (18,2%) e fêmeas (17,8%). Os índices de reprodutoras positivas para as distintas ordens de parto foram de 20,8%, 8,7%, 12,5%, 27,3%, 20,8% e 15,0% para as ordens de parto 1, 2, 3, 4, 5 e>= 6, respectivamente. Através da HI, 84,7% dos soros possuiam anticorpos para PPV. Os títulos nas distintas ordens de parto foram de 2142,7 (8,7), 2403,1 (9,8), 2250,0 (9,9), 2952,2 (10,6), 2600,3 (9,8) e 2154,7 (9,7) para as ordens de parto 1, 2, 3, 4, 5 e>= 6 respectivamente (log2X entre parênteses). Não houve correlação estatisticamente significativa entre os resultados da nested-PCR e os títulos de HI. Ao contrário do que era esperado, fêmeas com altos títulos de anticorpos possuiam DNA do vírus na circulação. No segundo trabalho, foram estudas seqüências da porção VP1/VP2 de PPV retiradas do GenBank, juntamente com cinco amostras seqüenciadas no presente estudo. A análise foi realizada quanto à presença de determinados aminoácidos e através de filogenia. Como resultados, o seqüenciamento revelou que duas das novas amostras (S30 e S31) apresentavam modificações em regiões consideradas importantes para a virulência do PPV. Entre estas, destaca-se a modificação no sitio 586, com a presença do aminoácido Thr. A análise filogenética demonstrou que as seqüências de PPV se dividem em dois grupamentos, porém com apenas um grupamento bem definido. Por último, o relógio molecular revelou que a separação dos dois grupos ocorreu há 2890 anos e a divisão dos sub-grupamentos mais recentes ocorreu nos últimos três séculos. / The present dissertation studied porcine parvovirus (PPV) and the first part describes the diagnosis of PPV in piglets sera (healthy and attrition) and females (with distinct parity orders. through nested-PCR. The antibody titers from females were analized by Hemoaglutination Inhibition and compared with the results from the nested-PCR. The nested-PCR results displayed positive animals in all sampled categories: healthy piglets (15.7% of positive animals), attrition piglets (18.2%) and females (17.8%). The results for the distinct parities orders were 20.8%, 8.7%, 12.5%, 27.3%, 20.8% and 15.0% for the pariy orders 1, 2, 3, 4, 5 and>= 6, respectively. The HI test detected 84.7% of the females positive to PPV. The titers in the distinct orders were 2142.7 (8.7), 2403.1 (9.8), 2250.0 (9.9), 2952.2 (10.6), 2600.3 (9.8) and 2154.7 (9.7) to the parity orders 1, 2, 3, 4, 5 and>= 6 respectively (log2X in parenthesis). No statically correlation was evidenced between the nested-PCR and the HI titers. Curiously, females with high antibody titers displayed the viral DNA in their circulation. In the second part, sequences of the PPV region VP1/VP2 were retrieved from GenBank, together with five samples sequenced in the present study. The analysis was performed by identifying the presence of specific aminoacids and by phylogeny. The sequenced samples displayed the presence of important aminoacids substitutions, including Thr in the 586 site in two samples (S30 and S31). The phylogenetic analysis revealed two clusters among the PPV sequences. However, only one cluster displayed a high definition. The molecular clock displayed that the separation between the two main clusters occurred 2890 years ago, and the separation between the most recent sub-clusters happened in the last 300 years.

A presente dissertação versou sobre o parvovírus suíno (PPV) onde, em um primeiro trabalho foi realizado o diagnóstico do PPV em leitões (saudáveis e refugos) e em fêmeas (de distintas ordens de parto) através de nested-PCR do soro. Os títulos de anticorpos das fêmeas foram determinados por Inibição da Hemaglutinação (HI) e comparados com os resultados da nested-PCR. A nested-PCR obteve resultados positivos em amostras de todas as categorias analisadas: leitões saudáveis (15,7% de animais positivos), leitões refugos (18,2%) e fêmeas (17,8%). Os índices de reprodutoras positivas para as distintas ordens de parto foram de 20,8%, 8,7%, 12,5%, 27,3%, 20,8% e 15,0% para as ordens de parto 1, 2, 3, 4, 5 e>= 6, respectivamente. Através da HI, 84,7% dos soros possuiam anticorpos para PPV. Os títulos nas distintas ordens de parto foram de 2142,7 (8,7), 2403,1 (9,8), 2250,0 (9,9), 2952,2 (10,6), 2600,3 (9,8) e 2154,7 (9,7) para as ordens de parto 1, 2, 3, 4, 5 e>= 6 respectivamente (log2X entre parênteses). Não houve correlação estatisticamente significativa entre os resultados da nested-PCR e os títulos de HI. Ao contrário do que era esperado, fêmeas com altos títulos de anticorpos possuiam DNA do vírus na circulação. No segundo trabalho, foram estudas seqüências da porção VP1/VP2 de PPV retiradas do GenBank, juntamente com cinco amostras seqüenciadas no presente estudo. A análise foi realizada quanto à presença de determinados aminoácidos e através de filogenia. Como resultados, o seqüenciamento revelou que duas das novas amostras (S30 e S31) apresentavam modificações em regiões consideradas importantes para a virulência do PPV. Entre estas, destaca-se a modificação no sitio 586, com a presença do aminoácido Thr. A análise filogenética demonstrou que as seqüências de PPV se dividem em dois grupamentos, porém com apenas um grupamento bem definido. Por último, o relógio molecular revelou que a separação dos dois grupos ocorreu há 2890 anos e a divisão dos sub-grupamentos mais recentes ocorreu nos últimos três séculos. / The present dissertation studied porcine parvovirus (PPV) and the first part describes the diagnosis of PPV in piglets sera (healthy and attrition) and females (with distinct parity orders. through nested-PCR. The antibody titers from females were analized by Hemoaglutination Inhibition and compared with the results from the nested-PCR. The nested-PCR results displayed positive animals in all sampled categories: healthy piglets (15.7% of positive animals), attrition piglets (18.2%) and females (17.8%). The results for the distinct parities orders were 20.8%, 8.7%, 12.5%, 27.3%, 20.8% and 15.0% for the pariy orders 1, 2, 3, 4, 5 and>= 6, respectively. The HI test detected 84.7% of the females positive to PPV. The titers in the distinct orders were 2142.7 (8.7), 2403.1 (9.8), 2250.0 (9.9), 2952.2 (10.6), 2600.3 (9.8) and 2154.7 (9.7) to the parity orders 1, 2, 3, 4, 5 and>= 6 respectively (log2X in parenthesis). No statically correlation was evidenced between the nested-PCR and the HI titers. Curiously, females with high antibody titers displayed the viral DNA in their circulation. In the second part, sequences of the PPV region VP1/VP2 were retrieved from GenBank, together with five samples sequenced in the present study. The analysis was performed by identifying the presence of specific aminoacids and by phylogeny. The sequenced samples displayed the presence of important aminoacids substitutions, including Thr in the 586 site in two samples (S30 and S31). The phylogenetic analysis revealed two clusters among the PPV sequences. However, only one cluster displayed a high definition. The molecular clock displayed that the separation between the two main clusters occurred 2890 years ago, and the separation between the most recent sub-clusters happened in the last 300 years.

A parvovirose suína está mundialmente distribuída tornando-se responsável por expressivas perdas econômicas devido aos problemas reprodutivos. O presente trabalho teve como objetivo realizar a padronização da PCR em tempo real (qPCR) utilizando sonda TaqMan para detecção e quantificação de parvovirus suíno 1 (PPV1) em amostras de soro, baseado na região do gene NS1. A especificidade, sensibilidade, reprodutibilidade e quantificação da qPCR foram avaliadas e a casuística foi comparada com a nested PCR (nPCR). A curva padrão da qPCR apresentou linearidade de 6 x 106 cópias genômicas/mL (gce/mL) a 2 x 103 gce/mL, com um coeficiente de correlação (R2) de 0,98. No teste de especificidade, a qPCR não apresentou valores de Cycle threshold (Ct) nos patógenos do grupo de exclusão (circovirus suíno tipo 2, parvovirus canino, vírus da panleucopenia felina, , Erisipela e Leptospirose). Todas as cepas de PPV1 testadas apresentaram fluorescência, demonstrando uma especificidade de 100%. Comparando as duas técnicas, 11 amostras foram positivas em ambos os testes e a nPCR detectou quatro amostras a mais do que a qPCR. A concordância, sensibilidade e especificidade entre as técnicas foi de 98%, 73% e 100%, respectivamente. Portanto, a nPCR apresentou maior sensibilidade, no entanto, a qPCR poderá ser utilizada no diagnóstico e quantificação de PPV1, podendo auxiliar em estudos de viremia, epidemiologia e monitoramento do vírus nas granjas. No segundo estudo, foi realizada a detecção por PCR de circovírus suíno tipo 2 (PCV2), PPV1, parvovírus suíno tipo 2, torque teno vírus suíno 1 e 2 (TTV1 e TTV2) e hokovirus suíno (PHoV) em pools de órgãos (linfonodos, pulmões, fígado, baço e rim) de leitões apresentando a Sídrome Multissistêmica do Definhamento Suíno (PMWS). Todas as amostras foram PCR positivas para PCV2 e os outros vírus foram detectados em todos os rebanhos, com exceção do TTV1. As amostras também foram positivas na PCR para PPV1 (81,6%), PPV2 (73,7%), TTV1 (5,3%), TTV2 (86,8%) e PHoV (55,3%). Os resultados indicam que leitões com PMWS e infectados com PCV2 apresentaram co-infecções com outras espécies de parvovirus e anelovirus, que podem estar envolvidos na apresentação da PMWS. Devido às poucas informações sobre a variabilidade genética do PHoV, oito fragmentos sobrepostos da região VP1/VP2 de quatro amostras foram amplificados e sequenciados. Na análise filogenética, as amostras brasileiras de PHoV apresentaram-se mais estreitamente relacionadas às amostras européias. O presente trabalho relata a primeira detecção de PPV2 e PHoV em co-infecções com PCV2 e a primeira caracterização genética de amostras de PHoV no Brasil. / Porcine parvovirus 1 (PPV1) has worldwide distribution and causes an important reproductive losses. The present dissertation was performed to develop a real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) using a TaqMan probe based on NS1 gene to detect and quantify PPV1 in serum samples. The specificity, sensitivity, reproducibility and quantitative range of the real time PCR were evaluated and compared with conventional nested PCR (nPCR). The standard curve of real-time PCR was linear ranging from 6 x 106 genome copies equivalent/mL (gce/mL) to 2 x 103 gce/mL with a square of the correlation coefficient (R2 value) of 0.98. No cross-reactivity was detected with closely related parvovirus or with viruses that causes similar symptoms and all PPV1 strains showed fluorescence in the assay. Comparing these techniques, 11 samples were positive in both tests and nPCR detected four additional samples. The concordance, sensitivity and specificity between the techniques were 98%, 73% and 100%, respectively. In conclusion, nPCR showed more sensitivity, however, real-time PCR could be a useful tool for diagnosis and quantification of PPV1 in serum samples and can be used for viremia studies, epidemiology and monitoring PPV1 infection in swine herds. The second study was performed in order to detect porcine circovirus 2 (PCV2), PPV1, porcine parvovirus 2, torque teno virus 1 and 2 (TTV1 and TTV2) and porcine hokovirus (PHoV) in different pooled tissues (lymph nodes, lungs, liver, spleen and kidneys) of piglets displaying Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) by PCR. All the samples were PCR positive for PCV2 and the other viruses were detected in all herds, with the exception of TTV1. The samples were positive for TTV2 (86.8%), PPV1 (81.6%), PPV2 (73.7%), PHoV (55.3%) and TTV1 (5.3%). These results showed that piglets displaying PMWS and infected with PCV2 presented co-infections with other virus, which could be involved in the syndrome. Since there are few data about genetic variability of PHoV, eight overlapping fragments of VP1/VP2 region of PHoV were amplified and. In phylogenetic analysis, Brazilian PHoV sequences were more closely related to European sequences. The results indicate that piglets displaying PMWS are PCV2 infected and can be co-infected with different parvovirus and circovirus species.

A parvovirose suína está mundialmente distribuída tornando-se responsável por expressivas perdas econômicas devido aos problemas reprodutivos. O presente trabalho teve como objetivo realizar a padronização da PCR em tempo real (qPCR) utilizando sonda TaqMan para detecção e quantificação de parvovirus suíno 1 (PPV1) em amostras de soro, baseado na região do gene NS1. A especificidade, sensibilidade, reprodutibilidade e quantificação da qPCR foram avaliadas e a casuística foi comparada com a nested PCR (nPCR). A curva padrão da qPCR apresentou linearidade de 6 x 106 cópias genômicas/mL (gce/mL) a 2 x 103 gce/mL, com um coeficiente de correlação (R2) de 0,98. No teste de especificidade, a qPCR não apresentou valores de Cycle threshold (Ct) nos patógenos do grupo de exclusão (circovirus suíno tipo 2, parvovirus canino, vírus da panleucopenia felina, , Erisipela e Leptospirose). Todas as cepas de PPV1 testadas apresentaram fluorescência, demonstrando uma especificidade de 100%. Comparando as duas técnicas, 11 amostras foram positivas em ambos os testes e a nPCR detectou quatro amostras a mais do que a qPCR. A concordância, sensibilidade e especificidade entre as técnicas foi de 98%, 73% e 100%, respectivamente. Portanto, a nPCR apresentou maior sensibilidade, no entanto, a qPCR poderá ser utilizada no diagnóstico e quantificação de PPV1, podendo auxiliar em estudos de viremia, epidemiologia e monitoramento do vírus nas granjas. No segundo estudo, foi realizada a detecção por PCR de circovírus suíno tipo 2 (PCV2), PPV1, parvovírus suíno tipo 2, torque teno vírus suíno 1 e 2 (TTV1 e TTV2) e hokovirus suíno (PHoV) em pools de órgãos (linfonodos, pulmões, fígado, baço e rim) de leitões apresentando a Sídrome Multissistêmica do Definhamento Suíno (PMWS). Todas as amostras foram PCR positivas para PCV2 e os outros vírus foram detectados em todos os rebanhos, com exceção do TTV1. As amostras também foram positivas na PCR para PPV1 (81,6%), PPV2 (73,7%), TTV1 (5,3%), TTV2 (86,8%) e PHoV (55,3%). Os resultados indicam que leitões com PMWS e infectados com PCV2 apresentaram co-infecções com outras espécies de parvovirus e anelovirus, que podem estar envolvidos na apresentação da PMWS. Devido às poucas informações sobre a variabilidade genética do PHoV, oito fragmentos sobrepostos da região VP1/VP2 de quatro amostras foram amplificados e sequenciados. Na análise filogenética, as amostras brasileiras de PHoV apresentaram-se mais estreitamente relacionadas às amostras européias. O presente trabalho relata a primeira detecção de PPV2 e PHoV em co-infecções com PCV2 e a primeira caracterização genética de amostras de PHoV no Brasil. / Porcine parvovirus 1 (PPV1) has worldwide distribution and causes an important reproductive losses. The present dissertation was performed to develop a real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) using a TaqMan probe based on NS1 gene to detect and quantify PPV1 in serum samples. The specificity, sensitivity, reproducibility and quantitative range of the real time PCR were evaluated and compared with conventional nested PCR (nPCR). The standard curve of real-time PCR was linear ranging from 6 x 106 genome copies equivalent/mL (gce/mL) to 2 x 103 gce/mL with a square of the correlation coefficient (R2 value) of 0.98. No cross-reactivity was detected with closely related parvovirus or with viruses that causes similar symptoms and all PPV1 strains showed fluorescence in the assay. Comparing these techniques, 11 samples were positive in both tests and nPCR detected four additional samples. The concordance, sensitivity and specificity between the techniques were 98%, 73% and 100%, respectively. In conclusion, nPCR showed more sensitivity, however, real-time PCR could be a useful tool for diagnosis and quantification of PPV1 in serum samples and can be used for viremia studies, epidemiology and monitoring PPV1 infection in swine herds. The second study was performed in order to detect porcine circovirus 2 (PCV2), PPV1, porcine parvovirus 2, torque teno virus 1 and 2 (TTV1 and TTV2) and porcine hokovirus (PHoV) in different pooled tissues (lymph nodes, lungs, liver, spleen and kidneys) of piglets displaying Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) by PCR. All the samples were PCR positive for PCV2 and the other viruses were detected in all herds, with the exception of TTV1. The samples were positive for TTV2 (86.8%), PPV1 (81.6%), PPV2 (73.7%), PHoV (55.3%) and TTV1 (5.3%). These results showed that piglets displaying PMWS and infected with PCV2 presented co-infections with other virus, which could be involved in the syndrome. Since there are few data about genetic variability of PHoV, eight overlapping fragments of VP1/VP2 region of PHoV were amplified and. In phylogenetic analysis, Brazilian PHoV sequences were more closely related to European sequences. The results indicate that piglets displaying PMWS are PCV2 infected and can be co-infected with different parvovirus and circovirus species.

A presente dissertação versou sobre o parvovírus suíno (PPV) onde, em um primeiro trabalho foi realizado o diagnóstico do PPV em leitões (saudáveis e refugos) e em fêmeas (de distintas ordens de parto) através de nested-PCR do soro. Os títulos de anticorpos das fêmeas foram determinados por Inibição da Hemaglutinação (HI) e comparados com os resultados da nested-PCR. A nested-PCR obteve resultados positivos em amostras de todas as categorias analisadas: leitões saudáveis (15,7% de animais positivos), leitões refugos (18,2%) e fêmeas (17,8%). Os índices de reprodutoras positivas para as distintas ordens de parto foram de 20,8%, 8,7%, 12,5%, 27,3%, 20,8% e 15,0% para as ordens de parto 1, 2, 3, 4, 5 e>= 6, respectivamente. Através da HI, 84,7% dos soros possuiam anticorpos para PPV. Os títulos nas distintas ordens de parto foram de 2142,7 (8,7), 2403,1 (9,8), 2250,0 (9,9), 2952,2 (10,6), 2600,3 (9,8) e 2154,7 (9,7) para as ordens de parto 1, 2, 3, 4, 5 e>= 6 respectivamente (log2X entre parênteses). Não houve correlação estatisticamente significativa entre os resultados da nested-PCR e os títulos de HI. Ao contrário do que era esperado, fêmeas com altos títulos de anticorpos possuiam DNA do vírus na circulação. No segundo trabalho, foram estudas seqüências da porção VP1/VP2 de PPV retiradas do GenBank, juntamente com cinco amostras seqüenciadas no presente estudo. A análise foi realizada quanto à presença de determinados aminoácidos e através de filogenia. Como resultados, o seqüenciamento revelou que duas das novas amostras (S30 e S31) apresentavam modificações em regiões consideradas importantes para a virulência do PPV. Entre estas, destaca-se a modificação no sitio 586, com a presença do aminoácido Thr. A análise filogenética demonstrou que as seqüências de PPV se dividem em dois grupamentos, porém com apenas um grupamento bem definido. Por último, o relógio molecular revelou que a separação dos dois grupos ocorreu há 2890 anos e a divisão dos sub-grupamentos mais recentes ocorreu nos últimos três séculos. / The present dissertation studied porcine parvovirus (PPV) and the first part describes the diagnosis of PPV in piglets sera (healthy and attrition) and females (with distinct parity orders. through nested-PCR. The antibody titers from females were analized by Hemoaglutination Inhibition and compared with the results from the nested-PCR. The nested-PCR results displayed positive animals in all sampled categories: healthy piglets (15.7% of positive animals), attrition piglets (18.2%) and females (17.8%). The results for the distinct parities orders were 20.8%, 8.7%, 12.5%, 27.3%, 20.8% and 15.0% for the pariy orders 1, 2, 3, 4, 5 and>= 6, respectively. The HI test detected 84.7% of the females positive to PPV. The titers in the distinct orders were 2142.7 (8.7), 2403.1 (9.8), 2250.0 (9.9), 2952.2 (10.6), 2600.3 (9.8) and 2154.7 (9.7) to the parity orders 1, 2, 3, 4, 5 and>= 6 respectively (log2X in parenthesis). No statically correlation was evidenced between the nested-PCR and the HI titers. Curiously, females with high antibody titers displayed the viral DNA in their circulation. In the second part, sequences of the PPV region VP1/VP2 were retrieved from GenBank, together with five samples sequenced in the present study. The analysis was performed by identifying the presence of specific aminoacids and by phylogeny. The sequenced samples displayed the presence of important aminoacids substitutions, including Thr in the 586 site in two samples (S30 and S31). The phylogenetic analysis revealed two clusters among the PPV sequences. However, only one cluster displayed a high definition. The molecular clock displayed that the separation between the two main clusters occurred 2890 years ago, and the separation between the most recent sub-clusters happened in the last 300 years.

Orientador: Antonio Fernandes Pestana de Castro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-13T23:19:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arita_GoncalaMariaMartins_M.pdf: 9310353 bytes, checksum: f2ade0de335e487237939e6bbb772414 (MD5) Previous issue date: 1990 / Resumo: No presente estudo o virus da lingua azul-sorotipo 4 (VLA-S4) adaptado às linhagens celulares BHK-21, clone 13 e VERO apresentou efeito citopático característico entre 72 e 96h pos-inoculação, com títulos que variaram entre 10 'POT. 3.6¿ a 10 'POT. 5.6¿ DICC 50%/ml. A partir do sedimento das células infectadas as partículas virais foram purificadas em ultracentrifugações em gradiente de CsCI, e apresentavam densidade de cerca de 1,38 g/cm 'POT. 3¿. Ao microscópio eletrônico foram visualizadas partículas com forma aproximadamente esférica e diâmetro médio de 54,99 '+ ou ¿' 0,12 nm, correspondentes ao virion e de 49,68 '+ ou ¿' 0,08 nm, ao nucleocapsideo. O perfil eletroforético do ARN do VLA-S4 mostrou a presença de dez segmentos com valores de PM 2,92 x 10 'POT. 6¿ d (segmento 1) e 0,49 X 10 'POT. 6¿ d (segmento 10) e o das proteínas, as sete proteínas estruturais -VP1 a VP7- com PM variando de 103,69 x 10 'POT. 3¿ d (VP1) a 30,24 x 10 'POT. 3¿ d ( VP7 ) . O antígeno solúvel (AS), produzido a partir do sobrenadante de culturas de células VERO infectadas pelo VLA e concentrado por ultrafiltração sequencial em membranas com CNL de 10.000 e 25.000, apresentou em teste de identidade com os antígenos do NADC e comercial (COM), uma única linha de precipitação, nítida e confluente. Na análise do perfil eletroforético dos três antígenos observou-se um padrão muito semelhante, o que sugere que as três preparações antigênicas contém proteínas semelhantes. A avaliação semi-quantitativa deste antígeno em imunodifusão radial simples apresentou uma potência relativa 127 ligeiramente superior à do NADC e igual à do COM, e na titulação em bloco por imunodifusão dupla. titulo de uso 1/2, evidenciando-se que o AS poderia ser utilizado em provas rotineiras de 1DGA. para o diagnóstico soro lógico da LA. O componente protéico do AS, principal responsável pela linha de precipitação em 1DGA, apresentou PM 60,00 x 10 'POT. 3' d, sugerindo tratar-se, provavelmente, da proteína NS1 (P5a) ou da VP5. A imunofluorescência indireta (IF1), executada em células VERO adicionadas de soros e conjugados anti-1gG de bovinos ou de ovinos, apresentou fluorescência intracitoplasmática, com aspecto granular, e em algumas células foi observada apenas na membrana celular. Foram testadas 190 amostras de soros sanguíneos de bovinos e 72 de ovinos, pelas técnicas de IDGA e 1FI. Em IDGA obteve-se um total de 134 amostras positivas e 128 amostras negativas, enquanto que em 1FI observou-se 137 amostras positivas e 125 negativas. A análise estatística destes dados registrou uma alta concordância para os soros de bovinos e para os soros de ovinos, entre as duas técnicas. Em 1FI encontrou-se alta sensibilidade, especificidade e valores preditivos dos resultados positivos e dos resultados negativos, em comparação com a IDGA. o que nos permite afirmar que as duas técnicas podem ser utilizadas na rotina laboratorial como instrumento para uma avaliação real da situação epidemiológica da LA no nosso meio. A 1FI oferece a vantagem adicional da possibilidade de ser utilizada para detecção de antígenos virais em cultivos celulares inoculados pelo VLA / Abstract: In the present study a strain of Bluetongue virus, serotype 4 (BTV-S4), when adapted to BHK 21, clone 13 and to VERO cell lines has shown a distinctive cytophatic effect between 72 h and 96 h after inoculation, with titres ranging from 10 'POT. 3.6¿ to 10 'POT. 3.6¿ DICT 50%/ml. After a high speed centrifugation of the packed infected cells the viral particles were purified by ultracentrifugation using CsCIgradient, showing density around 1.38 g/cm 'POT. 3¿. In the electron microscope, two types of spherical particles were observed one with a mean diameter of 54.99 ' + ou ¿' 0,12 run corresponding to the virion and the other of 49.68 ' + ou ¿' 0,08 nm, corresponding to the nucleocapsid. The electrophoretic profiles of the RNAextracted from BTV-S4 showed ten segments with MW between 2.96 x 10 'POT. 6¿ d (segment 1) to 0.49 X 10 'POT. 6¿ d (aegment 10). With regard to the atructural proteina, the MW a180 varied from 103.69 X 10 'POT. 3¿ d (VP1) to 30.24 x 10 'POT. 3¿ d (VP7). The aoluble antigen (SA) produced from culture supernatanta of BTV-infected VERO cells and concentrated by aequential ultrafiltration with membranes with cut-off values 10.000 and 25.000, when compared with the antigens produced by by the agar gel the NADC and commercially, showed total identity immunodiffusion (AGID) test forming a nitid and confluent precipitation line without any spur. The electrophoretic protein profile of the 3 antigens was quite ainÜlar suggesting an identical antigen preparation. A semiquantitative evaluation of thia antigen by aingle radial immune diffusion test showed a relative potency slightly higher than the NADC and equal to the commercial one. Furthermore checking block titration revealed that routine dilution of this antigen to be used in AG1D for the serological diagnosis of BT should be 1/2. The proteie eomponent of the AS. main responsible for the IDGA reaction, showed a MW around 60.00 x 10 'POT. 3¿ d suggesting that this might be, probably, the NS1 (P5a) protein or the VP5. The indireet immunofluorescent technique (IIFT) carried out with BTVinfected VERO cells using bovine and ovine sera and anti-1gG conjugates showed a granular intracytoplasmatie fluorescenee and in some cells this fluorescence was observed only on cellular membranes. Sera from 190 bovine and 72 ovine were examined by AG1D and 11FT. In the AG1D 134 samples were positive for BTV antibodies and 128 were negative, whereas in the 11FT 137 sera were positive for BTV antibodies and 125 were negative. Statistical analysis of these data showed close agreement between the two techniques, regardless of the kind of sera examined. 1n the 11FT, high sensitivity, specificity and predictable values for positive and negative results were found compared with the 1DGA, which means, that both techniques can routinely be used in epidemiologic evaluation studies of BT in our country. The 11FT offers an additional advantage as it may be used to detect viral antigens in BT-infected cell lines / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Ciências Biológicas

As doenças respiratórias são bastante comuns na avicultura industrial, entre as quais a bronquite infecciosa das galinhas (BIG) é uma doença de importância econômica. A doença é causada pelo vírus da bronquite infecciosa (VBI) e gera grandes perdas em todas as etapas do processo de produção de aves, seja em frangos de corte, reprodutores e/ou poedeiras. Além do quadro respiratório, o VBI pode se apresentar de outras formas clínicas. As diferentes cepas do vírus possuem tropismo diferenciado pelos sistemas digestório, reprodutivo e urinário. Diversos dados recentes de caracterização genética do vírus no país demonstram a ocorrência de um único genótipo variante no Brasil (BR-I), além do genótipo vacinal Massachusetts (Mass). No entanto, pouco se sabe sobre a frequência e distribuição tecidual destas variantes nos plantéis brasileiros. A presente dissertação é composta por dois artigos científicos sobre este tema. O objetivo do primeiro trabalho foi avaliar os genótipos de ocorrência em lotes de comercialização industrial no país. Para isso, foram obtidas amostras de lotes da Região Sul, Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste do país. A caracterização foi realizada a partir do sequenciamento parcial do gene S de 49 amostras que foram comparadas com sequências de referência do GenBank e de isolados de campo do país. Onze amostras (22,4%) foram filogeneticamente similares ao genótipo vacinal Mass e 34 amostras (69,4%) agruparam com o genótipo brasileiro, previamente descrito, denominado BR-I. No entanto, quatro amostras (8,2%) formaram um novo grupo, denominado BR-II. Estes resultados demonstram a maior ocorrência do genótipo variante de campo tipicamente brasileiro. O segundo trabalho teve por objetivo determinar a frequência do VBI em diferentes regiões do país, além de determinar a frequência dos genótipos brasileiros em duas categorias de aves (frangos de corte e matrizes), de diferentes idades e nos diferentes sistemas fisiológicos infectados pelo VBI. Para isso, foram obtidos pools de órgãos de 198 lotes de frangos e 234 lotes de matrizes com sinais clínicos de BIG, das regiões Sul, Centro-Oeste e Nordeste do país. A detecção do VBI foi realizada por real time RT-PCR (qRT-PCR) da região 5’ UTR e a determinação dos genótipos por sequenciamento parcial do gene S1. Os resultados demonstraram frequência similar do VBI nas granjas das diferentes regiões do país, com índice maior em frangos de corte (média de 54%) do que em matrizes (média de 30,8%). O VBI foi detectado em aves de todas as idades, no entanto, o genótipo Mass foi mais frequentemente encontrado em frangos de até quatro semanas de idade, em frangos com idade próxima ao abate (> 4semanas) e matrizes houve o predomínio do genótipo BR. O sistema com maior frequência de detecção do VBI, em matrizes, foi o digestório (40%), com diferença significativa. Em frangos, a frequência de detecção nos sistemas digestório (43,5%) e respiratório (37,7%) não apresentou diferença significativa. Estes resultados demonstram a alta frequência dos genótipos brasileiros nos plantéis, sendo encontrados principalmente nos órgãos do sistema digestivo. / Infectious bronchitis (IB) is one of the most important respiratory diseases in the poultry industry. The agent, infectious bronchitis virus (IBV), generates losses in all stages of the poultry production (broilers, breeders and/or layers). Besides respiratory signs, IBV may present other different clinical forms: digestive, reproductive and urinary. IBV presents also a high genetic diversity among strains in different poultry-producing regions of the world. Recent studies demonstrate a large dissemination of local variant strains in Brazil (genotype BR-I), but the vaccine genotype Massachusetts (Mass) is also frequently found in poultry flocks. The present Masters Dissertation has two scientific articles on this topic. The aim of the first study was to evaluate the genotypes occurring in industrial poultry production flocks in Brazil. Samples of poultry flocks were obtained from different regions (South, Southeast, Midwest and Northeast). Molecular characterization was performed by partial sequencing of the S gene and comparison with reference (obtained in Genbank database) and field isolates sequences. Eleven samples (22.4%) were phylogenetically similar to Mass vaccine genotype and 34 samples (69.4%) grouped with the BR-I genotype. However, four samples (8.2%) originated a new group, denominated BR-II. These results demonstrate a high prevalence of the variant genotype BR-I in Brazil and the emergence of the novel BR-II genotype in the Midwest region. The second study aimed to determine the occurrence of IBV in different regions of the country and to evaluate the viral frequency in two poultry production types of birds (broilers and breeders), in different ages and in different physiological systems. Organs pools were collected from 198 broilers and 234 breeder flocks with IB clinical signs and from the three different Brazilian geographic regions: South, Midwest and Northeast. IBV detection was carried out by real time RT-PCR (qRT-PCR) of the 5' untranslated region and genotyping by partial sequencing of the S1 gene. The results showed similar IBV frequency on farms of different regions of the country with a higher rate in broilers (average 54%) than in breeders (mean 30.8%). IBV was detected in birds of all ages. Mass genotype was more often found in chickens up to four weeks of age, while BR genotypes were more frequent in broilers next to slaughter age and in all ages of breeders. The system with highest frequency of IBV was the digestive (40%) in breeders. In broilers, the frequency of detection in the digestive (43.5%) and respiratory (37.7%) systems showed no significant difference. These results demonstrate the high frequency of the Brazilian genotypes in the flocks, being found mainly in the organs of the digestive system.

Cultivos celulares podem ser utilizados para isolamento viral, caracterização de novas amostras virais e produção de imunobiológicos. Podem ser empregados cultivos celulares primários, secundários ou de linha. Estes últimos podem ser obtidos pela transformação física, química ou biológica de cultivos primários ou secundários. Para verificar a interação entre células transformadas com o Ag T do vírus símio 40 (SV40) e os Lentivírus de Pequenos Ruminantes (SRLV), amostras brasileiras de SRLV foram utilizadas para inoculação em cultivos celulares de membrana sinovial ovina transformados pelo Ag T e comparadas à amostras inoculadas em cultivos não transformados. Inicialmente, as células transformadas pelo Ag T foram caracterizadas e observou-se um aumento na cinética de crescimento e alterações no cariótipo, provavelmente induzidas pela presença do Ag T. Este foi detectado por PCR no núcleo e no citoplasma das células transformadas e sua expressão, confirmada através de RT-PCR. A fim de avaliar a permissividade e a possível seleção de populações virais em células transformadas, dois isolados, um de maedi-visna dos ovinos e um de artrite-encefalite caprina, foram inoculados em células MSO e TMSOpSV1. Através da análise de sequências dos genes gag e env e LTR obtidos por PCR, procurou-se avaliar a variabilidade viral em função do tipo de célula utilizada. Analisando-se as seqüências obtidas pelo método de Maximum Likelihood, embora tenha sido observada variabilidade viral, esta não estava associada ao tipo celular utilizado para inoculação viral.