Tesis para optar al Grado de Magíster en: Enología y Vitivinicultura / La transformación del mosto de uva en vino, es un complejo proceso microbiológico realizado principalmente por levaduras del género Saccharomyces, responsables de la fermentación alcohólica. Actualmente, las co-inoculaciones con levaduras comerciales no Saccharomyces (Torulaspora delbrueckii) y Saccharomyces cerevisiae, son una alternativa para la incorporación de enzimas β-glucosidasas, pectinasas y proteasas al mosto. El mosto alberga una diversa microbiota inicial; esta heterogeneidad microbiológica dificulta el control del proceso fermentativo. Por ello, se desarrolló un método de monitoreo de levaduras vínicas en fermentaciones de co-inoculación, aplicando métodos de taxonomía molecular. Se analizaron las regiones ribosomales, sobre las cuales se diseñó una estrategia “in silico”, mediante perfiles de restricción (RFLP), empleando endonucleasas específicas; lográndose una fácil y fidedigna diferenciación de los microorganismos involucrados. De manera experimental se trabajó con un mosto del cultivar Syrah; que se separó en dos cubas, una fue inoculada únicamente con Saccharomyces cerevisiae y otra fue co-inoculada con Torulaspora delbrueckii y Saccharomyces cerevisiae. Se examinaron distintas etapas del proceso de fermentación, logrando en todos los casos extraer ADN de forma directa desde las muestras de vino en una aproximación independiente de cultivo. El ADN extraído fue sujeto a un proceso de PCR para amplificar la región ITS 5.8S. Estos amplicones se sometieron a digestión con las enzimas AluI, ApaI, HaeIII, SphI, lo que permitió definir e identificar la presencia de las levaduras involucradas en cada fase de la fermentación alcohólica. Todo esto permitió demostrar que la variación genética de las regiones ribosomales, permite la diferenciación a través de métodos moleculares, de las levaduras vínicas: Saccharomyces cerevisiae y Torulaspora delbrueckii, comúnmente usadas en co-inoculación. / Transformation of grape must into wine is a complex microbiological process done mainly by Saccharomyces yeasts, responsible for the alcoholic fermentation. Currently, co-inoculated with Saccharomyces commercial yeasts (Torulaspora delbrueckii) and Saccharomyces cerevisiae, are an alternative to the incorporation of β-glucosidase enzymes, pectinase and protease to the must. The must has a diverse microbiota initial, this heterogeneity hinders this fermentation process control. Therefore, we developed a method of monitoring fermentations wine yeasts in co-inoculation, using methods of molecular taxonomy. Ribosomal regions were analyzed, over which strategy was designed “in silico” by restriction profiles (RFLP) using specific endonucleases; achieving an easy and accurate differentiation of the microorganisms involved. Experimentally we worked with Syrah grape cultivar, which split into two tanks, one was inoculated with Saccharomyces cerevisiae and other was co-inoculated with Torulaspora delbrueckii and Saccharomyces cerevisiae. We examined various stages of the fermentation process, obtaining in all cases extract DNA directly from the wine samples in a culture-independent approach. The extracted DNA was subjected to a process of PCR to amplify the region ITS 5.8 S. These amplicons were digested with the enzyme AluI, ApaI, HaeIII, SphI, allowing define and identify the presence of yeast involved in each stage of the fermentation. All this helped to show that the genetic variation of ribosomal regions, allows differentiation through molecular methods of wine yeasts: Saccharomyces cerevisiae and Torulaspora delbrueckii, commonly used in co-inoculation.

En el presente estudio, se llevó a cabo la hidrólisis enzimática de carbohidratos, fibras (celulosa) y de proteínas contenidas en la maca, un recurso natural de uso muy difundido a nivel mundial, con el fin de desdoblar los componentes y nutrientes de la maca a unidades más simples y asimilables por los seres humanos. Se utilizaron las siguientes enzimas comerciales: celulasa (Celluclast® 1,5 L), amilasa (Fungamyl® BG), multienzima (Viscozyme® L) y peptidasa (Neutrase®), las mismas que fueron proporcionadas por Novo Nordisk. Se diseño un ensayo preliminar utilizando doce condiciones de ensayo o tratamiento del polvo de maca con una enzima o combinaciones de estas. Cuando se empleó dos o tres enzimas, en algunos casos estas se aplicaron en forma secuencial y en otros simultáneamente. Las condiciones de reacción se estandarizaron para todos los sistemas preliminares. Luego se seleccionaron cinco por presentar mejores condiciones de reacción y mayor cantidad de azúcares reductores y proteínas. Los resultados analíticos en los cinco sistemas ensayados nos muestran que la concentración de azúcares reductores, producto del desdoblamiento de los carbohidratos alcanza concentraciones entre 77 a 90 g %, en los sub productos de la hidrólisis. De otro lado la concentración en proteínas alcanza valores entre 20 a 33 g %; estas por acción de la proteasa, nos han permitido identificar hasta 13 aminoácidos por cromatografía en capa fina bidimensional. Así mismo se demostró la presencia de dos alcaloides en el polvo de maca, los cuales también fueron identificados en los sub productos de las hidrólisis, demostrando que estos procesos no afectan la estructura de estos metabolitos. Palabras clave: Maca en polvo, hidrólisis enzimática, enzimas industriales, componentes asimilables. / In the present study was carried out the enzymatic hydrolysis of carbohydrates, fibers (cellulose) and of proteins contained in Maca, natural resource very diffused at world level, with the purpose of unfolding the components and nutritious of Maca to simpler and more assimilable units for the human beings. The following commercial enzymes were used: cellulase (Celluclast® 1.5 L), amylase (Fungamyl® BG), multienzyme (Viscozyme® L) and peptidase (Neutrase ®), the same ones that were provided by Novo Nordisk. It was designed a preliminary test using twelve evaluation or treatment of Maca´s powder with an enzyme or combinations of these. When it was used two or three enzymes, in some cases these they were applied in sequential form and in other they were applied simultaneously. The reaction conditions were standardized for all the preliminary systems. Then, five were selected to present better reaction conditions and bigger quantity of sugars reducers and proteins. The analytic results in the five tested systems show us that the concentration of sugars reducers, product of the unfolding of carbohydrates reaches concentrations among 77 to 90 g %, in the sub products of hydrolysis. However the protein concentration reaches values among 20 to 33 g % for action of the protease, there being identified 13 amino acids by chromatography in two-dimensional fine layer. Likewise the presence of two alkaloids was demonstrated in Maca´s powder, which were identified also in the sub products of hydrolyses, demonstrating that these hydrolysis processes don't affect the structure of these metabolites. Key words: Maca´s powder, enzymatic hydrolysis, industrial enzymes, assimilable components.

El documento digital no refiere un asesor / Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Analiza la influencia que tienen los tipos de degradación previa aplicados a la cáscara de Musa paradisiaca L. (banano) madura, en la producción de jarabe glucosado mediante hidrólisis enzimática, en función del tiempo, y de los parámetros físico químicos del proceso, orientado a la disminución de las emisiones de CO2 por estos residuos lignocelulósicos con un criterio de sostenibilidad ambiental. / Tesis

En el presente estudio, se llevó a cabo la hidrólisis enzimática de carbohidratos, fibras (celulosa) y de proteínas contenidas en la maca, un recurso natural de uso muy difundido a nivel mundial, con el fin de desdoblar los componentes y nutrientes de la maca a unidades más simples y asimilables por los seres humanos. Se utilizaron las siguientes enzimas comerciales: celulasa (Celluclast® 1,5 L), amilasa (Fungamyl® BG), multienzima (Viscozyme® L) y peptidasa (Neutrase®), las mismas que fueron proporcionadas por Novo Nordisk. Se diseño un ensayo preliminar utilizando doce condiciones de ensayo o tratamiento del polvo de maca con una enzima o combinaciones de estas. Cuando se empleó dos o tres enzimas, en algunos casos estas se aplicaron en forma secuencial y en otros simultáneamente. Las condiciones de reacción se estandarizaron para todos los sistemas preliminares. Luego se seleccionaron cinco por presentar mejores condiciones de reacción y mayor cantidad de azúcares reductores y proteínas. Los resultados analíticos en los cinco sistemas ensayados nos muestran que la concentración de azúcares reductores, producto del desdoblamiento de los carbohidratos alcanza concentraciones entre 77 a 90 g %, en los sub productos de la hidrólisis. De otro lado la concentración en proteínas alcanza valores entre 20 a 33 g %; estas por acción de la proteasa, nos han permitido identificar hasta 13 aminoácidos por cromatografía en capa fina bidimensional. Así mismo se demostró la presencia de dos alcaloides en el polvo de maca, los cuales también fueron identificados en los sub productos de las hidrólisis, demostrando que estos procesos no afectan la estructura de estos metabolitos. Palabras clave: Maca en polvo, hidrólisis enzimática, enzimas industriales, componentes asimilables. / In the present study was carried out the enzymatic hydrolysis of carbohydrates, fibers (cellulose) and of proteins contained in Maca, natural resource very diffused at world level, with the purpose of unfolding the components and nutritious of Maca to simpler and more assimilable units for the human beings. The following commercial enzymes were used: cellulase (Celluclast® 1.5 L), amylase (Fungamyl® BG), multienzyme (Viscozyme® L) and peptidase (Neutrase ®), the same ones that were provided by Novo Nordisk. It was designed a preliminary test using twelve evaluation or treatment of Maca´s powder with an enzyme or combinations of these. When it was used two or three enzymes, in some cases these they were applied in sequential form and in other they were applied simultaneously. The reaction conditions were standardized for all the preliminary systems. Then, five were selected to present better reaction conditions and bigger quantity of sugars reducers and proteins. The analytic results in the five tested systems show us that the concentration of sugars reducers, product of the unfolding of carbohydrates reaches concentrations among 77 to 90 g %, in the sub products of hydrolysis. However the protein concentration reaches values among 20 to 33 g % for action of the protease, there being identified 13 amino acids by chromatography in two-dimensional fine layer. Likewise the presence of two alkaloids was demonstrated in Maca´s powder, which were identified also in the sub products of hydrolyses, demonstrating that these hydrolysis processes don't affect the structure of these metabolites. Key words: Maca´s powder, enzymatic hydrolysis, industrial enzymes, assimilable components.

La hidrólisis de celulosa a azúcares fermentables es una de las etapas clave que deben ser optimizadas para disminuir el costo de producción de bioetanol producido a partir de lignocelulosa, materia prima abundantemente disponible en Chile en desechos agrícolas y forestales. La hidrólisis de celulosa es catalizada por enzimas celulasas, pertenecientes al grupo de las glicosil hidrolasas. Este Trabajo de Memoria de Título tiene como objetivo la identificación y clonación de glicosil hidrolasas, con énfasis en enzimas potencialmente útiles en procesos de producción de bioetanol. La estrategia general de trabajo consistió en la identificación y selección de cepas capaces de degradar celulosa cristalina, a las cuales se dirigió un método de obtención de fragmentos de DNA codificantes de glicosil hidrolasas, enfocado a la actividad exoglucanasa. Un análisis in sílico de la secuencia de los fragmentos de DNA obtenidos indicó que se obtuvieron fragmentos de genes con actividades putativas β-1,3(4)-glucanasa y α-glucosidasa provenientes de cepas de Lentinula edodes y Peniophora gigantea, respectivamente. Estos resultados poseen altos niveles de confianza (con e-values del orden de 10-9 y 10-30, respectivamente). El fragmento correspondiente a la β-1,3(4)-glucanasa contiene el dominio catalítico conservado característico de este tipo de enzimas. Se estima que los fragmentos encontrados representan un 38% de una β-1,3(4)-glucanasa y un 12% de una α-glucosidasa. El método también produjo la obtención de fragmentos de DNA que codificarían enzimas con otras actividades no relacionadas con glicosil hidrolasas, específicamente una transcriptasa reversa y un transportador de urea. Las enzimas β-1,3(4)-glucanasas y α-glucosidasas son potencialmente aplicables en la etapa de pretratamiento de lignocelulosa en la producción de bioetanol de segunda generación y en la etapa de degradación de almidón en la producción de bioetanol de primera generación, respectivamente, entre otras aplicaciones industriales de menor interés para este trabajo. En conclusión, se logró clonar fragmentos de dos glicosil hidrolasas potencialmente aplicables en un proceso de producción de bioetanol. La estrategia utilizada deberá ser perfeccionada para hacerla más específica, logrando el diseño de partidores degenerados más específicos o bien considerando una estrategia global alternativa, tal como utilizar una genoteca de cDNA como templado del método en lugar de DNA genómico.

Tesis por compendio / [ES] Los oligosacáridos de la leche humana (OLHs) y la parte glicana de los glicoconjugados son hidrolizados por las glicosil hidrolasas (GHs), las cuales son expresadas por la microbiota intestinal de niños lactantes promoviendo el establecimiento de una microbiota intestinal con beneficios para su salud. El objetivo de esta Tesis Doctoral consistió en la caracterización funcional de GHs de la microbiota intestinal de niños lactantes capaces de metabolizar OLHs y glicoconjugados, y el estudio de su relevancia biológica y su potencial biotecnológico. Se aislaron cepas bacterianas a partir de heces de niños lactantes.Solo las cepas del género Bifidobacterium metabolizaron alguno de los OLHs testados. Bifidobacterium infantis Y538 consumió eficientemente todos los OLHs testados, mientras que las dos cepas de Bifidobacterium dentium Y510 y Y521 solo metabolizaron lacto-N-tetraosa (LNT) y lacto-N-neotetraosa (LNnT). Se caracterizaron dos ß-galactosidasas de B. dentium Y510; Bdg42A mostró la mayor actividad en LNT, hidrolizándolo en galactosa y lacto-N-triosa (LNTII), mientras que Bdg2A mostró actividad contra lactosa, 6'-galactopiranósil-N-acetilglucosamina, N-acetillactosamina y LNnT. También se aislaron cepas bacterianas con actividad glicosidasa extracelular de las heces de lactantes. B. infantis E17 y E18, y Enterococcus faecalis E8 y E41 exhibieron actividad de endo-ß-N-acetilglucosaminidasa, liberando N-glicanos de glicoproteínas. La endo-ß-N-acetilglucosaminidasa EndoE de E. faecalis E8 deglicosiló eficientemente la proteína S1 del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2). Tanto la EndoE silvestre como un mutante catalíticamente inactive mostraron actividad lectina frente a la proteína S1 y actividad neutralizante frente a la infección de un virus pseudotipado que presenta la proteína S de SARS-CoV-2 expresada. También se identificaron GHs putativas a través del análisis metagenómico de las heces de niños lactantes, pertenecientes a los géneros Bifidobacterium, Bacteroides, Ruminococcus, Actinomyces, Klebsiella, Phocaeicola y Streptococcus. Se seleccionaron diez ¿-L-fucosidasas GH29 (Fuc18, Fuc19A, Fuc30, Fuc35A, Fuc35B, Fuc39, Fuc193, Fuc1584, Fuc2358 y Fuc5372). Las ¿-L-fucosidasas Fuc18, Fuc19A, Fuc35B, Fuc39 y Fuc1584 mostraron actividad hidrolítica frente a enlaces de fucosa ¿-1,3/4 y Fuc35A, Fuc193 y Fuc2358 mostraron actividad enlaces de fucosa ¿-1,2/3/4/6. Fuc30 mostró actividad sobre la enlaces de fucosa ¿-1,6 mientras que Fuc5372 mostró preferencia por los enlaces ¿-1,2. Fuc2358 mostró actividad frente a glicoconjugados con lacto-N-fucopentaosa II, lacto-N-fucopentaosa III y contra la mucina. Fuc18, Fuc19A y Fuc39 eliminaron fucosa de neoglicoproteínas y de la glicoproteína ¿-1 ácida. Las ¿-L-fucosidasas aisladas fueron evaluadas por su capacidad para sintetizar fucosil-oligosacáridos (FUS) a través de reacciones de transfucosilación. Fuc2358 produjo rendimientos del 35% de 2'-fucosillactosa (2'FL) y también 3'-fucosillactosa (3'FL) y 1-fucosillactosa (1FL). Fuc5372 sintetizó 2'FL, 3'FL y 1FL, con una proporción más alta de 3'FL. Se llevó a cabo mutagénesis dirigida para aumentar los rendimientos de transfucosilación. Los mutantes Fuc2358-H132F, Fuc2358-F184H, Fuc2358-R301Q, Fuc2358-K286R y Fuc5372-R230K mostraron una mayor relación entre la 2'FL producida y el pNP-Fuc hidrolizado que sus respectivas enzimas silvestres. Además, se observó que los residuos F184 de Fuc2358 y W151 de Fuc5378 afectan a la regioselectividad de la transfucosilación, la fenilalanina aumentando la selectividad por los enlaces ¿-1,2 y el triptófano aumentando la selectividad por los enlaces ¿-1,3. Los resultados presentados muestran la diversidad de GHs presentes en la microbiota intestinal de niños lactantes y expanden el conocimiento sobre su especificidad, contribuyendo al conocimiento del posible papel de las GHs en la colonización bacteriana del tracto gastrointestinal y, además, muestra su potencial biotecnológico / [CA] Els oligosacàrids de la llet humana (OLHs) i la part glicana de glicoconjugats són hidrolitzats per les glicosil hidrolases (GHs), les quals són expressades per la microbiota intestinal de xiquets lactants, promovent l'establiment d'una microbiota intestinal amb beneficis per a la seua salut. L'objectiu d'aquesta Tesi Doctoral va ser la caracterització funcional de GHs de la microbiota intestinal de xiquets lactants capaços de metabolitzar OLHs i glicoconjugats i l'estudi de la seua rellevància biològica i el seu potencial biotecnològic. Es van aïllar soques bacterianes a partir de les femtes de xiquets lactants. Només els soques del gènere Bifidobacterium van metabolitzar algun dels OLHs testats. Bifidobacterium infantis Y538 va consumir eficientment tots els OLHs testats. Les dos soques de Bifidobacterium dentium Y510 i Y521 sol van metabolitzar lacto-N-tetraosa (LNT) i lacto-N-neotetraosa (LNnT).Es van caracteritzar dos ß-galactosidasas de B. dentium Y510; Bdg42A va exhibir la major activitat enfront de LNT, hidrolitzant-la en galactosa i lacto-N-triosa (LNTII), mentre que Bdg2A va mostrar activitat enfront de lactosa, 6'-galactopiranósil-N-acetilglucosamina, N-acetillactosamina i LNnT. També es van aïllar soques bacterianes amb activitat glicosidasa extracelul·lar. B. infantis E17 i E18, i Enterococcus faecalis E8 i E41 van exhibir activitat endo-ß-N-acetilglucosaminidasa, alliberant N-glicans de glicoproteïnes. La endo-ß-N-acetilglucosaminidasa EndoE de E. faecalis E8 va deglicosilar eficientment la proteïna S1 del coronavirus 2 del síndrome respiratori agut greu (SARS-CoV-2).Tant la EndoE salvatge com un mutant catalíticament inactiu van mostrar activitat lectina enfront de la proteïna S1 i activitat neutralitzador enfront de la infecció d'un virus pseudotipat que presenta la proteïna S de SARS-CoV-2 expressada. També es van identificar GHs putatives a través de l'anàlisi metagenómic de la femta de xiquets lactants, pertanyents als gèneres Bifidobacterium, Bacteroides, Ruminococcus, Actinomyces, Klebsiella, Phocaeicola i Streptococcus. Es van seleccionar deu ¿-L-fucosidasas GH29 (Fuc18, Fuc19A, Fuc30, Fuc35A, Fuc35B, Fuc39, Fuc193, Fuc1584, Fuc2358 i Fuc5372). Les ¿-L-fucosidasas Fuc18, Fuc19A, Fuc35B, Fuc39 i Fuc1584 van mostrar activitat hidrolítica enfront d'enllaços de fucosa ¿-1,3/4 i Fuc35A, Fuc193 i Fuc2358 van mostrar activitat enllaços de fucosa ¿-1,2/3/4/6. Fuc30 va mostrar activitat enfront d'enllaços de fucosa ¿-1,6 mentre que Fuc5372 va mostrar preferència pels enllaços ¿-1,2. Fuc2358 va mostrar activitat enfront de glicoconjugats amb lacto-N-fucopentaosa II, lacto-N-fucopentaosa III i contra la glicoproteïna de la mucina. Fuc18, Fuc19A i Fuc39 van eliminar fucosa de neoglicoproteïnes i de la glicoproteïna ¿-1 àcida. Les ¿-L-fucosidasas aïllades van ser avaluades per la seua capacitat per a sintetitzar fucosil-oligosacàrids (FUS) mediant reaccions de transfucosilació. Fuc2358 va produir rendiments del 35% de 2'-fucosillactosa (2'FL) i també 3'-fucosillactosa (3'FL) i 1-fucosillactosa (1FL). Fuc5372 va sintetitzar 2'FL, 3'FL i 1FL, amb una proporció més alta de 3'FL. Es va dur a terme mutagénesis dirigida per a augmentar els rendiments de transfucosilación. Els mutants Fuc2358-H132F, Fuc2358-F184H, Fuc2358-R301Q, Fuc2358-K286R i Fuc5372-R230K van mostrar una major relació entre la 2'FL produïda i el pNP-Fuc hidrolitzat que els seus respectius enzims salvatges.A més, els residus F184 de Fuc2358 i W151 de Fuc5378 afecten la regioselectivitat de la transfucosilación; la fenilalanina augmenta la selectivitat pels enllaços ¿-1,2 i el triptòfan augmenta la selectivitat pels enllaços ¿-1,3. Els resultats presentats mostren la diversitat de GHs presents en la microbiota intestinal de xiquets lactants i expandixen el coneixement sobre la seua especificitat, contribuint al coneixement del possible paper de les GHs en la colonització bacteriana del tracte gastrointestinal i, a més, mostra el seu potencial biotecnològic. / [EN] Human milk oligosaccharides (HMOs) and the glycan portion of glycoconjugates are hydrolyzed by glycoside hydrolases (GHs) that are expressed by the neonatal intestinal microbiota, promoting the establishment of an intestinal microbiota with health benefits for infants. The objective of this Doctoral Thesis consisted of the functional characterization of GHs from the intestinal microbiota of breastfed infants capable of metabolizing HMOs and glycoconjugates and the study of their biological relevance and their biotechnological potential. Bacterial strains were isolated from breastfed infant faeces, showing that only Bifidobacterium genus strains metabolized any of the HMOs tested. Bifidobacterium infantis Y538 efficiently consumed all tested HMOs, while the two strains isolated from Bifidobacterium dentium Y510 and Y521 only metabolized lacto-N-tetraose (LNT) and lacto-N-neotetraose (LNnT). Two ß-galactosidases from B. dentium Y510 were characterized; Bdg42A exhibited the highest activity on LNT, hydrolyzing it into galactose and lacto-N-triose (LNTII), while Bdg2A displayed activity against lactose, 6'-galactopyranosyl-N-acetylglucosamine, N-acetyllactosamine and LNnT. Bacterial strains with extracellular glycosidase activity were also isolated from breastfed infant faeces. B. infantis E17 and E18, and Enterococcus faecalis E8 and E41 exhibited endo-ß-N-acetylglucosaminidase activity, releasing N-glycans from glycoproteins. The endo-ß-N-acetylglucosaminidase EndoE from E. faecalis E8 efficiently deglycosylated the spike S1 protein of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Both the EndoE wild-type and a catalytically inactive mutant exhibited lectin activity towards the S1 protein and neutralizing activity against SARS-CoV-2 S pseudotyped virus infection. Putative GHs were also identified through metagenomic analysis of breastfed infant faeces, belonging to Bifidobacterium, Bacteroides, Ruminococcus, Actinomyces, Klebsiella, Phocaeicola, and Streptococcus genera. Ten ¿-L-fucosidases GH29 (Fuc18, Fuc19A, Fuc30, Fuc35A, Fuc35B, Fuc39, Fuc193, Fuc1584, Fuc2358, and Fuc5372) were selected. The ¿-L-fucosidases Fuc18, Fuc19A, Fuc35B, Fuc39, and Fuc1584 showed hydrolytic activity on ¿-1,3/4-linked fucose and Fuc35A, Fuc193 and Fuc2358 showed activity on ¿-1,2/3/4/6-linked fucose. Fuc30 displayed activity only on ¿-1,6-linked fucose, and Fuc5372 showed a preference for ¿-1,2-linked fucose. Fuc2358 displayed activity against glycoconjugates carrying lacto-N-fucopentaose II, lacto-N-fucopentaose III and against the mucin glycoprotein. Fuc18, Fuc19A, and Fuc39 removed fucose from neoglycoproteins and human ¿-1 acid glycoprotein. The isolated ¿-L-fucosidases were evaluated for their capacity to synthesize fucosyl-oligosaccharides (FUS) through transfucosylation reactions. Fuc2358 produced 35 % yields of 2'-fucosyllactose (2'FL) and also 3'-fucosyllactose (3'FL) and 1-fucosyllactose (1FL). Fuc5372 synthesized 2'FL, 3'FL and 1FL, with a higher proportion of 3'FL. Site-directed mutagenesis was conducted to increase the transglycosylation yields. Mutants Fuc2358-H132F, Fuc2358-F184H, Fuc2358-R301Q, Fuc2358-K286R and Fuc5372-R230K showed a higher ratio between 2'FL yields and hydrolyzed pNP-Fuc than their respective wild-type enzymes. The transfucosylation activity results also showed that the residues F184 of Fuc2358 and W151 of Fuc5378 affect transfucosylation regioselectivity, with phenylalanine increasing the selectivity for ¿-1,2 linkages and tryptophan for ¿-1,3 linkages. The results presented in this doctoral thesis illustrate the diversity of GHs in the intestinal microbiota of breastfed infants and have expanded our knowledge of their specificities, which could contribute to a better understanding of the possible role of GHs in the bacterial colonization of the infant gastrointestinal tract and presents significant biotechnological potential. / This work is part of the Grant PID2020-115403RB (C21 and C22) funded by the Spanish Ministry of Science and Innovation (MICIN)/Spanish State Research Agency (AEI)/10.13039/501100011033. The study was also supported by Valencian Government grant AICO/2021/033. EMM-G was supported by the Grant PRE2018-085768 funded by MICIN/AEI/10.13039/501100011033 and by “ESF Investing in your future”. / Moya Gonzálvez, EM. (2024). Isolation, Functional Characterization and Biotechnological Applications of Glycoside Hydrolases from the Intestinal Microbiota of Breastfed Infants [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/203171 / Compendio