L-type calcium channels (LTCCs) control crucial physiological processes in cardiomyocytes such as the duration and amplitude of action potentials, excitation-contraction coupling and gene expression, by regulating the entry of Ca2+ into the cells. Cardiac LTCCs consist of one pore-forming α1 subunit and the accessory subunits Cavβ, Cavα2δ and Cavγ. Of these auxiliary subunits, Cavβ is the most important regulator of the channel activity; however, it can also have LTCC-independent cellular regulatory functions. Therefore, changes in the expression of Cavβ can lead not only to a dysregulation of LTCC activity, but also to changes in other cellular functions. Cardiac hypertrophy is one of the most relevant risk factors for congestive heart failure and depends on the activation of calcium-dependent prohypertrophic signaling pathways. However, the role of LTCCs and especially Cavβ in this pathology is controversial and needs to be further elucidated. Of the four Cavβ isoforms, Cavβ2 is the predominant one in cardiomyocytes. Moreover, there are five different splice variants of Cavβ2 (Cavβ2a-e), differing only in the N-terminal region. We reported that Cavβ2b is the predominant variant expressed in the heart. We also revealed that a pool of Cavβ2 is targeted to the nucleus in cardiomyocytes. The expression of the nuclear Cavβ2 decreases during in vitro and in vivo induction of cardiomyocyte hypertrophy and overexpression of a nucleus-targeted Cavβ2 completely abolishes the in vitro induced hypertrophy. Additionally, we demonstrated by shRNA-mediated protein knockdown that downregulation of Cavβ2 enhances the hypertrophy induced by the α1-adrenergic agonist phenylephrine (PE) without involvement of LTCC activity. These results suggest that Cavβ2 can regulate cardiac hypertrophy through LTCC-independent pathways. To further validate the role of the nuclear Cavβ2, we performed quantitative proteome analyses of Cavβ2-deficient neonatal rat cardiomyocytes (NRCs). The results show that downregulation of Cavβ2 influences the expression of various proteins, including a decrease of calpastatin, an inhibitor of the calcium-dependent cysteine protease calpain. Moreover, downregulation of Cavβ2 during cardiomyocyte hypertrophy drastically increases calpain activity as compared to controls after treatment with PE. Finally, the inhibition of calpain by calpeptin abolishes the increase in PE-induced hypertrophy in Cavβ2-deficient cells. These results suggest that nuclear Cavβ2 has Ca2+- and LTCC-independent functions during the development of hypertrophy. Overall, our results indicate a new role for Cavβ2 in antihypertrophic signaling in cardiac hypertrophy. / Durch die Regulation des Calciumeintritts in die Zellen kontrollieren L-Typ-Calciumkanäle (LTCCs) wichtige physiologische Prozesse wie die Dauer und Amplitude von Aktionspotentialen, die elektromechanische Kopplung und die Genexpression in Kardiomyozyten. Kardiale LTCCs bestehen aus einer porenformenden α1 Untereinheit und Hilfsuntereinheiten wie Cavβ, Cavα2δ und Cavγ. Von diesen Hilfsuntereinheiten ist Cavβ der wichtigste Regulator der Kanalfunktion, wobei Cavβ auch LTCC-unabhängige zelluläre und regulatorische Funktionen haben kann. Veränderungen in der Expression dieses Proteins können daher zu einer Fehlregulation der LTCC-Aktivität führen, jedoch auch zu Veränderungen von anderen zellulären Funktionen. Einer der häufigsten Risikofaktoren für kongestive Herzinsuffizienz ist die kardiale Hypertrophie, welche abhängig ist von der Aktivierung von Calcium-abhängigen prohypertrophen Signalwegen. Die Rolle von LTCCs und insbesondere von Cavβ in dieser Erkrankung ist jedoch kontrovers und muss noch weiter erforscht werden. Von den vier Cavβ Splicevarianten ist Cavβ2 die dominierende Form in Kardiomyozyten. Darüber hinaus existieren fünf verschiedene Splicevarianten von Cavβ2 (Cavβ2a-e), die sich jeweils nur in der N-terminalen Region unterscheiden. Wir konnten demonstrieren, dass von diesen Splicevarianten überwiegend Cavβ2b im Herzen exprimiert wird. Außerdem konnten wir zeigen, dass ein Teil von Cavβ2 im Nukleus von Kardiomyozyten zu finden ist. Die Expression von nuklearem Cavβ2 verringert sich während der in vitro und in vivo induzierten kardialen Hypertrophie und außerdem verhindert die Überexpression von im Kern lokalisiertem Cavβ2 die in vitro induzierte Hypertrophie komplett. Zusätzlich konnten wir demonstrieren, dass die Reduktion von Cavβ2 mittels shRNA zu einer Steigerung der Hypertrophie induziert durch die Stimulation mit dem α1-adrenergen Agonisten Phenylephrin (PE) führt, ohne dass die LTCC-Aktivität beteiligt ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Cavβ2 die Entstehung von Hypertrophie durch LTCC-unabhängige Signalwege beeinflussen kann. Um die Rolle von nuklearem Cavβ2 zu bekräftigen, haben wir quantitative Proteomanalysen von Cavβ2 defizienten neonatalen Rattenkardiomyozyten (NRCs) durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Reduktion von Cavβ2 die Expression verschiedener Proteine beeinflusst, zum Beispiel wird Calpastatin, ein Inhibitor der calciumabhängigen Cysteinproteasen Calpain, herunterreguliert. Außerdem wird durch die Cavβ2 Reduktion während der Hypertrophie von Kardiomyozyten die Calpainaktivität verglichen mit den Kontrollen signifikant erhöht. Letztendlich konnten wir zeigen, dass die Inhibierung von Calpain durch Calpeptin die gesteigerte PE-induzierte Hypertrophie in Cavβ2-defizienten Zellen verhindert. Diese Ergebnisse lassen eine Calcium- und LTCC-unabhängige Funktion von nuklearem Cavβ2 während der Entwicklung von Hypertrophie, annehmen. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse auf eine neue Rolle von Cavβ2 in den antihypertrophen Signalwegen in der kardialen Hypertrophie hin.

Herzerkrankungen sind die Haupttodesursache in den westlichen Nationen. Unter den Herzerkrankungen spielt die linksventrikuläre Hypertrophie mit Entwicklung einer Herzinsuffizienz eine tragende Rolle. In der gängigen Praxis ist es schwierig ein durch körperliches Training physiologisch hypertrophiertes Herz von einem pathologisch hypertrophierten Herz zu unterscheiden. Da sich immer mehr Menschen einem intensiven körperlichen Training unterziehen, hat die Differentialdiagnose im klinischen Alltag erhebliche therapeutische Konsequenzen. Noch herrscht Unklarheit darüber, ob eine physiologische Herzhypertrophie per se nicht auch pathologisch ist. In der vorliegenden Arbeit wurden drei experimentelle Mausmodelle der linksventrikulären Hypertrophie miteinander verglichen: 1. Pathologische Herzhypertrophie durch chronisch adrenergen Streß, bedingt durch 15 fache Überexpression des kardialen ß1- Adrenorezeptor 2. Pathologische Herzhypertrophie durch chronische Druckbelastung mittels Aortenkonstriktion (Aortenbanding) 3. Physiologische Herzhypertrophie durch Lauftraining in einem Käfiginternen Laufrad. Wir konnten zeigen, dass es bei beiden Formen der linksventrikulären Hypertrophie einerseits zu einer signifikanten Kardiomyozytenhypertrophie kommt, sich beim Vergleich mit den pathologischen Formen der Herzhypertrophie bei der physiologischen Form aber andererseits keine signifikanten Veränderungen der volumetrischen Parameter zeigen. Bei den pathologischen Formen der Herzhypertrophie kommt es zu einer interstitiellen Fibrose, die durch Erhöhung der Wandsteifigkeit zu einer Einschränkung der diastolischen Relaxation (dp/dtmin) und systolischen Kontraktion (dp/dtmax) des linken Ventrikels führt. Unsere Studie unterstreicht zudem die Hypothese, dass die Hypertrophie des Sportlers einen physiologischen Anpassungsmechanismus an eine chronische oder intermittierende Druckbelastung darstellt, wenn auch die linksventrikuläre Hypertrophie für sich alleine ein wichtiger Prädiktor für kardiale Ereignisse ist. / The aim of this study was to show the relation between physiological and pathological left ventricular hypertrophy. Therefore we used three mouse models of left ventricular hypertrophy. We could show, that physiological left ventricular hypertrophy illustrates an adjustment to the chronical or intermittent exposure, whether left ventricular hypertrophy illustrates an independent predictor on cardiovascular events.

Chronische Aktivierung von b-Adrenorezeptoren (b-ARs) durch Katecholamine ist ein Stimulus für kardiale Hypertrophie und Herzinsuffizienz. Ebenso führt die Expression von b1-ARs oder Gas-Proteinen in genetisch modifizierten Mäusen zu Hypertrophie und Herzinsuffizienz. Allerdings führt die direkte Aktivierung dem Gas nachgeschalteten Komponenten des b-adrenergen Signalwegs wie z.B. die Aktivierung der Adenylylcyclase (AC) oder der Proteinkinase A (PKA) nicht im signifikanten Ausmaß zur Herzhypertrophie. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass zusätzlich zu dem klassischen Signalweg, auch weitere durch Gas-Proteine aktivierte Komponenten in die b-adrenerg vermittelte Hypertrophieentwicklung involviert sind. Interessanterweise wurde vor kurzem ein hypertropher Signalweg beschrieben, der eine direkte Involvierung von Gbg-Untereinheiten bei der Induktion von Herzhypertrophie durch die extrazellulär-regulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2) zeigt: Nach Aktivierung Gaq-gekoppelter Rezeptoren binden Gbg-Untereinheiten an die aktivierte Raf/Mek/Erk Kaskade. Die Bindung der freigesetzten Gbg-Untereinheiten an Erk1/2 führt zu einer Autophosphorylierung von Erk1/2 an Threonin 188 (bzw. Thr208 in Erk1; im folgenden ErkThr188-Phosphorylierung genannt), welche für die Vermittlung kardialer Hypertrophie verantwortlich ist. In dieser Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass auch die Aktivierung von b-ARs in Mäusen sowie von isolierten Kardiomyozyten zur Induktion von ErkThr188-Phosphorylierung führt. Darüberhinaus führte die Überexpression von Erk2 Mutanten (Erk2T188S und Erk2T188A), die nicht an Threonin 188 phosphoryliert werden können, zu einer deutlich reduzierten Hypertrophieantwort von Kardiomyozyten auf Isoproterenol. Auch die kardiale Expression der Erk2T188S Mutante im Mäusen verminderte die Hypertrophieantwort auf eine 2-wöchige Isoproterenol-Behandlung deutlich: Die linksventrikuläre Wanddicke, aber auch interstitielle Fibrose und Herzinsuffizienzmarker wie z.B. BNP waren signifikant reduziert. Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass tatsächlich ein Zusammenspiel von Ga und Gbg-vermittelten Signalen zur Induktion von ErkThr188-Phosphorylierung und damit zur Induktion von b-adrenerg vermittelter Hypertrophie notwendig ist. Während die Hemmung von Gbg-Signalen mit dem C-Terminus der GRK2 oder die Hemmung von Adenylylzyklase eine ErkThr188-Phosphorylierung und eine Hypertrophieantwort nach Isoprenalingabe effektiv reduzierten, führt die alleinige Aktivierung von Adenylylzyklase nicht zu einer Hypertrophieantwort. Diese Ergebnisse könnten bei der Entwicklung neuer möglicher therapeutischen Strategien zur Therapie b-adrenerg induzierter Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz helfen. / b-adrenergic receptors (b-ARs) participate strongly in the development of cardiac hypertrophy and human heart failure. Stimulation of b-adrenergic receptors with catecholamines as well as cardiac overexpression of b1-ARs or of Gas-proteins in transgenic mice induces cardiac hypertrophy. However, direct activation of their downstream targets, such as adenylyl cyclase (AC) or protein kinase A do not promote a significant degree of cardiac hypertrophy. These findings suggest that additional events may occur and that these events require Gas-protein activation. A hypertrophic pathway involving Gaq-protein coupled receptors has recently been described. Upon activation of Gaq-coupled receptors Gbg-subunits are released from Gaq and bind directly to the activated Raf/Mek/Erk cascade. Direct interaction between bg-subunits and activated Erk1/2 leads to an additional autophosphorylation of Erk2 at threonine 188, which mediates cardiac hypertrophy. Murine hearts, as well as isolated cardiomyocytes present an increase in Erk2Thr188-phosphorylation upon b-AR activation. Similarly overexpression of phosphorylation deficient Erk2 mutants (Erk2T188S and Erk2T188A) reduces b-AR mediated cardiomyocyte hypertrophy. Increase in left ventricular wall thickness, fibrosis and up-regulation of natriuretic peptide synthesis, which are physiological features for cardiac hypertrophy, are strongly inhibited in transgenic mice with a cardiac expression of Erk2T188S after two weeks of sustained isoproterenol treatment. It could further be shown in this work that b-AR mediated cardiac hypertrophy requires two distinct pathways initiated by Gs-protein activation: the canonical phosphorylation of Erk1/2 via adenylyl cyclase and the direct interaction of released bg-subunits with activated Erk1/2. Coincidence of both events leads to Erk2Thr188-phosphorylation, which activates then different transcription factors responsible for cardiac hypertrophy. Sequestration of bg-subunits by overexpression of the C-terminus of GRK2 bark-ct and inhibition of adenylyl cyclase efficiently reduced the hypertrophic response to isoproterenol, whereas direct activation of AC by forskolin failed to induce Erk2Thr188-phosphorylation and cardiomyocyte hypertrophy. These findings may help to develop new therapeutic strategies for the prevention of cardiac hypertrophy and maladaptive remodeling of the heart.

Universiẗat, Diss., 2007--Giessen.

Die extrazellulär Signal-regulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2) spielen eine zentrale Rolle bei der Vermittlung kardialer Hypertrophie und dem Zellüberleben. Hypertrophe Stimuli aktivieren ERK1/2, triggern deren Dimerisierung und in der Folge die ERK188-Autophosphorylierung. Diese neu entdeckte Autophosphorylierung ist eine Voraussetzung für den nukleären Import von ERK1/2 und führt zum Entstehen pathologischer kardialer Hypertrophie. Da das Dimer Interface von ERK eine mögliche Zielstruktur darstellt, um selektiv die nukleären Signalwege von ERK zu unterbrechen, wurde untersucht, ob man mit Hemmung der ERK-Dimerisierung eine therapeutische Möglichkeit hat, um pathologische kardiale Hypertrophie zu verhindern. Dazu wurden verschiedene ERK2 Mutanten und Peptide generiert, um die ERK-Dimerisierung zu verhindern. Die Effekte dieser Konstrukte auf die ERK-Dimerisierung und den Kernimport wurden in verschiedenen Zelltypen mittels Fluoreszenzmikroskopie, Co-Immunopräzipitationen und Duolink proximity ligation assays getestet. Es konnte gezeigt werden, dass die Peptide effektiv die ERK-ERK Interaktion nach Stimulation mit Phenylephrin und/oder Carbachol verhindern. Zusätzlich reduzierten die Peptide ERKT188-Phosphorylierung und in der Folge den ERK-Import in den Nukleus und Kardiomyozytenhypertrophie. Normale ERK-Aktivierung wurde jedoch durch die Peptide nicht verhindert. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass das ERK-Dimer Interface eine wertvolle Zielstruktur ist, mit dem man nukleäre ERK1/2 Signalwege selektiv unterbrechen und damit effektiv Kardiomyozytenwachstum reduzieren kann, ohne gleichzeitig das Zellüberleben zu gefährden. / The extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) have a central role in cardiac hypertrophy and cell survival. Hypertrophic stimuli activate ERK1/2, trigger ERK dimerization and subsequently ERKT188-autophosphorylation. This newly discovered autophosphorylation is a prerequisite for nuclear ERK1/2 translocation and leads to the development of pathological cardiac hypertrophy. As the ERK dimer interface is a potential target to selectively interfere with nuclear ERK1/2 signaling, we investigated whether the interference with ERK dimerization may serve as a therapeutic strategy to prevent pathological cardiac hypertrophy. For this, we generated ERK2 mutants and peptide constructs that interfere with ERK dimerization. These constructs were evaluated in various cell types by their effects on nuclear ERK translocation and dimerization by fluorescence microcopy, co-immunoprecipitation and Duolink proximity ligation assays. We showed that the peptides indeed prevented ERK-ERK interaction in response to phenylephrine and/or carbachol stimulation. In addition, the peptides prevented ERKT188-phosphorylation and interfered with all ERK1/2 effects that are associated with ERKT188-phosphorylation e.g. nuclear ERK translocation and cardiomyocyte hypertrophy. Interestingly, the peptide did not inhibit the general activation of ERK1/2. These data indicate that the ERK dimer interface is a valuable target for selective inhibition of nuclear ERK1/2 signaling, that is able to effectively attenuate ERK1/2 mediated cardiomyocyte growth but without impairing cell survival.

Die Mitogen-aktivierten Proteinkinasen ERK1/2 (extrazellulär Signal-regulierte Kinase 1 und 2) sind die Effektorkinasen der Raf/MEK/ERK-Kaskade und verknüpfen externe Stimuli mit der intrazellulä-ren Antwort, wodurch sie wichtige Schlüsselmoleküle der zellulären Signaltransduktion darstellen. Zahlreiche Studien belegen die Beteiligung von ERK1/2 an der Entstehung pathologischer kardialer Hypertrophie. Genauso ist bekannt, dass ERK1/2 anti-apoptotische, kardioprotektive Eigenschaften besitzen. So führte, wie in dieser Arbeit gezeigt, eine Hemmung der katalytischen ERK1/2-Aktivität durch den MEK-Inhibitor PD98059 zu einer signifikanten Reduktion der hypertrophen Antwort von Kardiomy-ozyten auf den Stimulus Phenylephrin. Dies war allerdings mit einem Anstieg der Apoptoserate in diesen Zellen verbunden, wodurch sich eine Hemmung der totalen ERK-Aktivität als nicht praktika-bel für die Behandlung pathologischer kardialer Hypertrophie herauskristallisierte. In früheren Un-tersuchungen wurde eine Autophosphorylierung von ERK an Threonin 188 (murines ERK2) entdeckt und als Trigger für ERK1/2-vermitteltes hypertrophes Wachstum identifiziert. Diese Autophospho-rylierung steuert die nukleäre Lokalisation von ERK1/2 und ermöglicht so die Aktivierung nukleärer ERK-Zielproteine sowie hypertrophes Wachstum. Eine Interferenz mit der ERKThr188-Phosphorylierung konnte schon in vitro und in vivo erfolgreich einer pathologischen Hypertrophie entgegenwirken, ohne Einfluss auf physiologisches Herzwachstum oder die zytosolischen, anti-apoptotischen Effekte von ERK1/2 zu nehmen. Einen initialen Schritt für das Zustandekommen dieser Autophosphorylierung an Threonin 188 stellt dabei die Dimerisierung von ERK dar. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die Inhibition der ERK-Dimerisierung im Hinblick auf die Behand-lung ERKThr188-vermittelter pathologischer Hypertrophie untersucht. Dabei sollte die endogene ERK-Dimerisierung mithilfe eines selbst generierten Peptids unterbunden werden. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen zu einer dimerisierungsdefizienten ERK2-Mutante (ERK2-Δ4) konnte das Peptid in vitro und in vivo erfolgreich pathologisch hypertrophes Herzwachstum mindern. Dabei führte es sogar zu einem Rückgang des apoptotischen Zelltodes, ausgelöst durch eine Aortenligation, füh-ren. Es zeigte sich, dass das Peptid die nukleäre Translokation von ERK2 verhindert und dadurch nukleäre ERK-Substrate geringer aktiviert werden. Da eine Dysregulation in der Raf/MEK/ERK-Kaskade auch die Entstehung von Tumoren begünstigen kann, sollte schließlich untersucht wer-den, ob das Prinzip der Hemmung nukleärer ERK-Effekte auch die Proliferation von Krebszellen beeinflussen kann. Es stellte sich heraus, dass die Peptid-vermittelte Hemmung der ERK-Dimerisierung auch die Proliferation von Kolonkarzinomzelllinien mit unterschiedlichen Mutations-stadien der Raf/MEK/ERK-Kaskade reduziert. In der vorliegenden Arbeit konnte somit die Intervention mit der ERK-Dimerisierung als Target der ERKThr188-Autophosphorylierung als translationale Strategie zur Reduktion nukleärer ERK-Effekte herausgearbeitet werden. Dies bietet die Möglichkeit ERK-vermittelte pathologische kardialer Hy-pertrophie und ERK-vermittelte Tumor-Proliferation zu behandeln, ohne kardiotoxische Nebenwir-kungen zu verursachen. / The mitogen-activated protein kinases ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases 1 and 2) link external stimuli with the intracellular response as the effector kinases of the Raf/MEK/ERK cascade. Therefore, they represent important key molecules in the context of cellular signal transduction. Numerous studies proof the involvement of ERK1/2 in the development of pathological cardiac hypertrophy. However, ERK1/2 have also cardio-protective, anti-apoptotic properties in the heart. In this work, it could be shown that inhibition of catalytical ERK-activity using the MEK-inhibitor PD98059 leads to a reduced hypertrophic response in cardiomyocytes upon phenylephrine-stimulation. At the same time, treatment of cardiomyocytes with PD98059 increased apoptosis in those cells. Therefore, inhibition of total ERK-activity is not feasible for the treatment of pathologi-cal cardiac hypertrophy. Previous studies identified the autophosphorylation at threonine 188 (mouse ERK2) as a trigger for ERK-mediated hypertrophic growth. By increasing nuclear localization of ERK, this autophosphorylation leads to increased activation of nuclear ERK-targets and concomi-tant hypertrophy. Interference with ERKThr188-phosphorylation could already successfully reduce pathological hypertrophy in vivo and in vitro without influencing physiological heart growth or the cytosolic anti-apoptotic ERK-effects. One initial trigger of ERKThr188-phosphorylation is the dimeriza-tion of activated ERK. In this work, inhibition of ERK-dimerization and its consequences regarding pathological cardiac hypertrophy was tested. ERK-dimerization was endogenously inhibited using a self-generated peptide. In line with data obtained from a dimerization-deficient ERK2 mutant (ERK2-Δ4) the peptide was able to effectively reduce pathological cardiac hypertrophy in vivo and in vitro. Moreover, the peptide even reduced apoptotic cell death induced by ligation of the aorta. Mechanistically, the peptide reduces activation of nuclear ERK targets by inhibiting nuclear trans-location of ERK. Since a dysregulation of the Raf/MEK/ERK cascade also promotes the development of tumors, the impact of inhibition of nuclear ERK effects on cancer cell proliferation was investi-gated. Interestingly, prevention of ERK-dimerization using the peptide efficiently reduced prolifera-tion of colon cancer cell lines with different mutational levels. In this work, intervention of ERK-dimerization to target ERKThr188-autophosphorylation could suc-cessfully be proven as a translational strategy to circumvent nuclear ERK effects. This offers the possibility for the treatment of ERK-mediated pathological cardiac hypertrophy and ERK-mediated tumor proliferation without inducing cardiotoxic side-effects.

Knochenmarksstammzellen werden als mögliche Zellquelle zur Verbesserung kardialer Funktion nach Myokardinfarkt angesehen. Um die Rolle und das Potential verschiedener Knochenmarkszellpopulationen auf das linksventrikuläre Remodeling nach Myokardinfarkt weiter zu untersuchen, wurde auf das Maus-Infarkt-Modell zurückgegriffen. Nach experimentellem Myokardinfarkt durch Ligation der vorderen absteigenden Koronararterie erfolgte entweder die intramyokardiale Injektion von unfraktionierten Knochenmarkszellen oder einer mit Vorläufer- (Lin-) bzw. reifen (Lin+) Zellen angereicherten Knochenmarkszellsubpopulation. Obgleich mit keiner Zellpopulation entscheidend Einfluss auf Überlebensrate und Infarktgröße genommen werden konnte, zeigte sich eine signifikante Verbesserung des linksventrikulären Remodelings nach Injektion von unfraktionierten Knochenmarkszellen, welche hingegen durch Behandlung mit Lin- oder Lin+ Zellen ausblieb. Gemessen wurde dies einerseits auf molekularer Ebene, wo der linksventrikuläre Hypertrophiemarker, bestehend aus betaMHC/alphaMHC-Ratio signifikant gesenkt werden konnte, andererseits auf echokardiographischer Ebene, wo sich eine signifikante Verminderung linksventrikulärer Dilatation nachweisen ließ. Da sich die untersuchten Zellpopulationen hinsichtlich in vitro gemessener Zytokinexpressionslevel teilweise erheblich unterschieden, müssen die beobachteten Resultate im Zusammenhang mit stattgefundener parakrine Zytokinsekretion gesehen werden. / Bone marrow stem cells are considered as a promising cell source to improve cardiac function after myocardial infarction. To further investigate the role and potential of different bone marrow cell preparations on left ventricular remodelling we employed the mouse-infarct-model. After induction of myocardial infarction through ligation of the left descending coronary artery, mice were treated either with intramyocardial injection of unfractionated bone marrow cells, progenitor-enriched (Lin-) or mature (Lin+) cells.Although none of the cell populations showed a pronounced influence on survival rate or infarct size, there was a significant amelioration of left ventricular remodelling after injection of unfractionated bone marrow cells, which could not be accomplished by treatment with Lin- or Lin+ cells. This effect was measured both on molecular basis, where the left ventricular hypertrophie marker, consisting of the betaMHC/alphaMHC-ratio was significantly decreased, and on echocardiographic basis, where a significant reduction of left ventricular dilatation was demonstrated. Considering the substantial differences in in-vitro measured cytokine-levels observed in the investigated cell populations, the results shown could potentially be attributed to paracrine secretion of cytokines.

Interleukin-6 (IL-6), oncostatin M (OSM), leukaemia inhibitory factor (LIF) and cardiotrophin-1 (CT-1) are members of the IL-6-type cytokine family that is characterised by sharing the common receptor subunit gp130. While the involvement of these polypeptides in cell differentiation, cell survival, proliferation, apoptosis, inflammation, haematopoiesis, immune response and acute phase reaction has already been demonstrated, the description of their role in development and progression of cardiac hypertrophy is still rather limited. A model has been postulated that declares the transient expression of IL-6-type cytokines as protective, while a continuous cardiac secretion of these proteins seems to be rather harmful for the heart. Within the first part of the study (results 4.1, 4.2 and 4.3) it was shown that OSM induces hypertrophy of primary neonatal rat cardiomyocytes (NRCM), just as its related cytokines LIF, CT-1 and hIL-6/hsIL-6R (hsIL-6R, human soluble IL-6 receptor). Regarding the hypertrophic potentials the LIFR/gp130 utilising cytokines (hLIF, hOSM and hCT-1) are stronger inducers than the OSMR/gp130 utilising mOSM. Human IL-6/hsIL-6R which signals via a gp130 homodimer has the weakest hypertrophic effect. The thorough analysis of typical signalling pathways initiated by IL-6-type cytokines revealed that STAT3 phosphorylation at Y705 seems to be the most important hypertrophy promoting pathway. In addition and in contrast to published work, we clearly demonstrate that classical IL-6 signalling (upon pure IL-6 treatment) has no hypertrophic effect on cardiomyocytes, because they lack sufficient amounts of the membrane-bound IL-6R. This is also true for neonatal rat cardiac fibroblasts (NRCFB). Since these cells can also influence cardiac hypertrophy, signalling pathways and target genes were additionally examined in NRCFB in response to OSM, LIF and IL-6/sIL-6R. One of the key findings of this thesis is the selective change in expression of cytokines and receptors of the IL-6 family in both cell types upon IL-6-type cytokine stimulation. A striking difference between NRCM and NRCFB is the fact that the target gene induction in NRCM is of similar duration upon mOSM and hIL-6/hsIL-6R treatment, while hIL-6/hsIL-6R is capable of promoting the induction of OSMR and IL-6 significantly longer in NRCFB. By searching for transcription factors or intermediate cytokines which could be responsible for this difference, a strong correlation between increased Il6 transcription and amount of mRNA levels for C/EBPβ and C/EBPδ was observed in response to IL-6/sIL-6R stimulation. Interestingly, mOSM also mediates the induction of C/EBPβ and δ, but the initiation is significantly less efficient than in response to IL-6/sIL-6R. Therefore, we assume that mOSM stimulation fails to reach threshold values required for a prolonged IL-6 secretion. Since we additionally observe a slight IL-6R mRNA upregulation in NRCFB, we assume that the combination of IL-6, LIF, C/EBPβ, C/EBPδ and IL-6R expression might be responsible for the observed different kinetics with which IL-6 and OSM stimulate NRCFB. In addition to the aforementioned proteins, members of the renin-angiotensin system seem to support the IL-6-type cytokine mediated hypertrophy. Since it has already been shown that angiotensin II vice versa induces IL-6 expression in NRCM and NRCFB, this enhanced expression of AT1α and ACE could be of crucial interest for the hypertrophy supporting phenotype. The second part of the presented work dealt with the characterisation of the receptor complexes of rat OSM. The central question of this analysis was, whether rOSM, just like mOSM, only binds the type II (OSMR/gp130) receptor complex or is able to utilise the type II and type I (LIFR/gp130) receptor complex. Using different experimental approaches (knock-down of the OSMR expression by RNA interference, blocking of the LIFR by LIF-05, an antagonistic LIF variant, and generation of stably transfected Ba/F3 cells expressing the newly cloned rat OSMR/gp130 or LIFR/gp130 receptor complex) we can clearly show that rat OSM surprisingly utilises both, the type I and type II receptor complex. Therefore it closely mimics the human situation. Furthermore, rOSM displays cross-species activities and stimulates cells of human as well as murine origin. Its signaling capacities closely mimic those of human OSM in cell types of different origin in the way that strong activation of the JAK/STAT, the MAP kinase as well as the PI3K/Akt pathways can be observed. Therefore, the results obtained in the last section of this thesis clearly suggest that rat disease models would allow evaluation of the relevance of OSM for human biology much better than murine models. / Interleukin-6 (IL-6), Oncostatin M (OSM), Leukämie inhibierender Faktor (LIF) und Cardiotrophin-1 (CT-1) sind Mitglieder der IL-6-Typ Zytokin-Familie, welche durch die gemeinsame Nutzung der Rezeptoruntereinheit gp130 charakterisiert ist. Während eine Beteiligung dieser Proteine bei Zelldifferenzierung, Zellüberleben, Proliferation, Apoptose, Entzündung, Hämatopoese, Immunantwort und Akut-Phase-Reaktion bereits gezeigt wurde, ist die Beschreibung ihrer Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten der kardialen Hypertrophie deutlich limitierter. Es wurde bereits ein Modell postuliert, nach dem die kurzzeitige Expression dieser Zytokine schützend wirkt, während eine andauernde kardiale Sekretion eher schädlich für das Herz zu sein scheint. Im ersten Teil der Arbeit (Ergebnisse 4.1, 4.2 und 4.3) konnte gezeigt werden, dass OSM wie auch seine verwandten Zytokine LIF, CT-1 und hIL-6/hsIL-6R (hsIL-6R, humaner löslicher IL-6 Rezeptor) Hypertrophie-induzierend auf primäre neonatale Ratten-Kardiomyozyten (NRCM) wirkt. Hinsichtlich ihres hypertrophen Potentials sind die Zytokine, welche über LIFR/gp130 signalisieren (hLIF, hOSM und hCT-1), die stärkeren Induktoren im Vergleich zu mOSM, welches den OSMR/gp130 Rezeptorkomplex bindet. Die Stimulation mit humanem IL-6/hsIL-6R hatte hingegen die schwächste hypertrophe Wirkung. Unsere genaue Analyse der typischen IL-6-Typ Zytokin vermittelten Signalwege enthüllte die Phosphorylierung von STAT3 an Y705 als offenkundig wichtigsten hypertrophen Weg. Zusätzlich dazu konnten wir auch zeigen, dass klassisches IL-6 Signalling (ohne sIL-6R) keinen hypertrophen Einfluss auf NRCM hat, da diesen Zellen ausreichende Mengen des membranständigen IL-6R fehlen. Diese Beobachtung steht in klarem Kontrast zu bereits publizierten Arbeiten. In den ebenfalls untersuchten neonatalen Ratten-Kardiofibroblasten (NRCFB) verhält es sich, was den IL-6R angeht, genauso wie in NRCM. Da auch diese Zellen eine kardiale Hypertrophie mit beeinflussen können, wurden in ihnen die gleichen Signalwege und Zielgene nach Stimulation mit OSM, LIF und IL-6/sIL-6R untersucht. Die selektive Expressionsregulation von Zytokinen und Rezeptoren der IL-6-Familie in beiden Zelltypen nach IL-6-Typ Zytokin Stimulation ist hierbei einer unserer wichtigsten Befunde. Ein gravierender Unterschied zwischen NRCM und NRCFB besteht darin, dass die mOSM und hIL-6/hsIL-6R vermittelte Geninduktion in NRCM von vergleichbarer Dauer ist, wohingegen sie sich in NRCFB unterscheidet. Bei der Suche nach Transkriptionsfaktoren oder intermediären Zytokinen, welche für diesen Unterschied verantwortlich sein könnten, beobachteten wir nach IL-6/sIL-6R Stimulation eine deutliche Korrelation zwischen der Il6-Transkription und den mRNA Mengen von C/EBPβ und C/EBPδ. Auch OSM ist in der Lage beide Transkriptionsfaktoren zu induzieren, jedoch viel ineffizienter als IL-6/sIL-6R. Wir vermuten, dass mOSM einen bestimmten Schwellenwert, der für die verlängerte IL-6 Sekretion benötigt wird, nicht erreicht. Da wir zusätzlich noch eine schwache Zunahme der IL-6R mRNA in NRCFB beobachten konnten, gehen wir davon aus, dass die Expression von IL-6, LIF, C/EBPβ, C/EBPδ und IL-6R für die unterschiedlichen Kinetiken, mit denen IL-6 und OSM NRCFB stimulieren, verantwortlich sein dürfte. Es scheinen auch Mitglieder des Renin-Angiotensin-Systems die IL-6-Typ Zytokin vermittelte Hypertrophie zu unterstützen. Da schon gezeigt wurde, dass Angiotensin II reziprok die IL-6 Expression induziert, könnte diese verstärkte Synthese von AT1α und ACE von größter Bedeutung für den Hypertrophie-unterstützenden Phänotyp sein. Der zweite Teil der Arbeit (4.4) beschäftigte sich mit der Charakterisierung der Rezeptorkomplexe des Ratten-OSM. Die zentrale Frage hierbei bestand darin, ob rOSM wie mOSM nur den Typ II (OSMR/gp130) Rezeptorkomplex bindet, oder wie das hOSM sowohl den Typ II als auch den Typ I (LIFR/gp130) Rezeptorkomplex benutzen kann. Mit Hilfe unterschiedlicher experimenteller Strategien (knock-down der OSMR Expression durch RNA-Interferenz, LIFR-Blockade durch antagonistisches LIF-05, und die Generierung von stabil transfizierten Ba/F3-Zellen, welche die hierzu klonierten OSMR/gp130 oder LIFR/gp130 Rezeptorkomplexe der Ratte exprimieren) konnten wir eindeutig zeigen, dass Ratten-OSM überraschenderweise beide Rezeptorkomplexe benutzt. In dieser Hinsicht verhält sich es sich wie das humane Homolog. Des Weiteren besitzt Ratten-OSM Kreuz-Spezies-Aktivität und stimuliert humane und murine Zellen. Das Signal-Potential von rOSM ist dem von humanem OSM auf Zellen unterschiedlichen Ursprungs sehr ähnlich. Das Zytokin ist befähigt JAK/STAT, MAP Kinase und PI3K/Akt Signalwege potent zu aktivieren. Deshalb deuten die Daten des zweiten Teils dieser Arbeit darauf hin, dass Krankheitsmodelle in Ratten die Evaluierung der Relevanz des OSM für die humane Biologie deutlich besser widerspiegeln würden als murine Modelle.

Zugl.: Giessen, Univ., Diss., 2008

Kationenkanäle der Canonical Transient Receptor (TRPC)-Familie spielen eine wichtige Rolle in der pathologischen Herzhypertrophie. Neben anderen Isoformen besitzt TRPC4 die Potenz, den strukturellen und funktionellen Umbau des Herzens im Rahmen der pathologischen Hypertrophie über Ca2+-Transienten zu bestärken. TRPC4-Kanäle sind nicht-selektive Kationenkanäle, die für Na+ und Ca2+ durchlässig sind. Sie setzen sich in der Plasmamembran zu Homo- oder Heterotetrameren zusammen. Die TRPC4-Kanalaktivität wird durch die Stimulation von Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) reguliert und führt zu einem Ca2+-Einstrom, der für die Aktivierung von Calcineurin und des nuclear factor of activated T-cells (NFAT) notwendig ist. Eine weitere Aktivierungsform lässt sich über die Entleerung von intrazellulären Ca2+-Speichern (SOCE) aus dem Sarkoplasmatischen Retikulum (SR) nachweisen. Die funktionelle Wirkung des TRPC4 ist von der Expression der beiden Splice-Varianten TRPC4α und TRPC4β abhängig. Um diese funktionelle Abhängigkeit der Splice-Variante C4β genauer zu charakterisieren, wurden in der vorliegenden Studie zytosolische Ca2+-Signale und deren Aktivierungsmechanismen analysiert. Für die Untersuchungen wurden neonatale Rattenkardiomyozyten (NRC) verwendet, die mit adenoviralen Vektoren infiziert wurden und TRPC4beta (Ad-TRPC4β), TRPC4alpha (Ad-TRPC4α) und beta-Galaktosidase (Ad-ßgal) als Kontrolle exprimierten. Es erfolgte eine Auswertung der Ca2+-Transienten, in der gezeigt werden konnte, dass TRPC4β den Ca2+-Einstrom in schlagenden Kardiomyozyten beeinflusst. Dies machte sich in einer erhöhten Ca2+-Amplitude unter basalen Bedingungen bemerkbar. Ebenfalls konnte deutlich gemacht werden, dass eine Ca2+-Entleerung des SR TRPC4β als sogenannten SOC (speicher-regulierten Kanal, store-operated channel) aktiviert. Außerdem reagierten TRPC4β-infizierte NRCs mit einem gesteigerten Ca2+-Maximalspitzenwert (peak) unter Stimulation mit dem GPCR-Agonisten Angiotensin II. Die Amplitude der Ca2+-Transienten bei Überexpression von Ad-TRPC4β war im Vergleich zur Ad-ßgal-Kontrollgruppe deutlich gesteigert. Darüber hinaus war der Abfall der Ca2+-Transienten der TRPC4β-exprimierenden Zellen beschleunigt. Dies lässt einen kompensatorischen Mechanismus vermuten, mit dem Ziel, einer Ca2+-Überladung der Zelle durch den TRPC4β-induzierten Ca2+-Einstrom entgegenzuwirken. In zusätzlichen Experimenten zeigte sich TRPC4β ebenfalls deutlich sensitiver gegenüber der Angiotensin II-Stimulation als TRPC4α. Weiterführende Untersuchungen ließen erkennen, dass TRPC4β, im Gegensatz zu anderen TRPC-Isoformen, keinen pro-hypertrophen, sondern vielmehr einen pro-apoptotischen Einfluss auf Kardiomyozyten ausübt. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie, dass eine erhöhte Aktivität der Splice-Variante TRPC4β mit kritischen Veränderungen zytosolischer Ca2+-Signale verbunden ist und somit ein entscheidender Faktor für die Entstehung und Progression kardialer Pathologien sein könnte. / The Transient Receptor Potential Channel Subunit 4 (TRPC4) has been considered as a crucial Ca2+ component in cardiomyocytes promoting structural and functional remodeling in the course of pathological cardiac hypertrophy. Functional properties of TRPC4 are also based on the expression of the TRPC4 splice variants TRPC4α and TRPC4β. Aim of the present study was to analyze cytosolic Ca2+ signals, signaling, hypertrophy and vitality of cardiomyocytes in dependence on the expression level of either TRPC4α or TRPC4β.